甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体及其构建方法

摘要

一种甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，它是由甜瓜坏死斑点病毒全基因组与带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS重组获得pCB301-MNSV。通过冻融法将此载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，然后通过农杆菌注射法接种甜瓜幼苗检测pCB301-MNSV的侵染性。采用本发明的侵染性克隆载体在农杆菌中大量表达，能侵染甜瓜，西瓜和黄瓜等葫芦科作物，不侵染烟草，不感染动物和人类，相对安全，侵染性克隆的成功使对该病毒的研究易于在DNA水平上进行操作。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，是一种甜瓜病毒-甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体及其构建方法。

背景技术

MNSV属于香石竹斑驳病毒属(Carmovirμs)，病毒粒体为球形，直径约30nm，基因组为正义单链RNA约4.3Kb，5＇端不含帽子结构且3＇端不含poly(A)结构，编码5个开放阅读框。它主要通过种子、土壤真菌和黄瓜黑头叶甲进行自然传播，另外还可以通过机械摩擦接种进行传播。其寄主范围仅限于葫芦科的一些植物，例如西瓜、南瓜、葫芦、黄瓜和甜瓜等，其中在甜瓜上是系统侵染。在甜瓜上引起的症状有：叶片，叶柄和茎干上出现坏死斑或者褪绿斑，植株矮化，使果实变小，严重影响作物的品质和产量，随着种子产业的发展，该病害随种子调运远距离传播将会严重影响我国甜瓜生产。

利用基因工程进行交叉保护，首先就要获得病毒的全长基因进而构建病毒侵染性的cDNA克隆，利用突变、缺失、插入、置换及互补试验等逆向遗传学分析手段对基因进行改造，获得具有弱毒性的突变体。所谓病毒侵染性的cDNA克隆是指RNA病毒具有侵染性的cDNA或是cDNA具有侵染性的体外转录物。RNA病毒侵染性克隆的建立，使重组DNA技术及其它相关技术在研究中的应用成为可能，从而克服了RNA病毒难以进行遗传操作的问题。瓜类病毒病的防治目前缺乏有效的方法，可以通过转基因抗病毒和弱毒株保护来实现。自然界弱毒株的发现极其困难和盲目。MNSV基因组很小，只有4.3kb，是非常好的基因工程材料。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术的缺陷提供一种甜瓜坏死斑点病毒的侵染性克隆载体及其构建方法。

本发明的目的是以下述技术方案实现的：

一种甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，它是由甜瓜坏死斑点病毒全基因组与带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS重组获得甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV。

如上所述的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）获取甜瓜坏死斑点病毒RNA；

2）甜瓜坏死斑点病毒cDNA第一链的合成；

3）采用RT-PCR的方法分两段扩增获得甜瓜坏死斑点病毒全基因组，扩增甜瓜坏死斑点病毒基因的重组引物为：F1：5＇-AGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGGATTACTCTAGCCGGATCCCCGACTC-3＇；R1：5＇-GAGTTCGCATTGAAACCCGAATTG-3＇；F2：5＇-AGCCGACATGGTAAGGCACTGGAGA-3＇；R2：5＇-AGGTGGAGATGCCATGCCGACCCGGGCGGGATGGGCCTACAACCCATCTCA-3＇；甜瓜坏死斑点病毒基因的5＇和3＇端分别重组了25bp和23bp的载体序列，引物序列划线部分为与载体融合部分，F1/R1扩增1960bp的片段，F2/R2扩增2347bp的片段；

4）采用同源重组的方式将2个扩增片段与植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS重组，转化大肠杆菌DH5ɑ，筛选并提取获得含有甜瓜坏死斑点病毒的全长基因的载体pCB301-MNSV。

步骤2）中病毒特异性3＇引物为：5＇-GGGCGGGATGGGCCTACAACCCATCTCA-3＇。

步骤4）中植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS经Stμ和Sma双酶切后与F1/R1和F2/R2扩增的甜瓜坏死斑点病毒的2个片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，涂布在含有kan抗生素的平板上，筛选含有甜瓜坏死斑点病毒的全基因组的克隆，用碱裂解法提取含有甜瓜坏死斑点病毒全长基因的克隆，获得甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV。

一种农杆菌，它是通过采用冻融法将甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV转入农杆菌GV3101感受态细胞制备得到的。

