一种测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的方法

摘要

本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的方法。本方法采用氘5-脱去氢表雄酮硫酸钠盐(DHEAS-D5)为内标，在血样品处理过程中采用无紫外线黄光安全灯(去除420nm以下波长的光线)条件控制STS降解，保证方法的准确度；采用甲酸酸化血样后加入定量的有机溶媒甲醇和乙腈混合液沉淀蛋白，采用串联质谱法测定丹参酮IIA磺酸钠和内标的浓度，定量线性范围为2-1000ng/mL，能满足人体药代动力学研究的要求；本方法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，仅需通用型的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合于丹参酮IIA磺酸临床常规血药浓度的监测。

说明书

技术领域

本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆 中丹参酮IIA磺酸钠(STS)浓度的方法。

背景技术

现有技术公开了丹参酮IIA磺酸钠(SodiumTanshinoneIIASulfonate，STS)在临床 上用于治疗冠心病、心绞痛，心肌梗死等心血管疾病。尽管丹参酮IIA磺酸钠(STS)应 用于临床已超过30年，但实践显示其临床用药参考资料依然不足，如人体药代动力学参 数未见报道，致使限制了其在临床上安全、有效应用。STS人体药代动力学参数缺乏的重 要原因之一是缺乏测定人血浆中STS浓度的方法。迄今，国内外尚未见测定人血浆中STS 的分析方法的文献报道。

现有技术的测定STS在动物血浆样本中浓度的方法在灵敏度、定量线性范围、特异 性等方面均不适用于测定其在人血浆中的浓度。有文献报道一种反相离子对色谱法 (Ion-PairReversed-PhaseHPLC-UV)测定STS在大鼠血浆中浓度的方法，该方法的最低 定量限是0.5μg/mL，显然其灵敏度之低不能满足人血浆中STS低浓度点的测定要求；另 有报道采用液相色谱-串联质谱法(LiquidChromatographyTandemMassSpectrometry)测 定大鼠血浆中STS的方法，该方法的定量线性范围为1-500ng/mL，实际上，其中的大鼠 静脉注射后的最高血药浓度高达10000ng/mL，远远超过了方法学的验证范围，测定结果 不准确；此外，由于动物血浆的基质不同于人血浆基质，并且人血浆中常有合并用药的情 况，因此，测定动物血浆的分析方法在特异性上也不能满足人血浆样品的测定要求；还 研究公开STS在血浆中不稳定，可能与光照等因素有关，但未对此进行方法学验证，而 保证STS在分析过程中的稳定性是保证其人血浆浓度测定方法准确度的关键。

鉴于现有技术存在的问题，本申请的发明人拟提供一种测定人血浆中丹参酮IIA磺酸 钠浓度的方法。

发明内容

本发明的目的是克服有技术存在的缺陷，提供一种简便、快速、灵敏、可测定人体 血浆中丹参酮IIA磺酸钠血药浓度的方法。

本发明的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的方法，采用与现有的技术不同的实 验方法，针对测定物进行了实验条件优化：采用结构类似物为内标；样品预处理过程采用 了无紫外线黄光安全灯(去除420nm以下波长的光线)条件下进行，控制STS降解；采用 了不同的分析色谱柱，以高强度硅胶颗粒C18为色谱柱填料，优化了流动相条件；采用 甲酸铵缓冲盐溶液(含0.3-0.5mmol/L甲酸铵，10-20ppm甲酸)和乙腈的混合液作为流动 相，等度洗脱。本方法无需特殊的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本 低等优点，适合常规血药浓度监测。

具体而言，本发明提供了一种测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的方法，其特征是， 待测样品经简单预处理后，在酸性流动相下，经色谱柱分离，用串联质谱检测，包括以下 步骤：

1)样品预处理

取待测样品于离心管中，加入内标工作液、一定浓度的甲酸水溶液和定量的有机溶媒 沉淀蛋白，混旋，15000rpm离心后，吸取上清液，加含0.1％甲酸的50％甲醇水溶液，混匀， 4℃待测；

