罗汉果三萜皂甙及其盐和其制备方法、应用及包含该罗汉果三萜皂甙及其盐的药物组合物

摘要

本发明提供一种罗汉果三萜皂甙及其盐和其制备方法、应用及包含该罗汉果三萜皂甙及其盐的药物组合物。本发明一方面提供一种罗汉果三萜皂甙及其盐的制备方法，包括得到提取液、得到澄清的水溶液、得到富集罗汉果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液、得到粗品罗汉果三萜皂甙水溶液和制得罗汉果三萜皂甙及其盐的步骤；本发明另一方面提供一种由上述制备方法得到的罗汉果三萜皂甙及其盐；本发明又一方面提供上述罗汉果三萜皂甙及其盐在制备用于治疗肿瘤的化疗增效剂中的应用；本发明再一方面提供一种药物组合物，其包含上述罗汉果三萜皂甙及其盐和药用载体。本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性和减少化疗药物的用量。

说明书

技术领域

本发明涉及从植物中提取的化合物在制备用于治疗肿瘤的化疗 增效剂中的应用，具体地涉及罗汉果三萜皂甙及其盐和其制备方法、 应用及包含该罗汉果三萜皂甙及其盐的药物组合物。

背景技术

化疗是治疗肿瘤疾病的重要途径之一，然而，部分化疗药物副 作用较大，给患者带来痛苦，如长春新碱、甲氨喋呤、顺铂、环磷 酰胺等可导致注射局部疼痛、静脉栓塞、胃肠道反应、骨髓抑制、 外周神经病变等毒副作用。此外，由于化疗药物的细胞毒性，甚至 会引发病人产生感染、出血等并发症。例如，顺铂属于细胞周期非 特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复杂过程，并 损伤其细胞膜上的结构，患者使用顺铂后可能会出现以下不良反应： 骨髓抑制、胃肠道反应、肾脏毒性、神经毒性、过敏反应、电解质 紊乱等。

肿瘤化疗增敏剂是一类能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、 减少化疗药物用量的药物。为减少化疗药物的毒副作用、提高药物 疗效、降低抗药性的产生，选择合适的化疗增敏剂进行联合使用， 已成为治疗肿瘤的重要方案之一。如，临床上将顺铂与5-Fu、博来 霉素联合使用治疗食管癌，从而提高疗效。

因此，人们一直希望找到不良反应小，甚至没有不良反应的肿 瘤化疗增效剂。肿瘤对药物的敏感性与其相关基因的表达密切相关， 研究发现Bax表达可增强胰腺癌对吉西他滨和5-FU等化疗药物以 及放射治疗的敏感性，此外，发现Bax基因在胃癌、肝癌等肿瘤组 织中表达明显下调，提示Bax的表达可增强肿瘤对放疗、化疗的敏 感性(何巍，李玉霞，李巍。转染Bax基因对A549细胞系的凋亡 及化疗敏感度的影响[J]。肿瘤防治研究，2014，06：515-518)。Bcl-2 蛋白是Bcl-2原癌基因的编码产物，是细胞存活促进因子，Bcl-2基 因家族中的Bcl-2是最重要的凋亡抑制基因，有研究发现Bcl-2的高 表达能明显抑制化疗药诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤细胞对多种化 疗药物耐受(周亭芳，庄英帜，曹建国。罗格列酮增强顺铂抑制人 肺腺癌细胞增殖作用[J]。中国药理学通报，2005，01：88-91)。

多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的 同时对其他结构不同、作用靶位点不同的抗肿瘤药物也产生耐药的 现象。多项研究显示，ERK通路的过表达与肿瘤的化疗耐药存在正 相关的关系。ERK信号通路的研究为临床上治疗肿瘤耐药提供了药 物支持(梁伟，陈志霞，王慧君，王松坡。ERK信号通路参与至真 方逆转人大肠癌多药耐药细胞HCT-8/VCR耐药作用机制的研究[J]。 中国中西医结合消化杂志，2015，05：315-320)，在绝大多数急性 白血病细胞中，ERK高表达。例如K562细胞系抗凋亡特性就与ERK 基础活性较高有关，ERK活性受抑后，可使K562发生凋亡。通过 阻抑ERK通路，降低磷酸化ERK1/2蛋白表达水平，进而下调端粒 酶活性，可以达到增强白血病、卵巢癌等多种耐药细胞对化疗药物 敏感性的目的(李登举，张瑶珍，黄伟，孟凡凯。抑制ERK增强白 血病和卵巢癌耐药细胞系化疗敏感性[J]。中国实验血液学杂志， 2003，11(6)：595-599)。

因此，为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新 的解决方案。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了罗汉果三萜皂 甙及其盐和其制备方法、应用及包含该罗汉果三萜皂甙及其盐的药 物组合物。根据本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐能够上调Bax 的表达和下调Bcl-2的表达，或者能够下调p-ERK的表达，能提高 肿瘤细胞对化疗药物的敏感性和减少化疗药物的用量，且无其他毒 副作用和不良反应。

本发明一方面提供了一种罗汉果三萜皂甙及其盐的制备方法， 包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎、称重，按罗汉果与水质量比为1:6-1:8的比 例加入水，在80-95℃的温度下搅拌提取1-3个小时，离心收集上清 液，将沉淀重复搅拌提取1-4次，每次均离心收集上清液，合并上 清液以得到提取液；

2)向所述提取液中加入絮凝剂，除去所述提取液中的鞣质和可 溶性蛋白，得到澄清的水溶液；

3)采用XAD-16树脂对所述水溶液进行吸附，然后用30-50％ 的乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液；

