一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法

摘要

本发明公开了一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法，属于生物工程领域。本发明通过对光滑球拟酵母的Cgcrz1基因进行缺失或者过表达，相应降低或者提高了菌株的酸胁迫抗性。本发明还比较了缺失突变菌株Cgcrz1Δ在酸胁迫下细胞膜脂肪酸、甾醇成份及比例和通透性，结果发现Crz1p是光滑球拟酵母抵御酸胁迫的必需转录因子，过表达Crz1p可提高光滑球拟酵母酸胁迫抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法，属于生物工程领域。

背景技术

光滑球拟酵母(Candidaglabrata)是工业生产丙酮酸的唯一微生物。除此之外，C.glabrata还可用于工业生产富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸等有机酸。有机酸发酵过程中，随着产物的积累，培养基pH迅速降低，导致菌体的生长和产物的积累减缓甚至停止。近年来国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程和适应性进化等策略提高菌体的酸耐受性和有机酸产量。对C.glabrata进行耐酸机制的研究可从根本上解决这一问题，但此机制尚不清楚。因此，进行光滑球拟酵母酸胁迫耐受机制的研究很有必要，这对提高有机酸产量具有指导意义。

目前对光滑球拟酵母酸胁迫的研究尚未广泛开展，蛋白质组学分析发现相对于高pH来说，光滑球拟酵母对低pH环境有更强的耐受性。对GPI锚定天冬氨酰蛋白酶的研究发现光滑球拟酵母可通过CgYps1调节质子泵CgPma1的活性以适应酸胁迫环境。此外，研究者们对光滑球拟酵母转录因子进行的功能鉴定发现，Msn2p和Msn4p是抵御多种环境压力必不可少的转录因子，Yap1p、Skn7p和Slm7p通过抵御氧胁迫参与酸胁迫应答反应。

对光滑球拟酵母酸胁迫的耐受机制研究处于初步阶段，仍没有形成系统的转录调控网络，因此，从转录因子着手进行相关研究具有重要的意义。

发明内容

为了克服上述问题，本发明鉴定了一种调控光滑球拟酵母酸胁迫的转录因子Crz1p的功能，发现光滑球拟酵母缺失CgCRZ1基因后，与野生型菌株相比，不能正常表达转录因子CgCrz1p，生长能力降低，且在酸胁迫条件下的细胞膜性能改变，胞内微环境发生变化，菌株的酸胁迫耐受性降低。

本发明提供一种改变光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法，是缺失突变CgCRZ1基因以降低菌株酸胁迫抗性，或者过表达CgCRZ1基因以提高菌株的酸胁迫抗性。

所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述光滑球拟酵母是CandidaglabrataATCC55。

在本发明的一种实施方式中，所述缺失突变具体是：将标记基因HIS3同基因CgCRZ1左臂和右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确敲除框电击转化到光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgCRZ1替换成标记基因HIS3，利用重组后的菌株含有基因CgHIS3而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgCRZ1基因的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的突变菌株即为缺失突变CgCRZ1基因的菌株Cgcrz1Δ。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将扩增CgCRZ1基因序列并克隆到质粒pY26上，由强启动子GPD1启动转录翻译，重组质粒pY26-CgCRZ1电击转化到光滑球拟酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将CgCRZ1基因克隆到质粒pY26并在基因缺失突变菌株Cgcrz1Δ中过表达，利用质粒pY26上的尿嘧啶基因URA3作为标记筛选基因回补菌株，验证正确的菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1。

本发明还提供一种酸胁迫抗性降低的光滑球拟酵母，所述光滑球拟酵母缺失了CgCRZ1基因；所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。

本发明还提供一种酸胁迫抗性提高的光滑球拟酵母，所述光滑球拟酵母过表达CgCRZ1基因；所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达具体是：扩增CgCRZ1基因序列，通过T4连接酶将CgCRZ1基因经酶切位点BamHI和StuI克隆到高拷贝质粒pY26上，由强启动子GPD1启动转录翻译，重组质粒pY26-CgCRZ1电击转化到光滑球拟酵母基因缺失突变菌株Cgcrz1Δ中，利用质粒pY26上的尿嘧啶基因URA3作为标记筛选基因回补菌株，将经过质粒PCR和质粒酶切验证正确的菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1，编号保存。