本发明中，所述的内标为氘5-脱去氢表雄酮硫酸钠盐(DHEAS-D5)，蛋白沉淀剂甲酸溶 液浓度为5～15％，有机溶媒为甲醇、乙腈的混合物；

样品处理在无紫外线黄光安全灯(去除420nm以下波长的光线)条件下进行，能控制STS 降解，保证准确度；

2)样品分离

采用通用型的液相色谱柱，其填料为高强度硅胶颗粒C18，高效液相系统采用通用型 高压泵和进样器，采用甲酸铵缓冲盐溶液和乙腈的混合液作为流动相，等度洗脱，

所述的甲酸铵缓冲盐溶液中含0.3-0.5mmol/L甲酸铵，10-20ppm甲酸；

本发明的一个实施例中，优选等度洗脱模式为甲酸铵缓冲盐溶液(含0.3-0.5mmol/L甲酸 铵，10-20ppm甲酸)∶乙腈为60±10∶40±10，V/V；

3)样品检测

采用通用型串联质谱检测器检测丹参酮IIA磺酸钠和内标的峰面积；

质谱电离方式：电喷雾离子源；极性：负离子检测；扫描方式：多反应离子检测扫描 (MRM)；离子通道选择：STS：373.3→357.1amu，DHEAS-D5：373.0→97.8amu；碰撞气： 氮气；

本发明的一个实施例中，仪器参数优选设定为：扫描间隔：5±1ms；离子源参数：GS1： 60±10psi；GS2：60±10psi；气帘气：25psi±10；喷雾电压：-4500±500V；毛细管温度： 550±100℃；STS和DHEAS-D5的碰撞能量：50±10eV；运行时间：3±1min；

4)浓度计算

以样品浓度为X轴，STS峰面积(As)和内标峰面积(Ai)的比值为Y轴，进行加权回归分 析，采用标准曲线法推出未知血样的浓度值(在标准曲线范围内)。

本方法中，待测样品为人血浆。

本发明的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的方法中，对待测样品经简单预处理 后，在酸性流动相下，经色谱柱分离，用串联质谱检测，无需特殊的设备和试剂，STS 测定的线性良好，浓度范围均为2～1000ng/mL，方法回收率稳定，日内和日间的精密度(相 对标准差，RSD)均小于10％，本方法具有操作简便、快速准确、血浆用量少灵敏度高、、 成本低等优点，适合临床常规血药浓度监测。

本发明的有益效果有：

1)内标选择：采用结构类似物DHEAS-D5为内标，色谱行为相似，色谱峰出峰时间 接近，受到的基质效应干扰接近，保证质控过程的准确；

2)预处理方法：一步有机溶媒蛋白沉淀法，简便、价廉，适用于常规检测，采用了 无紫外线黄光安全灯(去除420nm以下波长的光线)条件处理血浆样品，成功控制STS降 解，保证了方法的准确度；

3)分离条件：分离采用填料为高强度硅胶颗粒C18色谱柱作为固定相，乙腈和甲酸 铵缓冲盐溶液的混合液作为流动相，等度洗脱，不受内源性物质基质效应的干扰；

4)测定条件：测定采用通用型串联质谱检测，该方法不需色谱分离样品和内标，简 化了分析步骤，显著提高了临床血药浓度检测的效率；

5)采样量少：测定一份样品只需0.1ml血浆样本；

6)灵敏度高：通过针对样品和内标采用不同的离子反应通道，避免样品内标相互干 扰以及内源性物质的干扰，获得最佳的响应信号，STS的最低定量限为2ng/mL；

7)特异性强：内源性物质和常用合并用药对测定不干扰；

8)测定时间短：每个样品的色谱质谱分析测定过程为3min。

附图说明

图1：典型色谱图：未使用STS的健康受试者的空白血浆，其中，图A为STS： 373.3→357.1amu，图B为内标DHEAS-D5：373.0→97.8amu。

图2：典型色谱图：空白血浆添加STS和内标标准品(STS的浓度为LLOQ2ng/mL， 内标的浓度为200ng/mL)其中，图A为STS：373.3→357.1amu，图B为内标DHEAS-D5： 373.0→97.8amu。

图3：使用STS的健康志愿者的血样测定色谱图，其中，图A为STS：373.3→357.1amu， 图B为内标DHEAS-D5：373.0→97.8amu；STS血药浓度为198.3ng/mL，采血时间为静 脉滴注结束后10分钟。

