一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束及其制备方法

摘要

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束极其温和简易的制备方法，首先以胱胺与聚乙二醇二缩水甘油醚通过亲核加成机理进行聚合反应，在水相中一步合成得到胱胺与聚乙二醇结构单元交替出现的超支化聚合物，然后在透析的过程中通过自组装形成超支化纳米胶束。由于该超支化聚合物链段中同时含有叔氨基及双硫键结构单元，因而具有灵敏的pH和还原响应性，同时超支化三维空腔结构赋予纳米胶束优异的载药性能；本发明的纳米胶束生物相容性好，在体内完全降解为小分子，作为抗癌药物载体具有较高的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种可还原降解超支化聚合 物纳米胶束及其制备方法。

背景技术

纳米药物载体可以通过肿瘤组织的高渗透和滞留(EPR)效应实现药物对肿 瘤组织的的被动靶向性，大大提高了药物利用率并降低游离药物对正常组织的 毒副作用。其中聚合物纳米胶束作为药物载体又具有增溶疏水性药物、提高药 物稳定性、缓释药物等优势。

为了达到使药物在肿瘤组织处靶向释放的目的，目前研究较多的是具有环 境智能响应性(如pH、还原电势、酶等)的生物可降解载体。近年来，一些研 究者对具有环境智能响应性超支化聚合物有了较多的研究，发现此类超支化聚 合物具有新颖的结构和独特的性能，如高溶解性、低粘度、内部具有空腔三维 球形结构等，而结构中大量存在的空腔可以在疏水载药的过程中提高药物的载 药量。且超支化聚合物本身在肿瘤细胞环境内受酸或还原性刺激会被降解为无 毒性的小分子并释放出药物。

但是目前文献报导的此类具有环境响应性超支化聚合物的合成方法通常需 要多步来完成，且需要用到大量有机溶剂，因而使此类材料在生物医用应用方 面受到诸多限制。同时目前报道的多数超支化聚合物纳米胶束不具有还原响应 性，不可避免有体内残留。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种在水相中一步法即可合成 具有良好的生物相容性、在体内可完全降解无残留的可还原降解超支化聚合物 纳米胶束及其制备方法。

本发明提供一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束，形成由聚乙二醇和二 硫键交替出现的多核-壳结构。为了制得外围基团全部都是氨基的超支化聚合物， 反应物胱胺的摩尔数调整为聚乙二醇二缩水甘油醚摩尔数的两倍，以保证氨基 过量。聚合物超支化结构及交替出现的聚乙二醇和二硫键具有各自的功能作用： 1)超支化三维空腔结构可以有效提高对疏水性药物的载药率；2)聚乙二醇段 具有优异的生物相容性且柔韧性及亲水性良好，可以作为多核-壳结构胶束的亲 水段；3)胱胺结构单元可以作为多核-壳胶束的疏水段来包载疏水性药物；4) 二硫键在正常细胞非还原性环境中稳定，但在肿瘤还原性环境中发生断裂，使 胶束具有还原响应性。

本发明中采用的聚乙二醇二缩水甘油醚，为了有效平衡超支化聚合物的亲 水性和可成胶束性，选择分子量为352的作为反应物。

本发明还提供一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备方法，依次包 括以下步骤：

1)用氢氧化钠溶液中和胱胺二盐酸盐，得到胱胺；

2)将聚乙二醇二缩水甘油醚和胱胺通过亲核加成反应得到超支化聚合物；

3)将步骤2)得到的超支化聚合物溶液，透析处理得到纳米胶束。

具体的，所述步骤1)中，用40％氢氧化钠溶液中和胱胺二盐酸盐，反应条 件为冰浴，萃取剂为乙醚和四氢呋喃的混合液。

具体的，所述步骤2)中，选用分子量为352的聚乙二醇二缩水甘油醚作为 反应物，可以有效平衡超支化聚合物的亲水性和可成胶束性。

具体的，所述步骤2)中，亲核加成反应的反应条件为60℃油浴锅中加热 24h。

具体的，所述步骤2)中，亲核加成反应体系所选溶剂为去离子水。

具体的，所述步骤3)中，使用截留分子量为3500的透析袋，透析处理不 少于48小时，得到纳米胶束。透析袋的目的在于除去未反应的小分子和低聚物， 因为分子量太低的聚合物不易形成胶束，透析袋有各种规格，选择3500的可达 到目的。