本发明还要求保护所述光滑球拟酵母在生产有机酸方面的应用，以及在食品、化工、制备药物方面的应用。

本发明还提供一种改变光滑球拟酵母细胞膜组成的方法，所述方法是过表达CgCRZ1基因。

本发明的有益效果：

本发明鉴定了光滑球拟酵母中转录因子CgCrz1p的功能，通过缺失突变CgCRZ1基因降低了菌株酸胁迫抗性，或者过表达CgCRZ1基因提高了菌株的酸胁迫抗性。

附图说明

图1基因缺失菌株的构建及验证，A敲除框的构建，B基因缺失菌株的验证；

图2光滑球拟酵母生长的测定，A不同pH下的平板生长实验，B不同pH下生长曲线测定；

图3细胞膜性能测定结果，A脂肪酸含量测定，B甾醇成份及含量测定，C细胞膜通透性测定；

图4过表达菌株的构建及验证，A表达基因的扩增，B基因过表达菌株的验证；

图5光滑球拟酵母生长的测定，A不同pH下生长曲线测定；B在pH＝2.3酸胁迫下，生长后期胞外pH值测定。

具体实施方式

以下是光滑球拟酵母(Candidaglabrata)菌株构建及验证、生长性能分析及细胞膜性能测定的实施例。

实施例1：缺失突变菌的构建

以C.glabrataATCC2001(wt)基因组为模板，分别以P1/P2(序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示)、P3/P4(序列分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示)、P5/P6(序列分别如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示)为引物，扩增出待敲除基因的左臂(L)、组氨酸基因(M)和右臂(R)，经融合PCR构建敲除框CgCRZ1-LMR(图1)。出发菌株C.glabrataATCC55因缺失组氨酸基因不能在MM筛选培养基上生长，而突变菌株经同源重组后，因标记基因组氨酸表达而在MM培养基上生长。对转化子进行PCR验证，如图1所示，提取转化子的基因组，发现以P7/P8(序列分别如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示)为引物时，野生型菌株wt产生3.0kb左右基因片段，而转化子获得1.7kb左右的基因CgHIS及基因CgCRZ1的左右臂。将验证正确的突变菌株命名为Cgcrz1Δ。

P1：CGGGATCCCGATTAGTAGCGATAACGAGTTGGAC

P2：ACCCTCTTAACAAACGCCATTGCTGAATATTGCAAAATCTTGT

P3：TACAAGATTTTGCAATATTCAGCAATGGCGTTTGTTAAGAGGGTT

P4：ATACTGGAGGTTTGTGTTAATCTATGCTAGGACACCCTTAGTGG

P5：CCACTAAGGGTGTCCTAGCATAGATTAACACAAACCTCCAGTATT

P6：GGAATTCCGCAACCCCTTATTTCCTTAGAT

P7：TGGCACATATGCCTCGATGTA

P8：TTGTCTTAAATGCGTTGGC

实施例2：缺失突变菌的生长性能测定

通过平板生长实验和细胞生长测定对CgCRZ1进行功能鉴定：

1)平板生长实验：

将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids，2％Glucose，pH5.7)液体培养基中，30℃摇床培养12h至对数生长期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₀₀＝l.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在待测固体培养基上，30℃培养2天，观察菌体的生长情况并拍照。

2)细胞生长测定：

将对数期的待测菌株接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids，2％Glucose，pH5.7)液体培养基中，30℃摇床培养12h至对数生长期，接种至不同pHYNB培养基中，初始OD₆₀₀＝0.1，30℃摇床培养，每隔一定的时间取菌液，稀释适当倍数，600nm测定OD值。

