转基因马铃薯AV43-6-G7品系鉴定的引物、探针和方法

摘要

本发明公开了一种转基因马铃薯AV43-6-G7品系鉴定的引物、探针和方法，引物和探针序列是：上游引物Potato？AV43-6-G7？primerF：5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3’；下游引物Potato？AV43-6-G7？primerR：5’-tgtcgtgccagctgcatta-‘3；探针Potato？AV43-6-G7？Probe？：5’-FAM-？cccgcgcgttggccgat-3’？BHQ。鉴定方法包括产品DNA的提取、特异性基因的实时荧光PCR扩增和使用荧光定量PCR仪随机软件分析扩增结果并进行结果判定。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低。

说明书

技术领域

本发明属于转基因产品检测鉴定技术，具体地说是使用实时荧光PCR技术进行转基因马铃薯AV43-6-G7品系鉴定的方法。

背景技术

自从转基因番茄首次被批准于1994年，数量和生产转基因（GM）作物的不断增加。按照国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA），转基因品种已经被广泛开发与应用。为保护消费者的知情权，许多国家都制定立法，以确定转基因生物成分的阈值水平。用于混合在饲料转基因生物和食品的阈值水平在欧盟为0.9％，在韩国3％，在日本，1％。为了符合转基因生物标识管理规定，并保证产品的合法性和可追溯性，转基因产品的品系检测方法是转基因识别和量化是必不可少的。

马铃薯是最早研究成功转基因植物之一。基因转移技术在马铃薯应用的主要目的包括改善土豆的质量，增强抗病虫害等。1997年之前，孟山都公司在美国开发了抗鞘翅目害虫和马铃薯卷叶病毒的转基因马铃薯。近来，越来越商业化转基因马铃薯的特征集中在提高马铃薯淀粉特性，如转基因马铃薯Amflora转基因土豆AM04-1020。这些转基因马铃薯生产通过基因编码的颗粒结合淀粉合成酶I（GBSSI）的反义抑制直链淀粉的淀粉生成。这些改进的功能将被用在造纸和纺织技术方面和食品工业中。转基因马铃薯性状AV43-6-G7在这项研究中是一个淀粉改良的转基因马铃薯品系，其目的是用于淀粉分离的淀粉产业和淀粉可经历进一步的处理。

发明内容

本发明测定了转基因马铃薯AV43-6-G7外源基因片段的侧翼序列。并根据所确定的序列信息设计了一对引物和Taqman探针以检测外源基因片段和马铃薯内源基因的交界区域。建立了一个特异性检测转鉴定基因马铃薯AV43-6-G7品系的方法。

所述引物序列是：

上游引物PotatoAV43-6-G7primerF：5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3’；

下游引物PotatoAV43-6-G7primerR：5’-tgtcgtgccagctgcatta-‘3；

探针PotatoAV43-6-G7Probe：5’-FAM-cccgcgcgttggccgat-3’BHQ。

转基因马铃薯AV43-6-G7品系鉴定鉴定方法包括产品DNA的提取、特异性基因的实时荧光PCR扩增和使用荧光定量PCR仪随机软件分析扩增结果并进行结果判定。

本发明涉及的转基因马铃薯AV43-6-G7品系鉴定，其中的试剂包括如下：

（1）PCR扩增反应液A

包括1×PCRMasterMix(内含热启动的TaqDNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物；

上游引物PotatoAV43-6-G7primerF（5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3’），下游引物PotatoAV43-6-G7primerR（5’-tgtcgtgccagctgcatta-‘3），探针PotatoAV43-6-G7Probe（5’-FAM-cccgcgcgttggccgat-3’BHQ）

其中上游引物、下游引物和探针比例：2：2：1；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。

（2）阳性对照DNA

上面所述PCR扩增反应液A，每管24μL的最佳组成为：1×PCRMasterMix(内含热启动的TaqDNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上、下游引物，200nmol/L探针。

使用上述方法鉴定转基因马铃薯AV43-6-G7品系，依次包括下列步骤（1）-（3）：

（1）待检样品DNA的提取

DNA提取可使用CTAB法。

（2）转基因马铃薯AV43-6-G7品系来源基因的实时荧光PCR扩增

A.在装有24μLPCR扩增反应液A的反应管中加入1μL待检样品DNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃15min，1个循环预变性；

95℃15sec，59℃1min，40个循环。

（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。

有PCR扩增曲线且Ct值≤38判定为检出，无PCR扩增曲线或者PCR扩增曲线但有Ct值>38判定为未检出。

本发明的有益效果：

本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低。

附图说明

图1是转基因品系AV43-6-G7马铃薯粉的荧光PCR图谱。

图2是50%浓度转基因品系AV43-6-G7马铃薯粉的荧光PCR图谱。

图3是转基因AV43-6-G7品系马铃薯粉浓度梯度样品的荧光PCR图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

按下述方法检测转基因马铃薯AV43-6-G7品系的马铃薯块茎粉做用作阳性对照。使用98140转基因玉米粉、DAS-40278-9转基因玉米粉、305423转基因大豆粉、MON87701转基因大豆粉、MON87708转基因大豆粉、3218转基因大豆粉、PH05转基因马铃薯粉、AM04转基因马铃薯粉、非转基因大豆粉、非转基因马铃薯粉和非转基因玉米粉作为实验的阴性对照：

包括1×PCRMasterMix(内含热启动的TaqDNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物；

上游引物PotatoAV43-6-G7primerF（5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3’），下游引物PotatoAV43-6-G7primerR（5’-tgtcgtgccagctgcatta-‘3），探针PotatoAV43-6-G7Probe（5’-FAM-cccgcgcgttggccgat-3’BHQ）。其中上游引物、下游引物和探针比例：2：2：1；其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。

