一种低温的木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷双功能酶AX543及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶双功能酶AX543及其基因。其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，具有以下性质：最适pH6.0，在pH？5.0-8.0范围内都具有70％以上的相对酶活性；最适温度25℃，在0℃，4℃和15℃分别保持了5％，20％和80％以上的相对活性，具有良好的热稳定性，在40℃处理1h可以保持50％以上的酶活性。AX543同时具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶活性，并且具有水解多种天然底物的能力。本发明的双功能酶是一种新的低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶，可以应用于能源、饲料和食品等工业，减少能源消耗。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖 苷双功能酶AX543及其基因和应用。

背景技术

半纤维素是木质纤维素中的重要组成成分，它的结构与组成比较复杂，其主链 是由五碳糖通过直链或支链的方式聚合形成，而其侧链具有多种的取代基，如半乳 糖、阿拉伯糖等。木聚糖是构成半纤维素的最主要成分，也是最丰富的半纤维素资 源。虽然半纤维素很容易被酸分解成单体，可是酸解法很容易对环境造成污染，采 用生物酶降解半纤维素可以有效避免污染，实现能源“清洁”这一目标。木聚糖的 完全降解需要多种酶，首先由木聚糖酶随机地将其切割成不同链长的低聚木糖分子， 紧接着由β-木糖苷酶作用于低聚木糖分子的非还原性末端，完全降解成木糖，而 阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶及阿魏酸酯酶等作用于侧链的糖苷键，释放出更多 单糖和寡糖。木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶可以应用于传统的工业工艺、能源资源 领域、食品工业、饲料、造纸等工业。

在连续运转的工业生产中，低温酶的应用可在很大程度上降低菌种被污染的风 险,生产过程在低温或室温下进行，无需加热和冷却，可以降低成本节约能源；生 产过程便于监控；在食品行业中，由于低温酶在中温下容易失活，在应用低温酶达 到最佳反应效果后,只需在中等温度保持较短时间就可使酶失活,这样不会因温度 高而破坏食品的风味。但是目前发现的多数木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的最适作 用温度主要在40-70℃之间，因此，获得性质优良的低温木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖 酶，并对其表达，纯化，性质，结构特征及应用的研究有着重要的意义。

本发明的木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度25℃，在0℃，4℃和15℃分别 保持了5％，20％和80％以上的相对活性，并且具有良好的热稳定性，在40℃处理 1h可以保持50％以上的酶活性，是一种具有应用潜力的新的低温木糖苷/阿拉伯呋 喃糖苷酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的低温木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶双功能 酶。

本发明的再一目的是提供编码上述低温木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶双功能酶基 因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明从环带状枝顶孢属菌中分离得到一种新的低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷双 功能酶AX543。

本发明提供了一种低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷双功能酶AX543，其氨基酸序列 如SEQIDNO.1所示。

SEQIDNO.1：

MPPLITSIYTADPSAHVFNDKIYIYPSHDRETDIAFNDNGDQYDMADYHVFSTSDF KEVTDHGVVLKTEDVPWASKQLWAPDAAHKNGKYYLYFPARDKEGIFRIGVAV GDKPEGPFTADPEPIKGSYSIDPASFVDDDGQAYLYFGGLWGGQLQCYQKGDDT YDPEWQGPKEVSGEGVAAQGPRAAKLTDDMHQFESPAQELLILDPETKEPILGDD HARRFFEAAWMHKHNGKYYFSYSTGDTHFLCYAVGDSPMGPFTYGGKILEPVLG WTTHHSIVEYKGKTYLFFHDCELSKGVDHLRSVKAKEIFYDDQGRIITTKAD

其中，该酶基因编码324个氨基酸和一个终止密码子，不包含信号肽，因此， 成熟的双功能酶AX543的理论分子量为36.52kDa。

本发明的AX543是一个低温酶，最适温度为25℃，同时具有良好的热稳定性，常 温下，在弱酸性和中性的范围内均具有活性。本发明克隆得到的双功能酶AX543， 其最适pH值均为6.0，以pNPX为底物，测得其木糖苷酶活性在PH5.0～7.0的范围 内维持50％以上的酶活性；以pNPAf为底物，测得其阿拉伯呋喃糖苷酶活性在PH5～9 范围内保持有50％以上的活性；在40℃处理1h后两种酶活性均具有50％以上的酶 活力。