4)将所述水-乙醇混合溶液进行减压浓缩，并回收乙醇，浓缩 至膏状的浸膏并称重，向所述浸膏中加入3-6倍质量的去离子水来 稀释浸膏，以得到粗品三萜皂甙水溶液；

5)采用DiaionPA树脂对所述粗品三萜皂甙水溶液进行脱色处 理，收集下注液，得到富集液，再利用半制备液相色谱分离制得纯 度大于98％的罗汉果三萜皂甙及其盐。

本发明另一方面提供了一种由上述制备方法得到的罗汉果三萜 皂甙及其盐，其特征在于，所述罗汉果三萜皂甙及其盐具有以下通 式：

其中，R为H原子、金属离子或n个葡萄糖分子，R1为金属 离子或n个葡萄糖分子，n均≥1。

可选地，所述罗汉果三萜皂甙具有以下结构式：

罗汉果皂甙Ⅵ

罗汉果皂甙Ⅴ

罗汉果皂甙Ⅳ

罗汉果皂甙Ⅲ。

本发明又一方面提供了上述罗汉果三萜皂甙及其盐在制备用于 治疗肿瘤的化疗增效剂中的应用。

可选地，所述化疗增效剂包括化疗增敏剂和耐药逆转剂。

进一步地，所述罗汉果三萜皂甙及其盐能够调控肿瘤细胞中与 药物敏感的、耐药相关的基因的表达。

进一步地，所述罗汉果三萜皂甙及其盐能够上调Bax的表达和 下调Bcl-2的表达，或者能够下调p-ERK的表达。

可选地，所述肿瘤选自白血病、肝癌、肺癌、血癌、结肠腺癌、 淋巴癌、乳腺癌、胰腺癌、喉癌、黑色素瘤或宫颈癌。

本发明再一方面提供了一种药物组合物，其包含上述罗汉果三 萜皂甙及其盐和药用载体。

可选地，所述药用载体选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、 吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂或润湿 剂。

根据本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐和其制备方法、应用 及包含该罗汉果三萜皂甙及其盐的药物组合物，能够带来至少以下 有益效果之一：

(1)具有化疗增效剂的作用。本发明提供的罗汉果三萜皂甙及 其盐，在肿瘤化疗的治疗中具有显著的增敏和耐药逆转作用，此处 所述的增敏作用包括能够增加非耐药肿瘤细胞对于化疗药物敏感性 的作用，以及能够克服耐药肿瘤细胞耐药性的作用，本发明提供的 罗汉果三萜皂甙及其盐通过调控肿瘤细胞中Bax、Bcl-2蛋白以及抑 制ERK信号通路而具有化疗增敏和耐药逆转的作用，既可以发挥较 显著的抑制肿瘤细胞增殖的效应，又能有效降低化疗药物剂量，从 而提高疗效，具有实际的应用价值；

(2)使用方便，应用广泛。本发明提供的含有罗汉果三萜皂甙 及其盐可以单独使用或以药物组合物的形式使用，可通过口服或注 射给药，可通过口服或注射给药，可与抗代谢药物、转录抑制药物、 有丝分裂抑制药物和干扰DNA复制药物等化疗药物联合使用，且 可用于白血病、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌等 各种肿瘤。

附图说明

图1示出了本发明实施例1提供的罗汉果三萜皂甙Ⅵ调控胰腺 癌细胞PANC-1中Bax、Bcl-2蛋白的蛋白免疫杂交结果；

图2示出了本发明实施例1提供的罗汉果三萜皂甙Ⅵ与吉他西 滨联合抑制胰腺癌的结果；

图3示出了本发明实施例2提供的罗汉果三萜皂甙Ⅴ调控肝癌 细胞中Bax、Bcl-2蛋白的蛋白免疫杂交结果；

图4示出了本发明实施例2提供的罗汉果三萜皂甙Ⅴ与顺铂联 合抑制肝癌的结果；

图5示出了本发明实施例3提供的罗汉果三萜皂甙Ⅳ调控白血 病耐药株HL-60/ADR细胞中p-ERK1/2蛋白的蛋白免疫杂交结果；

图6示出了本发明实施例4提供的罗汉果三萜皂甙Ⅲ调控乳腺 癌MCF-7ADR细胞中p-ERK蛋白的蛋白免疫杂交结果。

具体实施方式

下面参照附图详细介绍本发明的示例性实施例。提供这些示例 性实施例的目的是为了使得本领域普通技术人员能够清楚地理解本 发明，并且根据这里的描述能够实现本发明。附图和具体实施例不 旨在对本发明进行限定，本发明的范围由所附权利要求限定。

本发明一方面提供了一种罗汉果三萜皂甙及其盐的制备方法， 包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎、称重，按罗汉果与水质量比为1:6-1:8的比 例加入水，在80-95℃的温度下搅拌提取1-3个小时，离心收集上清 液，将沉淀重复搅拌提取1-4次，每次均离心收集上清液，合并上 清液以得到提取液；

2)向上述提取液中加入絮凝剂，除去所述提取液中的鞣质和可 溶性蛋白，得到澄清的水溶液；

3)采用XAD-16树脂对上述水溶液进行吸附，然后用30-50％ 的乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液；

4)将上述水-乙醇混合溶液进行减压浓缩，并回收乙醇，浓缩 至膏状的浸膏并称重，向该浸膏中加入3-6倍质量的去离子水来稀 释浸膏，以得到粗品罗汉果三萜皂甙水溶液；

5)采用DiaionPA树脂对上述粗品罗汉果三萜皂甙水溶液进行 脱色处理，收集下注液，得到富集液，再利用半制备液相色谱分离 制得纯度大于98％的罗汉果三萜皂甙及其盐。

关于步骤1)，在80-95℃的温度下搅拌提取1-3个小时，优选提 取2个小时；离心收集上清液，将沉淀重复搅拌提取1-4次，每次 均离心收集上清液，优选重复提取1次即可，但是重复提取的次数 越多则获得的提取液就越多。

