随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立

摘要

目的 探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法.方法 分别以乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应(PCR)检测未知病毒的可行性.分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸.锚定随机引物经Klenow酶处理(模板为DNA)或反转录酶作用(模板为RNA)退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增.扩增产物经纯化后克隆、测序,最后与BLAST进行比对.结果 经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒为1×106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%.目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1×104拷贝/ml.结论 成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息.这种方法的建立为快速检测不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路.