平板生长实验和生长曲线分析不同pH对菌株wt、Cgcrz1Δ生长的影响，如图3A、3B。缺失菌株Cgcrz1Δ在不同pH培养基中的生长，发现突变菌株Cgcrz1Δ在pH8.0时生长不受影响，当pH2.6时生长开始受到抑制，在pH2.3时则生长缓慢，以上结果表明，基因CgCRZ1的缺失降低了C.glabrata的生长能力和对酸性环境的耐受能力。

实施例3：缺失突变菌的细胞膜性能测定

通过测定细胞膜脂肪酸、细胞膜通透性，对光滑球拟酵母细胞膜性能进行评价。

(1)细胞膜脂肪酸测定

细胞培养：收集YNB-5.7和YNB-2.3处理12h的酵母细胞，用PBS缓冲液洗涤三遍，然后冷冻干燥后备用。脂质提取及处理：称取冷冻干燥后的菌体30mg，置于试管中，加入1ml溶液Ⅰ，100℃进行水浴30min。进行冰浴来迅速冷却，之后加入2mL溶液Ⅱ，混匀后在80℃水浴中处理5min。迅速冷却，并加入1.25mL溶液Ⅲ。摇匀震荡5min，之后保留上层溶液。然后在上层溶液中加入3ml溶液Ⅳ和几滴饱和氯化钠溶液，震荡摇匀5min。静置，等溶液分层后，吸取上层液体于气相样品管中，进行检测。

脂肪酸提取液及配置

溶液Ⅰ:氢氧化钠45g，甲醇150mL和超纯水150mL；(皂化液)

溶液Ⅱ：325mL，6.0mol.L-1盐酸和275mL甲醇；(甲基化)

溶液Ⅲ：200mL己烷和200mL甲基三丁基乙醚；(提取)

溶液Ⅳ：10.08g氢氧化钠，900mL超纯水。(碱洗)

色谱分析条件:PEG毛细管填充柱；载气:氦气；柱压:63.4kPa；流速:29.6mL/min；进样口温度:260℃；柱流量：0.5mL/min；检测器温度：280℃：柱温升温程序：初始柱温温度为100℃，时间为1min，随后以4℃/min的速率升高到250℃并在250℃保持5min，“C9一C20”的脂肪酸成分均可按各自的保留时间和质谱范围在图库中进行查找，所得数据为三次独立样品制备与测定的平均值。

细胞膜甾醇成份测定

1)细胞培养：将WT和基因缺陷型菌株，30℃，200rpm培养至对数中期，转接至YNB-5.7和YNB-2.3，30℃，200rpm，培养12h，收集上述培养后的细胞。4℃，5000rpm，15min，用PBS缓冲液洗涤三遍，然后冷冻干燥后备用。

2)称取30mg(干重)酵母细胞，加入40ul，0.5mg/mL的胆固醇作为内标。

3)皂化：加入甲醇配制的1.5MKOH，准确沸水浴皂化反应30min。

4)提取：皂化后，加入1mL正己烷，充分涡旋震荡，1000rpm，离心5min，吸取上清约600μL氮吹，干燥。

5)衍生化：每个离心管中加入适量含有MSTFA+TMCS的无水吡啶，30℃温育30min。

6)氮吹仪吹干，吸取100ul正己烷复溶。

酵母甾醇分析方法：气相色谱—飞行时间质谱(TOF)联用仪(Waters，USA)。固定相：硅胶毛细管柱(30m×0.25mm，0.25umDB-5MSstationaryphase,J&WScientific,Folsom,CA)。

质谱条件如下：

1.电离方式为电子轰击，电子束能量70eV，离子化电流40μA。

2.扫描范围在m/z50-800。

3.离子源温度为250℃。

4.进样温度为280℃。

5.氦气用作载气，91Kpa恒压模式下操作。

6.柱温保持70℃2min，以15℃/min的速度升至250℃，保持250℃11min，然后以2℃/min的速度升到300℃，维持3min。

(2)细胞膜通透性测定

细胞培养：收集YNB-5.7和YNB-2.3处理24h的酵母细胞，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₀₀＝l.0，吸取500μLOD＝1.0的细胞菌液，PBS缓冲液洗涤，加入5μLPI和500μLPBS缓冲液，立即避光反应5min。采用荧光显微镜观测。