上述农杆菌它通过注射法接种甜瓜幼苗检测pCB301-MNSV的侵染性。

本发明采用同源重组的方式分两段将扩增的甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）基因片段与带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS重组连接。与传统的酶切连接相比，该方法既节省了工序，又提高了重组的阳性率。该方法的另外一个突出的优点是不受限制性内切酶有无的影响，不用考虑MNSV全长基因中是否含有载体上的限制性内切酶，避免了实验的繁琐及内切酶的限制。如果利用限制性内切酶的酶切方法，该载体则不能使用，因为MNSV基因序列中含有3个内切酶Sma，而载体的多克隆位点的内切酶位点受限不能满足克隆的需求。采用本发明的侵染性克隆载体在农杆菌中大量表达，能侵染甜瓜，西瓜和黄瓜等葫芦科作物，不侵染烟草，不感染动物和人类，相对安全，侵染性克隆的成功使对该病毒的研究易于在DNA水平上进行操作。

附图说明

图1是pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS的载体图；

图2是甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体图；

图3是接种MNSV侵染性载体7天后甜瓜症状图；

图4是接种MNSV侵染性载体7天后甜瓜症状图；

图5是RT-PCR检测MNSV侵染性克隆载体接种甜瓜后电泳图。

具体实施方式

实施例1

一种甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体，如图2所示，是通过将甜瓜坏死斑点病毒全基因组与带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS重组获得的。带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS如图1所示，已被公开（姚敏，张天奇，田志超，王源超，陶小荣.农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体构建,中国农业科学,2011,44(14):3060-3068）；所述的甜瓜坏死斑点病毒全基因序列如SEQIDNO:08所示。

上述甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体构建方法包括以下步骤：

1、按常规方法从感染甜瓜坏死斑点病毒的发病株中抽提病毒粗体液，从病毒的粗体液中提取病毒的RNA：

1）病毒的粗体液制备

①取100g发病组织加入200ml的0.067M磷酸钠缓冲液(pH7.2)和50ml0.1M的抗坏血酸，用匀浆机匀浆；15000g离心10min；取上清，加0.1倍体积的氯仿，混匀；

②15000g离心10min，取上清；105,000g离心120min，去掉上清，留沉淀；

③用0.01M的磷酸钠缓冲液(pH7.0)重新悬浮沉淀，为病毒的粗提液。

2）病毒RNA提取

取病毒的粗体液300μl加入1mlTRIZOLplus（大连TaKaRa公司），随后根据TRIZOLplus试剂说明书方法提取病毒RNA。

2、以甜瓜坏死斑点病毒的全长基因信息为基础，设计扩增MNSV的重组引物及通过RT-PCR的方法，扩增甜瓜坏死斑点病毒的全基因组

1）设计重组引物为：F1：5＇-AGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGGATTACTCTAGCCGGATCCCCGACTC-3＇（SEQIDNO:02）；R1：5＇-GAGTTCGCATTGAAACCCGAATTG-3＇（SEQIDNO:03）；F2：5＇-AGCCGACATGGTAAGGCACTGGAGA-3＇（SEQIDNO:04）；R2：5＇-AGGTGGAGATGCCATGCCGACCCGGGCGGGATGGGCCTACAACCCATCTCA-3＇（SEQIDNO:05）。在设计MNSV的扩增全长基因的引物时利用了重组融合的方法，划线部分为与载体融合片段；MNSV基因的5＇和3＇端分别重组了25bp和23bp的载体序列，在MNSV的2个片段中间重组了约50bp。

2）通过RT-PCR的方法，扩增甜瓜坏死斑点病毒的全基因组，分为两个片段扩增，F1/R1扩增出1960bp的片段，F2/R2扩增出2347bp的片段，中间重叠部分约为50bp；把扩增的目的片段回收，保存备用；具体步骤为：

①cDNA第一链的合成

反应程序参照M-MLV说明书，采用10μL反应体系如下：3μL总RNA，1μL病毒特异性3＇引物（5＇-GGGCGGGATGGGCCTACAACCCATCTCA-3＇，SEQIDNO:02）（10μM），70℃变性5min，迅速置冰上3min；再加入2μL5×Reactionbuffer，2μLdNTPs（2.5mMeach），0.3μlRNaseInhibitor（40Μ/μL）0.3μL反转录酶（40Μ/μL），最后加入RNasefreeH₂O补足10μL，42℃1h后，70℃15min，置冰上待用，以上用到的各种试剂均购自大连TaKaRa公司。

