声明
符号表
第1章 文献综述
1.1 鼠伤寒沙门菌及其危害
1.1.1 沙门菌病原学
1.1.2 沙门菌的流行病学
1.1.3 沙门菌的诊断和鉴定
1.1.4 沙门菌的防治
1.1.5 鼠伤寒沙门菌的致病机制
1.1.6 鼠伤寒沙门菌的危害
1.2 核酸酶5'-nucleotidase研究进展
1.2.1 核酸酶的分类
1.2.2 核酸酶的功能
1.2.3 核酸酶在微生物感染中的作用
1.2.4 5'-nucleotidase的生理功能
1.2.5 5'-nucleotidase在微生物感染中的作用
1.3 研究目的与意义
第2章 鼠伤寒沙门菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的鉴定
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 主要试剂及培养基
2.1.3 主要试剂配制
2.1.4 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 鼠伤寒沙门菌SL1344株胞外蛋白的收集
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳法测定胞外蛋白的核酸酶活性
2.2.3 琼脂扩散法测定胞外蛋白的核酸酶活性
2.2.4 琼脂培养法测定胞外蛋白核酸酶活性
2.2.5 温度对胞外蛋白核酸酶活性的影响
2.2.6 pH对胞外蛋白核酸酶活性的影响
2.2.7 金属阳离子对胞外蛋白核酸酶活性的影响
2.2.8 胞外蛋白活性核酸酶的SDS-PAGE酶谱和LC-ESI/MS/MS分析
2.3 结果与分析
2.3.1 琼脂糖凝胶电泳法测定胞外蛋白的核酸酶活性
2.3.2 琼脂扩散法测定胞外蛋白的核酸酶活性
2.3.3 琼脂培养法测定胞外蛋白的核酸酶活性
2.3.4 温度对胞外蛋白核酸酶活性的影响
2.3.5 pH对胞外蛋白核酸酶活性的影响
2.3.6 金属离子对胞外蛋白核酸酶活性的影响
2.3.7 胞外蛋白活性核酸酶的SDS-PAGE酶谱和LC-ESI/MS/MS分析
2.4 讨论
2.5 小结
第3章 鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的原核表达及活性分析
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒和细胞
3.1.2 主要试剂和培养基
3.1.3 主要试剂和培养基的配制
3.1.4 主要仪器设备
3.2 方法
3.2.1 引物合成
3.2.2 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.3 大肠杆菌感受态(DH5α和Rosetta)的制备
3.2.4 质粒的提取与鉴定
3.2.5 5'-nucleotidase目的基因的扩增
3.2.6 pMD18-T-5'-nucleotidase克隆载体的连接与转化
3.2.7 pMD18-T-5'-nucleotidase克隆载体的鉴定
3.2.8 生物信息学分析
3.2.9 重组表达载体pET-32a-5'-nucleotidase的构建及鉴定
3.2.10 重组5'-nucleotidase蛋白的诱导表达
3.2.11 重组5'-nucleotidase蛋白的纯化
3.2.12 SDS-PAGE鉴定
3.2.13 Western-blot分析
3.2.14 重组5'-nucleotidase蛋白的核酸酶活性测定
3.3 结果与分析
3.3.1 pMD18-T-5'-nucleotidase的鉴定
3.3.2 同源性分析
3.3.3 理化性质分析
3.3.4 结构分析
3.3.5 重组表达载体pET-32a-5'-nucleotidase鉴定
3.3.6 SDS-PAGE鉴定及Western-blot分析
3.3.7 重组5'-nucleotidase蛋白的核酸酶活性测定
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失菌株的构建
4.1 材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 主要试剂和培养基
4.1.3 主要试剂的配制
4.1.4 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 引物的设计合成
4.2.2 5'-nucleotidase基因上下臂片段的扩增
4.2.3 中间载体pSK-Δ5'-nucleotidase的构建
4.2.4 重组自杀性质粒pRE-Δ5'-nucleotidase的构建
4.2.5 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase的筛选
4.2.6 沙门菌感受态的制备
4.2.7 沙门菌的电转化
4.2.8 SL1344CΔ5'-nucleotidase 回复菌株的构建
4.3 结果与分析
4.3.1 5'-nucleotidase基因上下臂片段的扩增
4.3.2 中间载体pSK-Δ5'-nucleotidase的鉴定
4.3.4 缺失菌株SL1344?5'-nucleotidase的筛选
4.3.5 SL1344CΔ5'-nucleotidase 回复菌株的鉴定
4.4 讨论
4.5 小结
第5章 鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失菌株的生物学特性
5.1 材料
5.1.1 菌株、质粒、细胞和实验动物
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要培养基及配制
5.1.4 主要试验仪器
5.2 方法
5.2.1 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase的表型鉴定及生化特性
5.2.2 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase的遗传稳定性
5.2.3 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase生长特性
5.2.4 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase的耐酸碱和耐盐性检测
5.2.5 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase的生物被膜检测
5.2.6 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase对HeLa细胞的黏附和侵入试验
5.2.7 缺失菌株S L1344Δ5'-nucleotidase的毒力测定
5.2.8 缺失菌株免疫小鼠后血清中IgG含量的测定
5.2.9 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase免疫保护率测定
5.2.10 缺失菌株的胞外蛋白核酸酶活性检测
5.2.11 统计学分析
5.3 结果
5.3.1 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase的表型鉴定及生化特性
5.3.2 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase的遗传稳定性
5.3.3 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase生长特性鉴定
5.3.4 缺失菌株的耐酸碱性和耐盐性检测
5.3.5 缺失菌株SL1344?5'-nucleotidase的生物被膜检测
5.3.6 缺失菌株对HeLa细胞的黏附和侵入试验
5.3.7 SL1344Δ5'-nucleotidase缺失菌株毒力测定
5.3.8 缺失菌株免疫小鼠后血清中IgG含量的测定
5.3.9 缺失菌株SL1344Δ5'-nucleotidase免疫保护率测定
5.3.10 缺失菌株的胞外蛋白核酸酶活性检测
5.4 讨论
5.5 小结
第6章 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间的研究成果