结果显示，pH5.7与pH2.3时野生型菌株wt和突变菌株Cgcrz1Δ的细胞膜脂肪酸、甾醇成份及比例和细胞膜通透性如图3所示。在同一pH_out，与wt相比，Cgcrz1Δ不饱和脂肪酸(TUFA)含量及不饱和与饱和脂肪酸的比例(U/S)下降，饱和脂肪酸(TSFA)则上升，CgCRZ1Δ中不饱和脂肪酸C18：1呈现出较大下降幅度(图3A)；在pH2.3时，与wt相比，突变菌株Cgcrz1Δ总甾醇含量下降85％，主要细胞膜甾醇-麦角甾醇同样下降85％，某些中间甾醇-粪甾醇几乎消失，严重破坏了Cgcrz1Δ细胞膜结构成份，严重影响细胞膜流动性和通透性(图3B)；在pH＝2.3条件下培养24h，野生型菌株wt酸胁迫条件下仅有约15％酵母死亡，而突变菌株Cgcrz1Δ约有90％酵母死亡(图3C)。上述结果表明，突变菌株Cgcrz1Δ在pH2.3条件下细胞生长减弱的原因在于细胞膜结构成份被破坏，引起细胞膜流动性、通透性和完整性遭到破坏，进而造成细胞胞内微环境变化。

实施例4：过表达菌株的构建

以P9/P10(序列分别如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示)将扩增出的带有酶切位点BamHI和StuI的片段CgCRZ1(图4，1.9kb)经双酶切消化后连接到高拷贝质粒pY26上，由强启动子GPD1启动转录翻译，构建质粒pY26-Cgcrz1。突变菌株Cgcrz1Δ因缺失尿嘧啶基因不能在MM筛选培养基上生长，而质粒pY26上的尿嘧啶基因可使过表达菌株获得这一生长能力。菌落PCR筛选验证发现，作为对照的突变菌株Cgcrz1Δ无条带产生，而转化子扩增得到特异性片段(图4，1.9kb)，将此菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1。

P9：CGCGGATCCATGGGCGATAACGAAGAGG

P10：AAAAGGCCTTTCCAAAGTAACACCCATCTCAG

实施例5：过表达菌株的生长性能测定

通过平板生长实验和细胞生长测定对CgCRZ1进行功能鉴定：

1)细胞生长测定：

将对数期的待测菌株接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids，2％Glucose，pH5.7)液体培养基中，30℃摇床培养12h至对数生长期，接种至不同pHYNB培养基中，初始OD₆₀₀＝0.1，30℃摇床培养，每隔一定的时间取菌液，稀释适当倍数，600nm测定OD值。

2)pH＝2.3培养条件下胞外pH值测定

将接种至pH＝2.3的YNB培养基的wt、Cgcrz1Δ及Cgcrz1Δ/CgCRZ1菌株培养至平台期后期，测定wt、Cgcrz1Δ及Cgcrz1Δ/CgCRZ1菌株胞外pH即YNB培养基pH。

生长曲线分析不同pH对菌株wt、Cgcrz1Δ及Cgcrz1Δ/CgCRZ1生长的影响，如图5A、5B，对于过表达菌株Cgcrz1Δ/CgCRZ1，在pH＝5.7正常培养条件下，菌浓比wt多6个OD，当在pH2.3时，生长不受影响，菌浓比wt多4个OD；在pH＝2.3条件下培养至平台期后期，菌株wt、Cgcrz1Δ胞外pH即YNB培养基pH在2.2左右，而过表达菌株Cgcrz1Δ/CgCRZ1胞外pH即YNB培养基pH在2.0左右，以上结果表明，基因CgCRZ1的过表达提高了C.glabrata的生长能力和对酸性环境的耐受能力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。