关于步骤2)，所用的絮凝剂为壳聚糖，是现有技术中已有的成 熟产品，属于有机高分子絮凝剂。

关于步骤3)，XAD-16树脂具体为AmberliteXAD-16非离子型 大孔树脂，一般用于抗生素、萜类等小分子的吸附。

关于步骤5)，DiaionPA树脂具体为三菱化学阴离子交换树脂 多孔型-DiaionPA系列，在此主要用于罗汉果三萜皂甙的脱色；半 制备液相色谱的色谱条件：色谱柱为反相C18柱(其为非极性色谱 柱)，紫外检测波长为214±2.0nm；流动相为乙腈-水，梯度洗脱 0-20min40％乙腈，20-40min40-60％乙腈，40-60min60％乙腈；流 速为1.0mL/min；柱温25℃；按不同的保留时间收集样品，根据所 含糖基数目越多、保留时间越短、出峰越快，依次收集得到下文将 详述的罗汉果皂甙Ⅵ、罗汉果皂甙Ⅴ、罗汉果皂甙Ⅳ和罗汉果皂甙 Ⅲ。

本发明另一方面提供了一种由上述制备方法得到的罗汉果三萜 皂甙及其盐，该罗汉果三萜皂甙及其盐具有以下通式：

其中，R为H原子、金属离子或n个葡萄糖分子，R1为金属 离子或n个葡萄糖分子，n均≥1。

当在上述通式中R为3个葡萄糖分子、R1为3个葡萄糖分子 时，为罗汉果三萜皂甙Ⅵ，CAS登记号为89590-98-7，分子式为 C₆₆H₁₁₂O₃₄，结构式如下：

罗汉果皂甙Ⅵ

当在上述通式中R为2个葡萄糖分子、R1为3个葡萄糖分子 时，为罗汉果三萜皂甙Ⅴ，CAS登记号为88901-36-4，分子式为 C₆₀H₁₀₂O₂₉，结构式如下：

罗汉果皂甙Ⅴ

当在上述通式中R为2个葡萄糖分子、R1为2个葡萄糖分子 时，为罗汉果三萜皂甙Ⅳ，CAS登记号为89590-95-4，分子式为 C₅₄H₉₂O₂₄，结构式如下：

罗汉果皂甙Ⅳ

当在上述通式中R为1个葡萄糖分子、R1为2个葡萄糖分子 时，为罗汉果三萜皂甙Ⅲ，CAS登记号为130567-83-8，分子式为 C₄₈H₈₂O₁₉，结构式如下：

罗汉果皂甙Ⅲ

当在上述通式中R为1个葡萄糖分子、R1为1个钠分子时， 为罗汉果三萜皂甙盐A，结构式如下：

罗汉果皂甙盐A

本发明又一方面提供了上述罗汉果三萜皂甙及其盐在制备用于 治疗肿瘤的化疗增效剂中的应用，该化疗增效剂包括化疗增敏剂和 耐药逆转剂，可应用于白血病、肝癌、肺癌、血癌、乳腺癌、皮肤 癌、胰腺癌、喉癌、黑色素瘤、宫颈癌、口腔癌、淋巴癌和结肠癌 等多种肿瘤细胞。本发明所述的增敏包括能够增加非耐药肿瘤细胞 对于化疗药物敏感性的作用，以及能够克服耐药肿瘤细胞耐药性的 作用。

诱导肿瘤细胞凋亡而增强化疗药物敏感性是目前研究的重点之 一，本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐通过实验发现其能够调控 肿瘤细胞中与药物敏感的、耐药相关的基因的表达，具体而言，上 述罗汉果三萜皂甙及其盐具有调控肿瘤细胞中Bax、Bcl-2蛋白以及 抑制ERK信号通路的作用，即上述罗汉果三萜皂甙及其盐能够上调 Bax的表达和下调Bcl-2的表达，或者能够下调p-ERK的表达。根 据本发明的研究发现，罗汉果皂甙对体外培养的胰腺癌、肺癌、血 癌、肝癌、胃腺癌、淋巴癌和黑色素瘤等肿瘤细胞具有杀伤作用。 迄今，在国内外研究文献及报道中未见将罗汉果皂甙应用于制备肿 瘤化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂。

肿瘤选自白血病、肝癌、肺癌、血癌、结肠腺癌、淋巴癌、乳 腺癌、胰腺癌、喉癌、黑色素瘤或宫颈癌。

本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐可以单独使用，也可以以 药物组合物的形式使用，因此，本发明再一方面提供了一种药物组 合物，其包含上述罗汉果三萜皂甙及其盐和药用载体，其中，上述 罗汉果三萜皂甙及其盐为活性成分。

上述药用载体为各种常用的药物辅料，如填充剂(无水乳糖、 淀粉、乳糖珠粒、葡萄糖)、粘合剂(微晶纤维素)、崩解剂(交联 羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联 PVP)、润滑剂(硬脂酸镁)、吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜 味剂、稀释剂、赋形剂或润湿剂等。

上述药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非 肠道或局部途径给药。口服制剂包括片剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、 溶液等，非肠道给药制剂包括注射液，局部给药制剂包括如霜剂、 软膏剂、贴剂、喷雾剂等。

上述药物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、 皮肤粘膜、尿道、阴道、静脉等。

本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐和/或其药物组合物可用 于上述多种肿瘤细胞的化疗增敏，并可以将上述罗汉果三萜皂甙及 其盐和/或其药物组合物与化疗药物联合使用，低剂量即可发挥协同 作用，既可以发挥较显著的抑制胰腺癌细胞增殖效应，又能有效降 低化疗药物剂量，从而可以提高患者的疗效，具有实际的应用价值。 上述化疗药物包括但不限于：抗代谢药、转录抑制药物、有丝分裂 抑制药物和干扰DNA复制药物。

上述抗代谢药为细胞周期特异性药物，此类药物包括但不限于： 5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤等；上述转录抑制药物包括但不限于：阿霉 素、柔红霉素、放线菌素、普卡霉素等；上述有丝分裂抑制药物包 括但不限于：紫杉醇、长春新碱、多烯紫杉醇等；上述干扰DNA 复制药物包括但不限于：抗生素、博来霉素、拓扑特肯、依立替康、 顺铂等。