胱胺分子中含两个端氨基，而聚乙二醇二缩水甘油醚分子中含两个端环氧 基团，氨基和环氧基团可以发生典型的亲核加成反应。当参与聚合反应的氨基 基团摩尔数大大过量时，可以得到外围为氨基封端的超支化聚合物。因此本发 明在设计合成配方时，采取胱胺的摩尔数是聚乙二醇二缩水甘油醚摩尔数的两 倍，该超支化聚合物链段中同时含有伯胺、仲胺和叔胺和二硫键结构单元。

本发明还提供一种可还原降解超支化聚合物纳米胶束，在制备化疗药物载 体中的应用。谷胱甘肽是一种含巯基的还原性三肽，其在肿瘤细胞内的浓度比 在体液和正常细胞内高100到1000倍。载药纳米胶束进入肿瘤细胞内，在谷胱 甘肽的还原作用下，聚合物中的双硫键快速断裂，聚合物发生降解，释放出药 物；同时肿瘤细胞内呈弱酸性环境，该纳米胶束含大量的伯胺、仲胺和叔胺， 因此该纳米胶束同时具有pH和还原敏感性，在肿瘤细胞内环境刺激下胶束结 构遭到破坏，促使药物释放。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1.由于该共聚物链段中同时含有伯胺、仲胺和叔胺和二硫键等结构单元， 因而具有灵敏的pH和还原响应性，在肿瘤细胞内部的弱酸性和还原性环境中， 胶束结构遭到破坏，实现药物在病灶处释放；

2.二硫键位于超支化聚合物骨架中，纳米胶束进入肿瘤细胞后，在细胞内 高浓度谷胱甘肽的作用，二硫键断裂，使该纳米胶束在体内完全降解为小分子， 小分子可轻易被肾脏排除出体外，因此作为抗癌药物载体具有实际的应用价值；

3.纳米胶束无细胞毒性，满足人体使用的安全性标准；

4.利用亲核加成水相中一步合成高聚物，方法简便、条件温和，不需要任 何催化剂和其他有机溶剂，无副产物产生，反应完全，产物纯净。

5.超支化聚合物独特的三维空腔结构，有利于提高胶束的载药量。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术 手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附 图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明中胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚反应示意图；

图2为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束的扫描电镜照片，

图中，a、b、c、d分别代表胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚按摩尔比为： 3:1,2:1,2:2,2:3时反应所得到的可还原降解超支化聚合物纳米胶束；

图3为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束在pH7.4下的粒径分布 图，

图中，CP31、CP21、CP22、CP23分别代表胱胺和聚乙二醇二缩水甘油 醚按摩尔比为：3:1,2:1,2:2,2:3时反应所得到的可还原降解超支化聚合物纳米胶 束；

图4为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束在pH7.4下的临界胶束 浓度；图中C为聚合物胶束浓度，单位：mg/mL；胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚 按摩尔比为2:1；

图5为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束在10mM的谷胱甘肽 溶液中不同时间下的粒径变化，

图中，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚按摩尔比为：2:1；

图6为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束溶液的酸碱滴定曲线；

图7为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束直径随pH变化，

图中，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚按摩尔比为：2:1；

图8为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束的细胞毒性结果，

图中，胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚按摩尔比为：2:1；

图9为本发明中可还原降解超支化聚合物纳米胶束所载药物甲氨蝶呤的标 准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以 下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)胱胺二盐酸盐的中和：

