巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及性质和功能基团研究

摘要

核糖核酸酶(Ribonuclease,Rnase)是一类广泛存在于动植物和微生物体内的核酸水解酶,通过裂解磷酸二酯键分解核糖核酸。该酶参与RNA代谢、细胞成熟、细胞凋亡、血管生成以及宿主防御RNA病毒等过程。其作为模型蛋白常被用于分子生物学研究,作为重要的分析酶应用于食品和药物工业,此外在商业上还被用于生产核苷酸和调味剂。其中来自微生物的Rnase有特殊的生物学功能,如具有抗病毒,抗真菌,抗恶性肿瘤细胞增生的活性。
　　 巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)属于芽孢杆菌(Bacillusspp.),在自然界中分布广泛,具有遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺简单等优点,多用于工业生产各种酶类如淀粉酶、青霉素酰胺酶和葡萄糖异构酶等。通过实验证明巨大芽孢杆菌能高效表达Rnase,且发酵成分简单,杂蛋白相比动植物材料更少,分离纯化简单,有效降低目的蛋白获取的成本,便于工业化生产。目前为止对于巨大芽孢杆菌Rnase的分离纯化未见报道,本文分离纯化了巨大芽孢杆菌的Rnase,并对其进行了性质研究,以期为该酶的开发及应用莫定基础。
　　 巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,纯化倍数为606.67倍,酶活力回收率为11.37%,该酶比活力为54272.27U/mg。该酶分子量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。以不同浓度酵母RNA为底物在最适条件下测得该酶Km值为2630.02μg/mL。
　　 性质研究表明:Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。EDTA和Mg2+对Rnase活性几乎不影响,KSCN与金属离子Li+,K+,Mn2+,Ba2+,Co2+,Na+,Zn2+在低浓度下对Rnase有抑制作用,异丙醇、甲醇、乙醇和和乙腈这四种有机物对Rnase有轻微激活作用,其中异丙醇的激活作用最强。
　　 功能基团修饰表明:氯胺-T、NAI以及PMSF对该酶均无明显影响,说明该酶的活性中心不存在甲硫氨酸硫醚基、酪氨酸酚羟基和丝氨酸残基。DTT、顺丁烯二酸酐、BD、BrAc及PCMB均在低浓度对该酶有抑制作用,但是随着抑制剂浓度的增大,抑制作用不再增加,说明二硫键、赖氨酸ε-氨基、精氨酸胍基、组氨酸咪唑基和巯基可能与该酶的活性有影响,但并不处于该酶的活性中心。