调控光滑球拟酵母碳代谢流促进α-酮戊二酸过量积累

摘要

本论文以一株能在胞外大量积累丙酮酸和α-酮戊二酸的光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)四重维生素的营养缺陷型菌株CCTCC M202019为出发菌株，以碳主流代谢途径中的α-酮酸脱氢酶系(丙酮酸脱氢酶系和α-酮戊二酸脱氢酶系)为研究对象，结合生化工程和基因工程手段，调控碳代谢流进入TCA循环，同时阻断α-酮戊二酸的进一步代谢途径，使碳代谢流从过量积累丙酮酸转向过量积累α-酮戊二酸，提高α-酮戊二酸对丙酮酸的碳摩尔比。本论文主要结论如下:
　　 1.根据文献报道结合实验结论，选择过氧化氧和甲氨喋呤作为α-酮戊二酸脱氢酶的有效抑制剂，在T.glabrata发酵生产α-酮戊二酸的过程中:(1)添加6 mM过氧化氢，α-酮戊二酸产量达到21.8 g/L，比对照(16.8 g/L)增加30.1%；(2)添加0.08μM甲氨喋呤，α-酮戊二酸产量达到20.5 g/L，比对照增加22.1%；(3)同时添加以上两种抑制剂，α-酮戊二酸脱氢酶活性降低了47%，减少了α-酮戊二酸的进一步代谢，使其产量达到了23.5 g/L，比对照提高了40.1%；(4)在抑制α-酮戊二酸脱氢酶活性的同时，增加维生素B1浓度至0.04 mg/L时，α-酮戊二酸产量达到最大值为28.4 g/L，比对照增加69.6%，继续增加维生素B1浓度，丙酮酸和α-酮戊二酸产量均下降。
　　 2.利用酶切连接技术，在体外成功构建了敲除组件Kgd1::Kan，将该组件转化光滑球拟酵母，筛选得到α-酮戊二酸脱氢酶系-El基因kgdl缺陷的工程菌T.glabratakgd1::kan。相对于出发菌株，对工程菌研究结果表明:(1)在α-酮戊二酸脱氢酶途径受阻的情况下，细胞选择了增加乙醛酸途径流量来完成碳源的代谢，形成了TCA-乙醛酸循环；(2)α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失，导致胞内NADH/NAD水平下降了33.7%，ATP/ADP水平下降了31.8%，而与NADH代谢相关的丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性分别提高了58.1%、33.3%和32.5%，导致胞内丙酮酸含量下降了50.1%，琥珀酸、苹果酸和α-酮戊二酸的胞内含量分别增加了172.7%、66.1%和41.1%，TCA-乙醛酸循环通量增加；(3)丙酮酸族氨基酸含量下降了29.3%，而胞内谷氨酸族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸含量分别提高了34.7%和26.8%。以上结论说明，α-酮戊二酸脱氢酶系在细胞能量代谢、碳源代谢和氨基酸代谢中均起到了不可忽视的调节作用。
　　 3.对重组菌T.glabrata kgdl::kan的发酵特性研究发现，在α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失的同时增加培养基中维生素B1浓度提高丙酮酸脱氢酶活性，α-酮戊二酸产量达到22.0 g/L，同时CKG/CPYR值达到1.14，比出发菌正常发酵条件下分别提高了33.4%和1.11倍。然而，相比相同维生素条件下α-酮戊二酸脱氢酶受部分抑制的情况，却降低了22.6%和30.7%。α-酮戊二酸脱氢酶活性的完全缺失导致原本流量较小的乙醛酸循环成为碳主流代谢途径，从而绕过α-酮戊二酸这一节点完成细胞代谢，导致碳源流失。因此，对于碳代谢流的调控，α-酮戊二酸脱氢酶途径的部分抑制比完全阻断更有利于α-酮戊二酸的积累。
　　 4.利用酶切连接技术，在体外成功构建了表达质粒pYX-PDA1，将其转化T.glabrata△ura3感受态细胞，成功地筛选得到了一株过量表达丙酮酸脱氢酶的光滑球拟酵母T.glabrata-pdal。重组菌胞内丙酮酸脱氢酶表达活性达到0.35 U/mg protein，为出发菌的3.8倍。比较重组菌与出发菌的发酵过程曲线发现，提高丙酮酸脱氢酶活性，可以有效促进丙酮酸的进一步代谢，并将碳代谢流导向TCA循环，使α-酮戊二酸产量达到31.7 g/L，比出发菌(22.8 g/L)提高38.9%，同时CKG/CPYR值升高至3.05，这将有利于降低后续提取分离工序的成本，促进发酵法生产α-酮戊二酸的工业化。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1 微生物制造及其发展概况

1.1.1 微生物制造是现代经济发展的必然趋势

1.1.2 微生物制造所涉及的关键微生物技术

1.1.3 精细化学品的微生物制造

1.2 α—酮戊二酸研究背景

1.2.1 α—酮戊二酸的结构和应用

1.2.2 发酵法生产α—酮戊二酸的历史

1.2.3 α—酮戊二酸的生物合成途径

1.3 α—酮酸脱氢酶系

1.3.1 α—酮酸脱氢酶系的作用

1.3.2 α—酮酸脱氢酶系的组成和研究近况

1.4 本论文的立题依据和意义

1.5 本论文的主要研究内容

1.6 本论文中所用到的符号说明

第二章 实验材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种和质粒

2.1.2 酶和试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 主要仪器

2.2 发酵及分析方法

2.2.1 发酵培养方法

2.2.2 有机酸的测定

2.2.3 胞内核苷酸类物质的提取和测定

2.2.4 胞内氨基酸的提取和测定

2.2.5 粗酶液的提取和酶活测定

2.2.6 其他参数测定

2.3 基因操作方法

2.3.1 DNA基本操作

2.3.2 目的基因kgd1 的克隆与表达

2.3.3 敲除质粒pMD—kgd1::kan的构建

2.3.4 T.glabrata敲除kgd1 基因工程菌的构建

2.3.5 目的基因pda1 的扩增

2.3.6 表达质粒pYX—PDA1 的构建

2.3.7 T.glabrata过量表达pda1 基因工程菌的构建

第三章 结果与讨论

3.1 抑制α—KGDH活性 促进α—酮戊二酸过量积累

3.1.1 α—KGDH抑制剂的选择

3.1.2 同时添加过氧化氧和甲氨喋呤促进T.glabrata发酵产酸

3.1.3 前疏后阻促进T.glabrata发酵生产α-酮戊二酸

3.1.4 小结

3.2 敲除α—KGDH—E1 基因kgd1 对细胞代谢及产酸的影响

3.2.1 目的基因的扩增与敲除质粒的构建

3.2.2 重组菌的构建与鉴定

3.2.3 α—KGDH对胞内核苷类物质及TCA循环关键酶活性的影响

3.2.4 α—KGDH对碳流量及流向与氨基酸代谢的影响

3.2.5 敲除kgd1 对T.glabrata发酵生产α—酮戊二酸的影响

3.2.6 小结

3.3 过量表达pda1 提高PDH途径通量促进α—酮戊二酸积累

3.3.1 目的基因的扩增与表达质粒的构建

3.3.2 过量表达pda1 重组菌的构建

3.3.3 重组菌的质粒提取和菌落PCR验证

3.3.4 提高PDH活性对T.glabrata发酵生产α—酮戊二酸的影响

3.3.5 小结

3.4 本章总结

致谢

参考文献

附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文