称取12.15g粉末状胱胺二盐酸盐溶于16mL去离子水，再加入60mL乙醚 和24mL四氢呋喃，搅拌均匀。冰浴下将40％NaOH溶液(66.7mL)逐滴滴入 上述混合液中，磁力搅拌1h后萃取分离，取上层有机相。再用50mL乙醚及 18mL四氢呋喃的混合溶剂萃取下层水相。合并有机相，称取4gNaOH干燥2h， 过滤后真空旋蒸除去易挥发的乙醚和四氢呋喃，最终得到6.2g无色油状胱胺， 产率为75.5％。

2)超支化聚合物的制备：

将304mg胱胺溶入8mL超纯水中，磁力搅拌使其完全溶解，向其中滴加 聚乙二醇二缩水甘油醚352mg的水溶液(8mL)，在60℃下磁力搅拌反应24h， 得到超支化聚合物。胱胺和聚乙二醇二缩水甘油醚的合成路线如图1所示。胱 胺和聚乙二醇二缩水甘油醚在水溶液中相应的溶解配方比例，如表1所示，本 发明仅提供4种超支化聚合物合成配方。

表1超支化聚合物合成配方一览表

3)可还原降解超支化聚合物纳米胶束的制备：

将步骤2)得到的聚合物溶液倒入透析袋(MWCO3500)中，在超纯水中透析 3d，每隔4h换一次透析液，最终得到超支化聚合物纳米胶束。透析袋的截留 分子量根据具体使用过程可相应调整，通常不低于3500。如图2所示，为可还 原降解超支化聚合物纳米胶束的扫描电镜照片，图中a-d分别对应表1中CP31、 CP21、CP22、CP23四种配方的聚合物，可见该纳米胶束形貌基本为球形，粒 径分布比较均一。

根据注射剂型纳米胶束尺寸不同的应用需要，可以调节胱胺和聚乙二醇二 缩水甘油醚的配比，以得到不同粒径的纳米胶束，如图3所示，随着聚乙二醇 二缩水甘油醚的增加，纳米胶束的粒径增大。由于胱胺：聚乙二醇二缩水甘油 醚的摩尔比＝2：1的情况下，纳米胶束的粒径较为中等且形貌规整，具有代表性， 且不同粒径下纳米胶束的化学性质较为一致，因此，本发明后续实施例中所提 到的纳米胶束，在未特殊说明的情况下，均指该比例下的纳米胶束。

实施例2

可还原降解超支化聚合物纳米胶束临界胶束浓度的测量：

将实施例1中所得可还原降解超支化聚合物纳米胶束CP21溶液配制不同浓 度。移取超支化聚合物溶液4mL，分别加入30μL浓度为1.622×l0^-5g/mL芘的丙 酮溶液，振荡数次，使溶液均匀，待丙酮全部挥发完用荧光分光光度计测定发 射光谱，激发波长设为330nm，激发和发射的狭缝宽度都为5nm，扫描范围λ＝ 350～500nm。通过测定一系列不同浓度纳米粒子溶液的两个峰的荧光强度,并以 浓度对数为X轴，I₁/I₃为Y轴作图，结果见图4。由图4可以看出，聚合物胶束CP21 的CMC值很低，仅为3.98mg/L，故其具有很强的抗稀释能力。

实施例3

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的还原敏感性：

将实施例1中所得可还原降解超支化聚合物纳米胶束CP21置于浓度为10 mmol/L的谷胱甘肽溶液中，其中纳米胶束中胱胺：聚乙二醇二缩水甘油醚＝2:1， 在不同时间用激光光散射仪测试纳米胶束的粒径变化，观察还原响应性；结果 如图5所示，纳米胶束在含10mmol/L的谷胱甘肽(GSH)溶液中，6小时后粒 径变小，说明大部分二硫键断裂，胶束结构遭到破坏。