用本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐和/或其药物组合物进 行化疗增敏的方法是给予需要化疗增敏减毒的患者化疗药物和增敏 减毒有效量的罗汉果三萜皂甙及其盐和/或其药物组合物。

本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐和/或其药物组合物的用 量可根据给药途径、患者的年龄和体重、所治疗肿瘤的类型及严重 程度的不同而有所不同，即剂量可根据用药途径、患者的年龄、体 重、所治疗的疾病的类型和严重程度等进行调整，其日剂量可以是 0.005-200mg/kg，可一次或多次给药。

下面通过具体的实施例对本发明进行进一步详细描述。

实施例1罗汉果三萜皂甙Ⅵ(可简称皂甙Ⅵ)对胰腺癌的 增敏效果

1、罗汉果三萜皂甙Ⅵ的制备，具体包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎、称重，按罗汉果与水质量比为1:6的比例加 入水，在95℃的温度下搅拌提取2个小时，离心收集上清液，将沉 淀重复搅拌提取2次，每次均离心收集上清液，合并上清液以得到 提取液；

2)向上述提取液中加入作为絮凝剂的壳聚糖，除去所述提取液 中的鞣质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；

3)采用XAD-16树脂对上述水溶液进行吸附，然后用50％的 乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液；

4)将上述水-乙醇混合溶液进行减压浓缩，并回收乙醇，浓缩 至膏状的浸膏并称重，向该浸膏中加入4倍质量的去离子水来稀释 浸膏，以得到粗品罗汉果三萜皂甙水溶液；

5)采用DiaionPA树脂对上述粗品罗汉果三萜皂甙水溶液进行 脱色处理，收集下注液，得到富集液，再利用半制备液相色谱分离 制得纯度大于98％的罗汉果三萜皂甙Ⅵ，其中半制备液相色谱的色 谱条件为：色谱柱为反相C18柱(其为非极性色谱柱)，紫外检测 波长为214nm；流动相为乙腈-水，梯度洗脱0-20min40％乙腈， 20-40min50％乙腈，40-60min60％乙腈；流速为1.0mL/min；柱温 25℃；将保留时间为22min的洗脱液收集，得到罗汉果三萜皂甙Ⅵ。

2、罗汉果三萜皂甙Ⅵ对胰腺癌PANC-1细胞中Bax、Bcl-2的 影响。

利用蛋白免疫印迹法检测皂甙VI对PANC-1细胞Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响。将PANC-1肿瘤细胞接种至6孔板，用不同浓度 药物处理24h。将肿瘤细胞收集、裂解，提取细胞总蛋白，以牛血 清蛋白为标准品，采用BCA法测定蛋白含量。按每个样品50μg上 样，通过电泳分离蛋白质。蛋白质经电泳分离后，将蛋白质转移至 聚偏氟乙烯膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，将一抗与膜4℃孵育过 夜，用TBST洗涤15min/次×3次。加相应二抗，在室温孵育45min， 用TBST液洗去二抗，15min/次×3次。PVDF膜置于保鲜膜上，将 ECL工作液覆盖到膜表面，室温孵育5min，感光，扫描，检测Bax、 Bcl-2，β-actin蛋白表达水平。

研究表明肿瘤中Bax的表达可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感 性，Bax的表达可增强胰腺癌对吉西他滨和5-FU等化疗药物的敏 感性，因此提高了Bax的表达，是提高化疗效果的有效途径；Bcl-2 家族是细胞凋亡关键调控物质，Bcl-2基因的下调能促进肿瘤细胞凋 亡。利用蛋白免疫杂交(蛋白印迹，Westernblot)分别对不同肿瘤 细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况进行测定。结果显示通过提高罗 汉果三萜皂甙Ⅵ的浓度能上调肿瘤细胞中Bax蛋白和下调肿瘤细胞 中Bcl-2蛋白的表达。图1示出了本发明实施例1提供的罗汉果三 萜皂甙Ⅵ调控胰腺癌细胞PANC-1中Bax、Bcl-2蛋白的蛋白免疫杂 交结果，参见图1，蛋白免疫杂交结果表明，罗汉果三萜皂甙Ⅵ能 具有上调胰腺癌细胞PANC-1中Bax蛋白，下调肿瘤细胞中Bcl-2 蛋白的作用，说明罗汉果三萜皂甙Ⅵ具有增强化疗药物对胰腺癌细 胞PANC-1敏感性的分子调控基础。

3、药物对肿瘤细胞的抑制

取对数生长期的胰腺癌细胞PANC-1，细胞浓度调整为1×10⁶个/L，以每孔100μL接种于96孔细胞培养板中预培养24h。根据加 样不同分组为空白对照组、皂甙组、单药组、联合用药组，板孔中 加入含不同浓度药物的培养液100μL，以DMSO培养的肿瘤细胞作 对照组。细胞分别培养24h后，每孔加入15μL浓度为5mg/mL的 MTT液，继续培养4h后，终止培养，吸去培养液；每孔加150μL 的DMSO，摇床震荡10min，使结晶物溶解。利用酶联免疫检测仪 检测，于490nm处测量各孔的吸光值，依据OD值计算抑制率。

实验分组:(1)空白对照组：不加入任何药物；(2)皂甙组： 用罗汉果三萜皂甙Ⅵ单独处理细胞24h；(3)单药组：吉他西滨单 独处理细胞24h；(4)联合组：罗汉果三萜皂甙Ⅵ(10μmol/L)、吉 他西滨共同处理24h。图2示出了本发明实施例1提供的罗汉果三 萜皂甙Ⅵ与吉他西滨联合抑制胰腺癌的结果，参见图2，从药物抑 制肿瘤细胞PANC-1的结果可以看出，联合组(皂甙Ⅵ+吉他西滨) 的抑制效果显著高于单药组(吉他西滨)(P<0.05)。