按照以下程序进行检测：

（1）待测样品DNA的提取

A.称取经过预处理的待测样本1.00g至50mL离心管中。

B.加入10mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNaseA酶（使其终浓度为10μg/mL），颠倒混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2~3次；12000g离心10min，转移1mL上清液至2mL离心管中。

C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000g离心10min，转移上清液600μL至2mL离心管中。

D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1h；12000g离心10min，弃去上清液。

E.向沉淀中加入400μL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5mL离心管。

F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心10min，转移上层水相至1.5mL离心管中。

G.加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30min；12000g离心10min，小心弃去上清液。

H.加入500μL70%乙醇，震荡离心柱管，12000g离心10min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。

I.加入100μLTE溶液溶解DNA，4℃保存备用。

（2）待测样品DNA的实时荧光PCR扩增

A.在PCR反应管中加入24μLPCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃15min，1个循环预变性；

95℃15sec，59℃1min，40个循环。

（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。

结果如图1。转基因马铃薯AV43-6-G7品系块茎粉有PCR扩增曲线且Ct值为26.2判定为检出，其他阴性对照无PCR扩增曲线判定为未检出。

实施例2

按下述方法检测转基因马铃薯AV43-6-G7品系的马铃薯块茎粉与等重量的非转基因马铃薯粉混合均匀做用作阳性对照。使用98140转基因玉米粉、DAS-40278-9转基因玉米粉、305423转基因大豆粉、MON87701转基因大豆粉、MON87708转基因大豆粉、3218转基因大豆粉、PH05转基因马铃薯粉、AM04转基因马铃薯粉、非转基因大豆粉和非转基因玉米粉作为实验的阴性对照：

包括1×PCRMasterMix(内含热启动的TaqDNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物；

上游引物PotatoAV43-6-G7primerF（5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3’），下游引物PotatoAV43-6-G7primerR（5’-tgtcgtgccagctgcatta-‘3），探针PotatoAV43-6-G7Probe（5’-FAM-cccgcgcgttggccgat-3’BHQ）。其中上游引物、下游引物和探针比例：2：2：1；其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。

按照以下程序进行检测：

（1）待测样品DNA的提取

A.称取经过预处理的待测样本1.00g至50mL离心管中。

B.加入10mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNaseA酶（使其终浓度为10μg/mL），颠倒混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2~3次；12000g离心10min，转移1mL上清液至2mL离心管中。

C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000g离心10min，转移上清液600μL至2mL离心管中。

D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1h；12000g离心10min，弃去上清液。

E.向沉淀中加入400μL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5mL离心管。

F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心10min，转移上层水相至1.5mL离心管中。

G.加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30min；12000g离心10min，小心弃去上清液。

H.加入500μL70%乙醇，震荡离心柱管，12000g离心10min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。

I.加入100μLTE溶液溶解DNA，4℃保存备用。

（2）待测样品DNA的实时荧光PCR扩增

A.在PCR反应管中加入24μLPCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃15min，1个循环预变性；

95℃15sec，59℃1min，40个循环。

（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。

结果如图2。转基因马铃薯AV43-6-G7品淀粉有PCR扩增曲线且Ct值为25.2判定为检出，其他阴性对照无PCR扩增曲线判定为未检出。

实施例3

按下述方法检测转基因马铃薯AV43-6-G7品系的马铃薯块茎粉，核酸提取后稀释成为195,19.5,1.95,0.195,0.0195和0.00195ng/μL的浓度梯度，分别对应226000,22600,2260,226,22.6,2.26基因组拷贝数/μL。每个浓度梯度做3个PCR平行孔。

包括1×PCRMasterMix(内含热启动的TaqDNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物；

上游引物PotatoAV43-6-G7primerF（5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3’），下游引物PotatoAV43-6-G7primerR（5’-tgtcgtgccagctgcatta-‘3），探针PotatoAV43-6-G7Probe（5’-FAM-cccgcgcgttggccgat-3’BHQ）。其中上游引物、下游引物和探针比例：2：2：1；其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。

按照以下程序进行检测：

（1）待测样品DNA的提取

A.称取经过预处理的待测样本1.00g至50mL离心管中。

B.加入10mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNaseA酶（使其终浓度为10μg/mL），颠倒混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2~3次；12000g离心10min，转移1mL上清液至2mL离心管中。

C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000g离心10min，转移上清液600μL至2mL离心管中。

D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1h；12000g离心10min，弃去上清液。

E.向沉淀中加入400μL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5mL离心管。

F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心10min，转移上层水相至1.5mL离心管中。

G.加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30min；12000g离心10min，小心弃去上清液。

H.加入500μL70%乙醇，震荡离心柱管，12000g离心10min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。

I.加入100μLTE溶液溶解DNA，4℃保存备用。

（2）待测样品DNA的实时荧光PCR扩增

A.在PCR反应管中加入24μLPCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃15min，1个循环预变性；

95℃15sec，59℃1min，40个循环。

（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。

结果如图3。转基因马铃薯AV43-6-G7品系块茎粉195ng/μL浓度梯度的PCR扩增曲线且Ct值为25.3。最低检出的浓度为0.02ng,相当于23个AV43-6-G7转基因马铃薯基因组拷贝数。

苷酸序列表

<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>转基因马铃薯AV43-6-G7品系鉴定的引物、探针和方法

<160>3

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(26)

<400>1

ggtatcaggttctggaataagaccaa26

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(19)

<400>2

tgtcgtgccagctgcatta19

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(17)

<400>3

cccgcgcgttggccgat17