本发明提供了编码上述低温双功能酶AX543。具体地，该基因的基因组序列如 SEQIDNO.2所示。

SEQIDNO.2：

ATGCCGCCCCTCATTACCTCCATCTACACAGCTGATCCCTCAGCCCACGTCTTC AATGACAAGATCTACATCTACCCGTCTCACGACCGCGAGACGGACATTGCCTT CAACGACAATGGCGACCAGTATGACATGGCCGACTACCATGTCTTCTCCACGT CGGACTTCAAGGAGGTGACCGACCACGGCGTCGTGCTCAAGACAGAGGACGT GCCGTGGGCGAGCAAGCAGCTCTGGGCCCCCGACGCGGCGCACAAGAACGGA AAATACTACCTCTACTTCCCGGCACGAGACAAGGAAGGCATCTTTCGGATTGG CGTGGCCGTGGGTGACAAGCCCGAGGGCCCCTTCACCGCCGACCCAGAGCCC ATCAAGGGCAGCTACTCCATCGACCCGGCCAGTTTCGTCGACGATGACGGCCA GGCCTACCTCTACTTTGGCGGTCTCTGGGGTGGCCAGCTCCAATGCTACCAAA AGGGCGACGACACGTACGACCCGGAGTGGCAAGGACCCAAGGAAGTCTCTGG CGAGGGCGTCGCAGCGCAGGGCCCTCGCGCCGCCAAGTTGACAGACGACATG CACCAATTCGAGTCGCCAGCCCAAGAGCTCCTCATTCTGGACCCAGAGACCAA GGAACCCATTCTCGGCGACGACCACGCGCGCCGCTTCTTTGAAGCCGCGTGGA TGCACAAGCACAATGGCAAGTACTACTTCTCCTACTCGACGGGCGACACCCAC TTCCTCTGCTACGCCGTGGGCGACTCACCCATGGGTCCGTTCACGTATGGCGG CAAGATCCTGGAGCCCGTGCTGGGCTGGACGACGCACCACTCGATTGTCGAGT ACAAGGGCAAGACATATCTCTTCTTCCACGACTGTGAGCTGAGCAAGGGTGTG GACCACCTCAGGAGCGTCAAGGCCAAGGAGATCTTTTACGACGATCAGGGTA GGATCATCACGACAAAGGCAGAT

本发明通过PCR的方法分离克隆了双功能酶AX543，DNA全序列分析结果表 明，双功能酶AX543结构基因AX543全长972bp。

蛋白理论分子量为36.52kDa，将双功能酶基因AX543序列及推导出的氨基酸序 列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于AcremoniumchrysogenumATCC 11550的Xylosidase/arabinosidase-likeprotein氨基酸序列一致性为86％。说明AX543 是一种新的双功能酶。

本发明还提供了包含上述双功能酶基因AX543的重组载体，命名为pPIC- AX543。将本发明的双功能酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其 核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案， 优选为将本发明的木糖苷酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切 位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表 达质粒pPIC9-AX543。

本发明还提供了包含上述低温双功能酶AX543的重组菌株，优选所述菌株为大 肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株GS115/AX543。

本发明还提供了一种制备低温双功能酶AX543的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组双功能酶表达；

3)回收并纯化所表达的双功能酶AX543。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞， 优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichiapastoris)GS115，得到重组菌株 GS115/AX543。

附图说明

图1重组双功能酶的镍柱纯化。

图2重组双功能酶的最适pH。

图3重组双功能酶的pH稳定性。

图4重组双功能酶的最适温度。

图5重组双功能酶的热稳定性。

图6重组双功能酶的金属离子稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从来源于土壤样品的环带状枝顶孢属菌54-7中分离得 到一种新的低温双功能酶AX543。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于 Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公 司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。

(2)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin， 1％甘油(V/V)。

(3)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同。

(4)NB培养基：0.3％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.6葡萄糖，1％Nacl。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆 实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和 产品说明书进行。

实施例1环带状枝顶孢属菌木糖苷酶编码基因ax543的克隆

提取来源于土壤样品的环带状枝顶孢属菌54-7基因组DNA：

根据第43家木糖苷酶基因的保守区(SKQLWAPD和CWTTHHSIVE)序列设计合 成了简并引物XylF，XylR。以环带状枝顶孢属菌54-7总DNA为模板进行 Touch-downPCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec， 65-55℃退火45sec(每个循环降0.5度)，72℃延伸40sec10个循环，94℃变性30s， 55℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约622bp 片段，将该片段回收后与PMD-19T载体相连并测序。根据测序得到的核苷酸序列， 设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方 向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没 有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为 usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木糖苷酶Xyl543-1TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送金唯智 公司测序。拼接后AX543木糖苷酶基因全长972bp，编码324个氨基酸和一个终止 密码子。该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为36.52kDa。