4、药物敏感性的测定

MTT法检测各组药物对胰腺癌细胞的抑制率，方法、步骤同上。 本实验重复3次。然后根据金氏公式分析药物合用效应：

金氏公式：Q＝E_(A+B)/(E_A+E_B－E_A·E_B)。其中，公式中E_(A+B)表示联合用药后的抑制率，E_A表示使用单独使用药物A时的抑制 率，E_B表示单独使用药物B时的抑制率。利用Q值来评价两种药 物的联合作用效果，检测结果见表1。

表1罗汉果三萜皂甙Ⅵ联合吉他西滨对胰腺癌细胞PANC-1增 殖的抑制作用

Q：0.85-1.15，表示两药合用效果为单纯相加(+)；

Q：1.15-2.0，表示两药有协同作用，且药物作用增强(++)；

Q：>2，表示两药有协同作用，且药物作用明显增强作用(+++)；

Q：<0.85，表示药物拮抗(-)。

应用低剂量的罗汉果三萜皂甙Ⅵ和吉他西滨化疗药物联合应用 后，能够增加胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性，提高了对胰腺癌细 胞的抑制效果，联合用药组与单药组比较，联合用药组具有更强的 抑制肿瘤细胞增殖的作用。为了评估两药联合应用效果，我们选择 10μmol/L皂甙Ⅵ分别与不同浓度的吉他西滨联合应用，结果表明， 罗汉果三萜皂甙Ⅵ与吉他西滨联合用药组Q值均大于1.15，表明二 者发生了协同作用，增强了药效，其中10μmol/L罗汉果三萜皂甙Ⅵ 和10μmol/L吉他西滨联合用药组使吉他西滨对PANC-1的抑制率从 单独用药时的39.66％提高到联合用药时的81.67％，Q值为1.69， 两药合用表现为明显增强。综合以上提示，罗汉果三萜皂甙Ⅵ作为 与化疗药物联合使用，低剂量即可发挥协同作用，既可以发挥较显 著的抑制胰腺癌细胞增殖效应，又能有效降低化疗药物剂量，从而 可能提高患者的疗效，具有实际的应用价值。

实施例2罗汉果三萜皂甙Ⅴ(以下可简称为皂甙Ⅴ)对肝癌 细胞SMMC-7721的增敏效果

1、罗汉果三萜皂甙Ⅴ的制备，具体包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎、称重，按罗汉果与水质量比为1:8的比例加 入水，在88℃的温度下搅拌提取3个小时，离心收集上清液，将沉 淀重复搅拌提取1次，每次均离心收集上清液，合并上清液以得到 提取液；

2)向上述提取液中加入絮凝剂壳聚糖，除去所述提取液中的鞣 质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；

3)采用XAD-16树脂对上述水溶液进行吸附，然后用40％的 乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液；

4)将上述水-乙醇混合溶液进行减压浓缩，并回收乙醇，浓缩 至膏状的浸膏并称重，向该浸膏中加入3倍质量的去离子水来稀释 浸膏，以得到粗品罗汉果三萜皂甙水溶液；

5)采用DiaionPA树脂对上述粗品罗汉果三萜皂甙水溶液进行 脱色处理，收集下注液，得到富集液，再利用半制备液相色谱分离 制得纯度大于98％的罗汉果三萜皂甙Ⅴ，其中半制备液相色谱的色 谱条件为：色谱柱为反相C18柱(其为非极性色谱柱)，紫外检测 波长为214nm；流动相为乙腈-水，梯度洗脱0-20min40％乙腈， 20-40min50％乙腈，40-60min60％乙腈；流速为1.0mL/min；柱温 25℃；将保留时间为27min的洗脱液收集，得到罗汉果三萜皂甙Ⅴ。

2、罗汉果三萜皂甙Ⅴ对肝癌细胞中Bax、Bcl-2的影响

利用蛋白免疫印迹法检测皂甙Ⅴ对Bax、Bcl-2蛋白表达的影 响。SMMC-7721细胞接种至6孔板，用不同浓度皂甙Ⅴ处理24h。 将肿瘤细胞收集、裂解，提取细胞总蛋白，以牛血清蛋白为标准品， 采用BCA法测定蛋白含量。按每个样品50μg上样，通过电泳分离 蛋白质。蛋白质经电泳分离后，将蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜上， 5％脱脂奶粉室温封闭1h，将一抗与膜4℃孵育过夜，用TBST洗涤 15min/次×3次。加相应二抗，在室温孵育45min，用TBST液洗去 二抗，15min/次×3次。PVDF膜置于保鲜膜上，将ECL工作液覆 盖到膜表面，室温孵育5min，感光，扫描，检测Bax、Bcl-2、β-actin 蛋白表达水平。

上调Bax的表达可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，因此， 提高Bax的表达是提高化疗效果的有效途径；Bcl-2家族是细胞凋 亡关键调控物质，Bcl-2基因的下调能促进肿瘤细胞凋亡。

图3示出了本发明实施例2提供的罗汉果三萜皂甙Ⅴ调控肝癌 细胞中Bax、Bcl-2蛋白的蛋白免疫杂交结果，参见图3，蛋白免疫 杂交结果表明，皂甙Ⅴ能上调肝癌细胞SMMC-7721中Bax蛋白， 下调肿瘤细胞中Bcl-2蛋白，提高皂甙Ⅴ浓度可上调肝癌细胞 SMMC-7721中Bax蛋白，下调肿瘤细胞中Bcl-2蛋白，说明皂甙Ⅴ 具有增强化疗药物对肝癌细胞SMMC-7721敏感性的效力。

3、药物对肿瘤细胞SMMC-7721的抑制

取对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721，细胞浓度调整为1×10⁶个/L，以每孔100μL接种于96孔细胞培养板中预培养24h。根据加 样不同分组为空白对照组、皂甙组、单药组、联合组，板孔中加入 含不同浓度药物的培养液100μL，以DMSO培养的肿瘤细胞作对照 组。细胞分别培养24h后，每孔加入15μL浓度为5mg/mL的MTT 液，继续培养4h后，终止培养，吸去培养液；每孔加150μL的DMSO， 摇床震荡10min，使结晶物溶解。利用酶联免疫检测仪检测，于490 nm处测量各孔的吸光值，依据OD值计算抑制率。