图4：使用STS的患者的血样测定色谱图，其中，图A为STS：373.3→357.1amu， 图B为内标DHEAS-D5：373.0→97.8amu；STS血药浓度为358.3ng/mL，采血时间为静 脉滴注结束后2.5分钟。

具体实施方式

实施例1

色谱条件：日本岛津UFLC系统：SIL-30AC自动进样器(1台)，LC-30AD输液泵 (2台)，DGU-20A_5R在线脱气仪(1台)，CBM-20A控制器(1台)，CTO-30A柱温箱(1 台)，美国ABSciex公司数据采集与处理软件：Analyst1.6.1。美国Waters公司XSELECTTM HSST3，2.1×100mm，3.5μm，柱温：室温，流动相：含0.45mmol/L甲酸铵和18ppm甲 酸水溶液∶乙腈(40∶60，V/V)；流速0.3mL·min^-1；

质谱条件：美国ABSciex公司TripleQuad^TM5500串联质谱仪，质谱电离方式：电 喷雾离子源。离子源参数：GS1：60psi；GS2：60psi；气帘气：25psi；喷雾电压：-4500V； 毛细管温度：550℃；碰撞气：氮气，扫描方式：多反应离子检测扫描(MRM)；STS和 DHEAS-D5的碰撞能量：50±10eV；离子通道选择：STS：373.3→357.1amu，DHEAS-D5： 373.0→97.8amu；扫描间隔：5ms；

血浆样品预处理

取0.1mL血样于离心管中，加入10μL内标工作液、5μL一定浓度的甲酸水溶液和 200μL甲醇、乙腈的混合物沉淀蛋白，混旋10s，15000rpm离心10min，吸取上清液10μL， 加50μL含0.1％甲酸的50％甲醇水溶液，混匀，待测。内标法以峰面积定量。血浆样品 处理在无紫外线黄光安全灯(去除420nm以下波长的光线)条件下进行；

专属性

(1)内源性物质的干扰：取不同来源的8名未使用STS的受试者的空白血浆(其中含 一份空白溶血血浆和一份空白高脂血浆)，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，结 果未发现血浆内源性物质对STS和内标有干扰；

(2)内标对STS的干扰：方法验证的每个含标准曲线的批次都需用空白基质配制2 份只含有内标化合物而不含STS的样品，按上述方法处理分析，结果未发现内标化合物 对STS测定有干扰；

(3)基质效应：取6个独立不同来源的空白基质，按照上述样品预处理获得含基质的 上清液，加入一定量的标准品溶液，进样测定的结果与化学品标准品溶液的结果比较，结 果未发现基质效应对STS测定有干扰；

(4)常见合并用药：阿司匹林、氯吡格雷、卡托普利、福辛普利、缬沙坦、氯沙坦、 美托洛尔、比索洛尔、氨氯地平、硝苯地平、阿托伐他汀钙、瑞舒伐他汀，二甲双胍、格 列苯脲、格列吡嗪、阿卡波糖、瑞格列奈、头孢唑啉、头孢呋辛钠、地西泮等对测定没有 干扰；STS和内标的典型色谱保留时间分别为1.47、1.17min，整个色谱分析过程时间为 3min；

线性试验

精密称取STS标准物质适量，用甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人 血浆，配制成含STS血浆浓度分别为2，4，20，100，400，800和1000ng/mL的标准血 样，取血浆0.1mL，按“血浆样品预处理”方法操作，内标法以待测组分与内标的峰面积 比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C²)线性回归，线性范围均为2～1000ng/mL，最 低定量限为2ng/mL，STS的标准曲线回归方程分别为：A＝0.00648C+0.000433，r＝0.9977；

准确度和精密度

精密称取STS标准物质适量，甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血 浆，配制成含STS血浆浓度分别为6，200和750ng/mL的系列血样，各取血浆0.1mL， 按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度；根据线性回归方程 计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C_实测-C_理论)/C_理论×100％为偏差；表1显示了STS的日内、日间精密度和准确度，结果表明STS的 日内和日间精密度均小于10％，相对偏差小于10％；

