随机引物法检测与鉴定未知病毒的方法研究

摘要

目的：初步建立一种可以检测未知病毒核酸的分子生物学方法. 方法：将待鉴定的5种病毒培养物用过滤器过滤后,加入适当的核酸酶分别消化1小时,消化过程用宿主细胞的RNP基因进行实时监测,提取消化物中的病毒核酸.分别用两条随机引物对上述病毒核酸进行逆转录和PCR扩增,将纯化后的PCR产物与T载体连接并转入JM109感受态细胞,挑选白斑克隆进行测序,所测序列登录NCBI网站,利用BLAST软件进行序列比对和确认. 结果：RNP实时监测结果显示,所有5种病毒在核酸酶消化1小时后均检测不出RNB基因;凝胶电泳显示随机引物PCR产物大部分在100～250bp之间;每种病毒消化产物的PCR克隆挑取16个进行测序,其中携带有目的片段的阳性克隆在7～12个之间,其余为非目的片段,插入片段大小在78～320bp之间.序列分析证实这些片段分别来自登革病毒、腺病毒、科萨奇病毒、艾柯病毒和EV71病毒. 结论：5种病毒培养物均可用随机引物方法进行鉴定,初步建立了用随机引物检测与鉴定未知病毒方法.