实施例2重组双功能酶Xyl/Abf543-1的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木糖苷酶的基因ax543 双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木糖苷酶的基因片段与表达载体pPIC9连接， 获得含有木糖苷酶基因ax543的重组质粒pPIC-ax543转化毕赤酵母GS115，获得重 组毕赤酵母菌株GS115/ax543。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于100mLBMGY培养液中，30℃250rpm 振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于50mLBMMY培养基重悬，30℃250rpm 振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定木糖苷酶的活力。通过镍柱纯化后， SDS-PAGE结果表明，重组双功能酶在毕赤酵母中得到了表达。如图所示，泳道1 为纯化后的结果，泳道2为未纯化的结果。测得其木糖苷酶比活为15.076U/mg；阿 拉伯呋喃糖苷酶比活为2.083U/mg。

实施例3双功能酶的活性分析

具体方法如下：250μL2mM的pNPX/pNPAf底物与150μL柠檬酸-磷酸氢二钠 缓冲液混匀，加入100μL适当稀释的酶液，于25℃反应10min，加入1.5mL，1M的 Na₂CO₃终止反应，使用分光光度计测定OD₄₀₅值，以计算产物对硝基苯酚的量。1 个木糖苷酶活性单位(U)定义为在给定的相应反应条件下，每分钟分解对硝基苯基 β-D-木糖苷(pNPX)底物生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需要的酶量。1个α-L-阿拉 伯呋喃糖苷酶活性单位(U)定义为在给定反应条件下，每分钟分解底物pNPAf 生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

实施例4双功能酶AX543的性质测定

1、重组双功能酶AX543的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例2纯化的重组木糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。 以pNPX/pNPAf为底物，终浓度为2mM，取250μL底物并加入150μL相应的缓 冲液。缓冲溶液的缓冲梯度不同：100mMcitrate-Na₂HPO₄(pH3.0–8.0)，100mM甘氨 酸-NaOH(pH9.0–12.0)。底物与缓冲液的混合溶液在25℃的反应条件下先预冷5min， 加入100μL适当稀释的酶液，混匀并准确反应10min，加入1.5mlNa₂CO₃终止反应， 冷却至室温后测定OD₄₀₅值。结果(图1)表明，重组酶在以pNPX为底物时的最适 PH为6.0，在PH4.0～7.5之间有30％以上的相对酶活性。以pNPAf为底物时的最适 PH也为6.0，在PH5.0～9之间有50％以上的相对酶活性。在重组酶于各种不同PH 值的缓冲液中37℃，处理1h，再于PH6.0的缓冲液，20℃的条件下测定相对剩余酶 活，以研究酶的PH稳定性。结果(图2)表明，测得其木糖苷酶活性在PH5～7之间 都很稳定，相对剩余酶活均在50％以上。阿拉伯呋喃糖苷酶活性在PH5.5～7.5的范 围内也相对较为稳定。

2、双功能酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

双功能酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系 及不同温度下进行酶促反应。热稳定性测定为重组酶在不同温度下处理不同时间， 再在25℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明两种酶活性最适温 度均为25℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，AX543有良好的热稳定性，在40℃ 下温育60min，能保持50％以上的酶活。

3、重组酶的K_m值测定方法如下：

分别用不同浓度的pNPX与pNPAf为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0) 缓冲液体系中，25℃下测定酶活性，分别计算出在4℃、15℃和25℃下的K_m值以及 Vmax。实验结果如表所示。(表2)

表2.AX543不同温度下的Km、Vmax值测定

4、不同金属离子化学试剂对AX543酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响， 各种物质终浓度为5mmol/L。在20℃、Ph6.0条件下测定酶活性。结果表明，以pNPX 和pNPAf为底物，大多数离子在浓度为5mmol时，对其酶活力都有一定程度的抑制 作用。其中Fe²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺能强烈抑制其活力，而Mn²⁺、Ca²⁺明显增强酶活力。

5、重组酶的底物特异性

该酶对pNPX、pNPAf有活性外，对榉木木聚糖和桦木木聚糖也有一定的水解作 用(表3)。

表3.双功能酶AX543底物特异性分析