②PCR扩增

采用20μlRT-PCR扩增标准反应体系：2.0μL10×PCRbuffer，2μL正向和反向引物混合物（各10μM），0.2μLTaqDNA聚合酶（5Μ/μL），2μLcDNA第一链合成产物和11.8μLddH2O。PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性40s，62℃退火40s，72℃延伸50s，循环30次；最后72℃10min。

3、与植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS重组，获得甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆pCB301-MNSV质粒载体

1）pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS用Stu和Sma双酶切后经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，回收；限制性内切酶均购自NewEnglandBiolabs公司。

2）上述的扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，按照回收试剂盒（大连TaKaRa公司）说明书进行回收；回收的试剂置于-20℃备用。

3）利用同源重组酶（Clonetech公司），把双酶切的pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS与MNSV全基因组的2个扩增片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，涂布在含有kan抗生素的平板上，37℃培养，筛选含有甜瓜坏死斑点病毒的全长基因的载体，用碱裂解法抽取甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆pCB301-MNSV质粒载体。

一种包含上述获得的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆pCB301-MNSV质粒载体的农杆菌，其制备方法具体包括以下步骤：

通过农杆菌冻融法将植物表达载体pCB301-MNSV转入农杆菌GV3101：取200μl的GV3101感受态细胞，加入1μg的pCB301-MNSV重组载体，置于冰上30min后，液氮中速冻5min，37℃5min，加入500μl的不含有任何抗生素的LB培养基中，28℃慢速培养4-6h，涂布于含有50μg/ml的Km、10μg/ml四环素和50μg/ml的Rif的3种抗生素的LB固体培养基平板上28℃培养约48h，至长出单菌落；以菌落为模版，进行PCR筛选阳性克隆。

上述农杆菌注射接种及致病性鉴定

把筛选到的阳性单克隆接种到含有50μg/ml的Km、10μg/ml四环素和50μg/ml的Rif的3种抗生素的LB的液体培养集中，28℃220rpm摇菌培养至OD600为1.0左右，经6000rpm10min离心收集沉淀，重悬于含有10mMMgCl₂，10mMMES，150μm的乙酰丁香酮的浸润缓冲液中，调整OD600至1.0，静置3-5h后注射接种两叶一心的甜瓜苗，接种到子叶的背部，接种后把甜瓜苗保持在黑暗中10h后，在20℃8h，24℃16h的条件下培养。

观察甜瓜幼苗的发病情况，检测甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体pCB301-MNSV的侵染性

接种后每天观察发病情况。接种4天后，接种的子叶开始出现局部的坏死斑点症状，至第7天时，子叶的枯斑开始连片出现，真叶也出现明显的坏死斑点症状。注射接种子叶7天后植株相继发病，接种叶出现大量枯斑，枯斑连片呈现严重枯死，出现的第一个真叶产生典型的枯斑，如图3及图4所示；同时，经酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）和RT-PCR检测，RT-PCR检测接种样品的引物扩增片段为部分CP基因590bp，引物为SEQIDNO:06和SEQIDNO:07；如图5所示，泳道1为健康对照，泳道2为接种MNSV的对照，泳道3，4为接种MNSV侵染性克隆后的样品，泳道5为DL2000的Marker，从图中可以明显看出接种MNSV侵染性克隆的大部分植株表现阳性，发病率达95%（发病37/39）。随后将发病的植株经摩擦接种回接到健康的甜瓜植株上，接种7天后植株均发病，说明构建的侵染性克隆能够正常传播。由此，MNSV侵染性克隆构建成功。

SEQIDNO:06为

MNSV-3370F:5＇-ATCGTGCTGCCATTAGCTCTTATG-3＇

SEQIDNO:07为

MNSV-3960R:5＇-CAGCGAGTGATCGTCATACGTACCC-3＇）

本发明未公开的内容为已知的现有技术，本文中不再赘述。SEQUENCELISTING

<110>中国农业科学院郑州果树研究所

<120>甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体及其构建方法

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