实施例4

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的pH敏感性：

1)取50mg实施例1中所得冷冻干燥后的可还原降解超支化聚合物CP21 溶于5mL150mmol/LNaCl溶液中，缓慢滴加1.0mol/LHCl溶液调节pH至2.0， 接着用0.1mol/LNaOH溶液滴定溶液，绘制滴定曲线，其中，5mL150mmol/L NaCl溶液作为对照组。结果如图6所示，NaCl溶液无缓冲平台，故其几乎无 pH缓冲能力；而超支化聚合物溶液的酸碱滴定曲线在pH由7.4降至5.0期间呈 平缓下降，且随着胱胺用量的增加，这种缓冲能力得到明显提升，在图6上表 现为曲线坡度更为平缓。因此，超支化聚合物具有很好的pH响应能力。

2)以实施例1中所得冷冻干燥后的可还原降解超支化聚合物CP21为研究对 象。分别采用0.1mol/L的HCl(aq)和0.1mol/L的NaOH(aq)调节pH在2-12的范围 内，由DLS测定其粒径及粒径分布。其中纳米胶束中胱胺：聚乙二醇二缩水甘油 醚＝2:1。如图7所示，聚合物在极碱和极酸条件下，粒径改变不大；而当聚合物 由中性pH＝7.4进入到肿瘤处溶酶体pH＝5.0环境下，粒径由119nm增大至260.7nm， 这是因为聚合物骨架结构中大量存在的叔胺、仲胺、伯胺基团在酸性条件下会 大量吸附质子氢，整个聚合物高度正电性，内部的静电斥力使其体积膨胀粒径 增大。

实施例5

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的生物相容性：

以实施例1中所得冷冻干燥后的可还原降解超支化聚合物CP21为研究对 象。用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基将3T3细胞和Hela细胞分别种植于 96孔板上(1×10⁴cells/mL)，37℃下培养24h后弃去培养液，向孔中加入100μL 不同浓度的空白胶束，每组设6个复孔，培养24h后弃去培养基，每孔加入20 μLMTT溶液，继续培养4h后，弃去培养板中的溶液，每孔加入150μLDMSO， 摇匀，用酶标仪于570nm处测定吸光度，并计算细胞存活率。如图8所示，3T3 和Hela两种细胞在不同浓度的纳米胶束溶液中的存活率在92％～110％之间， 在相同条件下两种细胞的存活率数据比较接近；随着纳米胶束浓度的增加，细 胞存活率虽有所下降，但是总体上均大于90％，符合生物相容性的标准。

实施例6

可还原降解超支化聚合物纳米胶束的载药性能：

以实施例1中所得冷冻干燥后的可还原降解超支化聚合物CP21为研究对 象。

1)载药胶束的制备：

取0.5mg/mL超支化聚合物溶液20mL，向其中添加0.1mg/mL甲氨蝶呤 溶液10mL，室温下避光磁力搅拌24h后转入透析袋(MWCO3500)透析24h， 每隔3h换一次透析液，将载药胶束用0.45μm微孔滤膜避光过滤，所得产物为 淡黄色。

2)超支化聚合物胶束的载药率：

准确称取经透析并冷冻干燥后的载药聚合物胶束的质量，溶解在DMSO 中，超声1h，在容量瓶中定容至10mL，用紫外光度计在388nm处测其吸光度， 通过甲氨蝶呤在标准曲线(如图9所示)的线性方程计算出药物在DMSO中的 浓度，并通过下列公式计算出聚合物胶束的载药率。

载药率：$LR\left(\%\right)=\frac{W_D}{W_S}\times 100\%$

式中，W_D——载药胶束中药物的质量，mg；

W_S——载药胶束的质量，mg；

经计算，超支化聚合物CP21对甲氨蝶呤的载药率(LR)为10.32wt％。可 见聚合物超支化三维空腔结构可以大大提高胶束的载药率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还 可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。