实验分组:(1)空白对照组：不加入任何药物；(2)皂甙组： 用皂甙Ⅴ单独处理细胞24h；(3)单药组：顺铂单独处理细胞24h； (4)联合组：皂甙Ⅴ(10μmol/L)、顺铂共同处理24h。图4示出 了本发明实施例2提供的罗汉果三萜皂甙Ⅴ与顺铂联合抑制肝癌的 结果，参见图4，从药物抑制肝癌细胞的结果可以看出，联合组(皂 甙Ⅴ+顺铂)的抑制效果显著高于单药组(顺铂)(P<0.05)。

4、药物敏感性的测定

MTT法检测各组药物对SMMC-7721细胞的抑制率，方法、步 骤同上。本实验重复3次。然后根据金氏公式分析药物合用效应：

金氏公式：Q＝E_(A+B)/(E_A+E_B－E_A·E_B)。其中，公式中E_(A+B)表示联合用药后的抑制率，E_A表示使用单独使用药物A时的抑制 率，E_B表示单独使用药物B时的抑制率。利用Q值来评价两种药 物的联合作用效果，检测结果见表2。

表2罗汉果三萜皂甙Ⅴ联合顺铂对肝癌细胞SMMC-7721增殖 的抑制作用

Q：0.85-1.15，表示两药合用效果为相加(+)；

Q：1.15-2.0，表示两药有协同作用，且药物作用增强(++)；

Q：>2，表示两药有协同作用，且药物作用明显增强作用(+++)；

Q：<0.85，表示药物拮抗(-)。

应用低剂量的罗汉果三萜皂甙Ⅴ和顺铂联合应用后，能够增加 肝癌细胞对化疗药物的敏感性，提高了对肝癌细胞的抑制效果，联 合用药组与单药组比较，联合用药组具有更强的抑制肿瘤细胞增殖 的作用。为了评估两药联合应用效果，我们选择5μmol/L皂甙Ⅴ分 别与不同浓度的顺铂联合应用，结果表明，罗汉果三萜皂甙Ⅴ与顺 铂联合用药组Q值均大于1.15，表明二者发生了协同作用，增强了 药效，其中5μmol/L罗汉果三萜皂甙Ⅴ和4μmol/L顺铂联合用药组 使顺铂对SMMC-7721的抑制率从单独用药时的13.19％提高到联合 用药时的51.79％，Q值为2.17，两药合用表现为明显增强。综合以 上提示，罗汉果三萜皂甙Ⅴ作为与化疗药物联合使用，低剂量即可 发挥协同作用，既可以发挥较显著的抑制肝癌细胞增殖效应，又能 有效降低化疗药物剂量，从而可能提高患者的疗效，具有实际的应 用价值。

实施例3罗汉果三萜皂甙Ⅳ对逆转白血病耐药

1、罗汉果三萜皂甙Ⅳ(以下可简称为皂甙Ⅳ)的制备，具体包

括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎、称重，按罗汉果与水质量比为1:6的比例加 入水，在80℃的温度下搅拌提取3个小时，离心收集上清液，将沉 淀重复搅拌提取3次，每次均离心收集上清液，合并上清液以得到 提取液；

2)向上述提取液中加入絮凝剂壳聚糖，除去所述提取液中的鞣 质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；

3)采用XAD-16树脂对上述水溶液进行吸附，然后用30％的 乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液；

4)将上述水-乙醇混合溶液进行减压浓缩，并回收乙醇，浓缩 至膏状的浸膏并称重，向该浸膏中加入5倍质量的去离子水来稀释 浸膏，以得到粗品罗汉果三萜皂甙水溶液；

5)采用DiaionPA树脂对上述粗品罗汉果三萜皂甙水溶液进行 脱色处理，收集下注液，得到富集液，再利用半制备液相色谱分离 制得纯度大于98％的罗汉果三萜皂甙Ⅳ，其中半制备液相色谱的色 谱条件为：色谱柱为反相C18柱(其为非极性色谱柱)，紫外检测 波长为214nm；流动相为乙腈-水，梯度洗脱0-20min40％乙腈， 20-40min50％乙腈，40-60min60％乙腈；流速为1.0mL/min；柱温 25℃；将保留时间为35min的洗脱液收集，得到罗汉果三萜皂甙Ⅳ。

2、罗汉果三萜皂甙Ⅳ对白血病耐药株HL-60/ADR细胞中 p-ERK1/2的影响。

利用蛋白免疫印迹法检测皂甙Ⅳ对耐药株HL-60/ADR细胞 p-ERK1/2蛋白表达的影响。肿瘤细胞接种至6孔板，用不同浓度药 物处理24h。将肿瘤细胞收集、裂解，提取细胞总蛋白，以牛血清 蛋白为标准品，采用BCA法测定蛋白含量。按每个样品50μg上样， 通过电泳分离蛋白质。蛋白质经电泳分离后，将蛋白质转移至聚偏 氟乙烯膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，将一抗与膜4℃孵育过夜， 用TBST洗涤15min/次×3次。加相应二抗，在室温孵育45min， 用TBST液洗去二抗，15min/次×3次。PVDF膜置于保鲜膜上， 将ECL工作液覆盖到膜表面，室温孵育5min，感光，扫描，检测 p-ERK1/2，β-actin蛋白表达水平。

文献报道抑制ERK信号通路过表达是提高耐药肿瘤细胞化疗 效果的有效途径。利用Westernblot法测定了皂甙Ⅳ对HL-60/ADR 细胞中p-ERK蛋白的表达情况。