表1实施例1中STS的日内、日间精密度和准确度

本发明中进行了健康受试者血浆中STS的测定，图3为健康受试者的典型分析色谱图， STS浓度为198.3ng/mL。

实施例2

色谱条件

日本岛津UFLC系统：SIL-30AC自动进样器(1台)，LC-30AD输液泵(2台)， DGU-20A_5R在线脱气仪(1台)，CBM-20A控制器(1台)，CTO-30A柱温箱(1台)，美国AB Sciex公司数据采集与处理软件：Analyst1.6.1。美国Waters公司XSELECTTMHSST3， 2.1×100mm，3.5μm，柱温：室温。流动相：含0.40mmol/L甲酸铵和16ppm甲酸水溶液∶ 乙腈(45∶55，V/V)；流速0.3mL·min^-1；

质谱条件：

美国ABSciex公司TripleQuad^TM5500串联质谱仪，质谱电离方式：电喷雾离子源， 离子源参数：GS1：60psi；GS2：60psi；气帘气：25psi；喷雾电压：-4500V；毛细管温 度：550℃；碰撞气：氮气，扫描方式：多反应离子检测扫描(MRM)；STS和DHEAS-D5 的碰撞能量：50±10eV；离子通道选择：STS：373.3→357.1amu，DHEAS-D5： 373.0→97.8amu；扫描间隔：5ms；

血浆样品预处理

取0.1mL血样于离心管中，加入10μL内标工作液、5μL一定浓度的甲酸水溶液和 200μL甲醇、乙腈的混合物沉淀蛋白，混旋10s，15000rpm离心10min，吸取上清液10μL， 加50μL含0.1％甲酸的50％甲醇水溶液，混匀，待测；内标法以峰面积定量，血浆样品 处理在无紫外线黄光安全灯(去除420nm以下波长的光线)条件下进行；

专属性

(1)内源性物质的干扰：取不同来源的8名未使用STS的受试者的空白血浆(其中含一 份空白溶血血浆和一份空白高脂血浆)，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，结果 未发现血浆内源性物质对STS和内标有干扰；

(2)内标对STS的干扰：方法验证的每个含标准曲线的批次都需用空白基质配制2 份只含有内标化合物而不含STS的样品，按上述方法处理分析，未发现内标化合物对STS 测定有干扰；

(3)基质效应：取6个独立不同来源的空白基质，按照上述样品预处理获得含基质的 上清液，加入一定量的标准品溶液，进样测定的结果与化学品标准品溶液的结果比较，未 发现基质效应对STS测定有干扰；

(4)常见合并用药：阿司匹林、氯吡格雷、卡托普利、福辛普利、缬沙坦、氯沙坦、 美托洛尔、比索洛尔、氨氯地平、硝苯地平、阿托伐他汀钙、瑞舒伐他汀，二甲双胍、格 列苯脲、格列吡嗪、阿卡波糖、瑞格列奈、头孢唑啉、头孢呋辛钠、地西泮等对测定没有 干扰，STS和内标的典型色谱保留时间分别为1.58、1.24min，整个色谱分析过程时间为 3min；

线性试验

精密称取STS标准物质适量，用甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人 血浆，配制成含STS血浆浓度分别为2，4，20，100，400，800和1000ng/mL的标准血 样；取血浆0.1mL，按“血浆样品预处理”方法操作；内标法以待测组分与内标的峰面积 比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C²)线性回归，线性范围均为2～1000ng/mL，最低定量 限为2ng/mL，STS的标准曲线回归方程分别为：A＝0.00705C+0.0007，r＝0.9988；

准确度和精密度

精密称取STS标准物质适量，甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血 浆，配制成含STS血浆浓度分别为6，200和750ng/mL的系列血样，各取血浆0.1mL， 按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度，根据线性回归方程 计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C_实测-C_理论)/C_理论×100％为偏差；表2显示了STS的日内、日间精密度和准确度，结果表明STS的 日内和日间精密度均小于10％，相对偏差小于10％。

本发明中进行了患者血浆中STS的测定，图4为某患者的分析色谱图，STS浓度为 358.3ng/mL。

表2实施例2中STS的日内、日间精密度和准确度