图5示出了本发明实施例3提供的罗汉果三萜皂甙Ⅳ调控白血 病耐药株HL-60/ADR细胞中p-ERK1/2蛋白的蛋白免疫杂交结果。 如图5所示，皂甙Ⅳ具有抑制HL-60/ADR细胞中ERK1/2磷酸化的 作用，随皂甙Ⅳ的浓度的升高，HL-60/ADR细胞中p-ERK1/2蛋白 的表达呈下降趋势，说明皂甙Ⅳ具有抑制ERK信号通路的作用，而 ERK的过表达与肿瘤耐药密切相关，皂甙Ⅳ可能通过抑制ERK磷 酸化来增强白血病对药物的敏感性。多项研究显示，ERK通路的过 表达与肿瘤的化疗耐药存在正相关的关系。在绝大多数急性白血病 细胞中，均有ERK高表达。通过阻抑ERK通路，降低磷酸化ERK1/2 蛋白表达水平，进而下调端粒酶活性，可以达到增强白血病、卵巢 癌等多种耐药肿瘤细胞对化疗药物敏感性的目的。

3、药物对肿瘤细胞的抑制

取对数生长期的白血病细胞HL-60/ADR，细胞浓度调整为 1×10⁶个/L，以每孔100μL接种于96孔细胞培养板中预培养24h。 根据加样不同分组为空白对照组、皂甙组、单药组、组合组，板孔 中加入含不同浓度药物的培养液100μL，以DMSO培养的肿瘤细胞 作对照组。细胞分别培养24h后，每孔加入15μL浓度为5mg/mL 的MTT液，继续培养4h后，终止培养，吸去培养液；每孔加150μL 的DMSO，摇床震荡10min，使结晶物溶解。利用酶联免疫检测仪 检测，于490nm处测量各孔的吸光值，依据OD值计算抑制率。

实验分组:(1)空白对照组：不加入任何药物；(2)单药组： 单一药物处理细胞24h；(3)联合用药组：皂甙Ⅳ(10μmol/L)、阿 霉素(或柔红霉素)共同处理24h。从对影响肿瘤细胞耐药性的结 果(参见表3)可以看出，低剂量皂甙Ⅳ和化疗药物(阿霉素或柔 红霉素)联合应用后，与未加皂甙Ⅳ组比较，能够增加耐药细胞株 HL-60/ADR细胞对化疗药物的敏感性，有效降低化疗药物IC50 (P<0.05)，发挥较单药组更强的抑制细胞增殖作用，从而部分逆转 HL-60/ADR细胞多药耐药，皂甙Ⅳ与阿霉素联用时，逆转倍数达 5.31；皂甙Ⅳ与柔红霉素联用时，逆转倍数为2.84，由此可见，低 剂量皂甙Ⅳ能够提高多药耐药白血病细胞对化疗药物的敏感性，部 分逆转HL-60/ADR细胞多药耐药，说明皂甙Ⅳ是一种高效的白血 病化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂。

由上可见，本发明实施例3提供的皂甙Ⅳ与急性白血病化疗药 物的组合能够作为化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂在抗急性白血 病中的应用。本发明实施例3提供的一种低细胞毒性剂量(＜IC20) 皂甙Ⅳ与化疗药物阿霉素(ADR)或柔红霉素(DNR)组合具有抗 HL-60/ADR多药耐药细胞增殖的作用。P-ERK的降低能增强对柔红 霉素的敏感性。

表3罗汉果三萜皂甙Ⅳ与化疗药物联合应用对HL-60/ADR细 胞耐药性的影响结果

实施例4罗汉果三萜皂甙Ⅲ(可简称皂甙Ⅲ)对逆转乳腺癌 MCF-7ADR耐药株的效果

1、罗汉果三萜皂甙Ⅲ的制备，具体包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎、称重，按罗汉果与水质量比为1:7的比例加 入水，在90℃的温度下搅拌提取1个小时，离心收集上清液，将沉 淀重复搅拌提取4次，每次均离心收集上清液，合并上清液以得到 提取液；

2)向上述提取液中加入絮凝剂壳聚糖，除去所述提取液中的鞣 质和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；

3)采用XAD-16树脂对上述水溶液进行吸附，然后用45％的 乙醇进行洗脱，得到富集罗汉果三萜皂甙的水-乙醇混合溶液；

4)将上述水-乙醇混合溶液进行减压浓缩，并回收乙醇，浓缩 至膏状的浸膏并称重，向该浸膏中加入6倍质量的去离子水来稀释 浸膏，以得到粗品罗汉果三萜皂甙水溶液；

5)采用DiaionPA树脂对上述粗品罗汉果三萜皂甙水溶液进行 脱色处理，收集下注液，得到富集液，再利用半制备液相色谱分离 制得纯度大于98％的罗汉果三萜皂甙Ⅲ，其中半制备液相色谱的色 谱条件为：色谱柱为反相C18柱(其为非极性色谱柱)，紫外检测 波长为214nm；流动相为乙腈-水，梯度洗脱0-20min40％乙腈， 20-40min50％乙腈，40-60min60％乙腈；流速为1.0mL/min；柱温 25℃；将保留时间为41min的洗脱液收集，得到罗汉果三萜皂甙Ⅲ。

2、罗汉果三萜皂甙Ⅲ对耐药乳腺癌细胞MCF-7ADR中p-ERK 的影响

利用蛋白免疫印迹法检测皂甙Ⅲ对MCF-7ADR细胞中 p-ERK1/2蛋白表达的影响。MCF-7ADR肿瘤细胞接种至6孔板， 用不同浓度皂甙Ⅲ处理24h。将肿瘤细胞收集、裂解，提取细胞总 蛋白，以牛血清蛋白为标准品，采用BCA法测定蛋白含量。按每个 样品50μg上样，通过电泳分离蛋白质。蛋白质经电泳分离后，将 蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜上，5％脱脂奶粉室温封闭lh，将一抗 与膜4℃孵育过夜，用TBST洗涤15min/次×3次。加相应二抗， 在室温孵育45min，用TBST液洗去二抗，15min/次×3次。PVDF 膜置于保鲜膜上，将ECL工作液覆盖到膜表面，室温孵育5min， 感光，扫描，检测p-ERK，β-actin蛋白表达水平。

文献报道抑制ERK信号通路过表达是提高耐药肿瘤细胞化疗 效果的有效途径。利用Westernblot考察了皂甙Ⅲ对MCF-7ADR细 胞中p-ERK蛋白的表达情况进行测定。

图6示出了本发明实施例4提供的罗汉果三萜皂甙Ⅲ调控乳腺 癌MCF-7ADR细胞中p-ERK蛋白的蛋白免疫杂交结果。如图6所 示，皂甙Ⅲ具有抑制MCF-7ADR细胞中ERK磷酸化的作用，随皂 甙Ⅲ的浓度的升高，MCF-7ADR细胞中p-ERK1/2蛋白的表达呈下 降趋势，说明皂甙Ⅲ具有抑制ERK信号通路的作用，而ERK的过 表达与肿瘤耐药密切相关，皂甙Ⅲ可能通过抑制ERK磷酸化来增强 乳腺癌细胞对药物的敏感性。多项研究显示，ERK通路的过表达与 肿瘤的化疗耐药存在正相关的关系。在绝大多数乳腺癌细胞中，均 有ERK高表达。通过阻抑ERK通路，降低磷酸化ERK1/2蛋白表 达水平，进而下调端粒酶活性，可以达到增强白血病、乳腺癌、卵 巢癌等多种耐药细胞对化疗药物敏感性的目的。

3、药物对肿瘤细胞的抑制

取对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7ADR，细胞浓度调整为 1×10⁶个/L，以每孔100μL接种于96孔细胞培养板中预培养24h。 根据加样不同分组为空白对照组、皂甙组、药物组、组合组，板孔 中加入含不同浓度药物的培养液100μL，以DMSO培养的肿瘤细胞 作对照组。细胞分别培养24h后，每孔加入15μL浓度为5mg/mL 的MTT液，继续培养4h后，终止培养，吸去培养液；每孔加150μL 的DMSO，摇床震荡10min，使结晶物溶解。利用酶联免疫检测仪 检测，于490nm处测量各孔的吸光值，依据OD值计算抑制率。

实验分组:(1)空白对照组：不加入任何药物；(2)单药组： 单一药物处理细胞24h；(3)联合用药组：皂甙Ⅲ(10μmol/L)、阿 霉素(或紫杉醇)共同处理24h。从对影响肿瘤细胞耐药性的结果 (参见表4)可以看出，低剂量皂甙Ⅲ和化疗药物(阿霉素或紫杉 醇)联合应用后，与未加皂甙Ⅲ组比较，能够增加耐药细胞株 MCF-7ADR细胞对化疗药物的敏感性，有效降低化疗药物IC50 (P<0.05)，发挥较单药组表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用，从 而部分逆转MCF-7ADR细胞多药耐药性，皂甙Ⅲ与阿霉素联用时， 逆转倍数为2.01；皂甙Ⅲ与紫杉醇联用时，逆转倍数为1.69，由此 可见，低剂量皂甙Ⅲ能够提高乳腺癌多药耐药细胞对化疗药物的敏 感性，部分逆转MCF-7ADR细胞多药耐药，说明皂甙Ⅲ是一种高 效的乳腺癌化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂。

表4罗汉果三萜皂甙Ⅲ与化疗药物联合应用对MCF-7ADR细 胞耐药性的影响结果

实施例5罗汉果三萜皂甙盐A(以下可简称为皂甙盐A)对逆 转肺癌PC9耐药株的效果

取对数生长期的肺癌PC9耐药株，细胞浓度调整为1×10⁶个/L， 以每孔100μL接种于96孔细胞培养板中预培养24h。根据加样不同 分组为空白对照组、皂甙组、药物组、组合组，板孔中加入含不同 浓度药物的培养液100μL，以DMSO培养的肿瘤细胞作对照组。细 胞分别培养24h后，每孔加入15μL浓度为5mg/mL的MTT液，继 续培养4h后，终止培养，吸去培养液；每孔加150μL的DMSO， 摇床震荡10min，使结晶物溶解。利用酶联免疫检测仪检测，于 490nm处测量各孔的吸光值，依据OD值计算抑制率。

实验分组:(1)空白对照组：不加入任何药物；(2)单药组： 单一药物处理细胞24h；(3)联合用药组：皂甙盐A(10μmol/L)、 吉非替尼共同处理24h。从对影响肿瘤细胞耐药性的结果(参见表5) 可以看出，低剂量皂甙盐A和化疗药物吉非替尼联合应用后，与未 加皂甙盐A组比较，能够增加耐药细胞株PC9细胞对化疗药物的敏 感性，有效降低化疗药物IC50(P<0.05)，发挥较单药组表现出更强 的抑制肿瘤细胞增殖作用，从而部分逆转PC9细胞多药耐药性，皂 甙盐A与吉非替尼联用时，逆转倍数为2.12，由此可见，低剂量皂 甙盐A能够提高肺癌耐药细胞对化疗药物的敏感性，部分逆转PC9 耐药株细胞多药耐药，说明皂甙盐A是一种高效的肺癌化疗药物增 敏剂和多药耐药逆转剂。

表5罗汉罗三萜皂甙盐A与化疗药物联合应用对PC9细胞耐 药性的影响结果

综上，本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐能够与化疗药物联 合使用，能够作为化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂，可联合使用 的化疗药物并不限于上述各实施例中的化疗药物，且可用于的肿瘤 细胞也并不限于上述各实施例中的肿瘤细胞，其在肺癌、血癌、结 肠腺癌、淋巴癌、喉癌、黑色素瘤、大肠癌、皮肤癌、肾癌或宫颈 癌中，均具有增敏剂和耐药逆转剂的功效。此外，本发明提供的罗 汉果三萜皂甙及其盐也并不限于上述实施例中的那5种，其他具有 本发明提供的罗汉果三萜皂甙及其盐的通式结构的皂甙和皂甙盐均 具有相似的作用效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。