海洋芽孢杆菌、分离方法、海洋右旋糖苷酶制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种海洋芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的保藏号为CCTCC？M2015437。本发明应用于上述海洋芽孢杆菌制备得到海洋右旋糖苷酶，对变异链球菌具有抑制其生物膜形成的功能，除了可以应用于龋齿防治及在医疗，日化等方面以外，对海洋生物医药等方面也具有巨大的应用潜力。

说明书

【技术领域】

本发明涉及微生物医疗技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆菌、其分离方 法、海洋右旋糖苷酶的制备方法以及它们口腔护理、日化方面的应用。

【背景技术】

右旋糖酐酶(dextranase,EC3.2.1.11)是专一性切割α-1，6糖苷键葡聚糖 中α-1，6糖苷键的酶。按切割方式分类将右旋糖酐酶分成外切型和内切型。右 旋糖酐是一种葡萄糖分子以α-1，6糖苷键为主链，同时含有少量α-1，3、α-1， 4等糖苷键构成的支链，而形成的葡聚糖大分子。外切型右旋糖酐酶从右旋糖酐 的非还原端开始，逐一将葡萄糖分子切割下来，其终产物为葡萄糖分子及无法 切割的部分；内切型右旋糖酐酶在右旋糖酐分子的内部随机切割，生成少量的 葡萄糖和异麦芽寡糖。经研究发现霉菌、酵母菌和细菌都能产生右旋糖酐酶。

1968年Fitzgerald首次报道了右旋糖酐酶在龋病防治方面的可行性，自此多 国科学家参与研究，进行动物实验、体外人工牙菌斑实验，最终证明此酶确实 有抑制牙菌斑生物膜形成的作用。1969年Gibbons和Keyes在仓鼠的饮用水中 加入右旋糖酐酶，在龋病防治中效果明显。2004年，Wiater等人研究了真菌葡 聚糖酶对口腔链球菌生物膜中变聚糖的影响,结果表明变聚糖酶与右旋糖苷酶可 以有效地预防牙菌斑生物膜的形成，尤其是两种酶联用时作用效果更好。2010 年，Yano等人研究发现右旋糖苷酶与香菇多糖共同存在时抑制生物膜形成的能 力增强且对已形成的生物膜也具有降解作用，单独使用右旋糖苷酶时则对已形 成的生物膜的作用效果甚微。近年来还出现了各种通过基因工程手段治疗牙菌 斑生物膜的研究，例如将编码右旋糖苷酶的基因在口腔细菌中克隆表达。目前 丹麦Novo公司、美国Miles公司已有商品右旋糖苷酶制品出售。Novo公司 右旋糖苷酶的生产主要由青霉属发酵获得，美国Miles公司生产的右旋糖苷酶 则主要通过毛壳菌属发酵生产获得。这些酶主要应用于制糖工业。这两种微生 物来源的右旋糖苷酶尚未被美国食品药物管理局批准认可用于食品行业。为了 预防牙菌斑生物膜的形成，目前国外已经设计了多种含右旋糖苷酶的口腔护理 产品。2001年，Song等人对斯氏油脂酵母Lipomycesstarkeyi突变株KSM22 右旋糖苷酶漱口液进行了临床实验。结果表明，与使用含0.12％洗必泰漱口液 的实验组相比，Lipomycesstarkeyi突变株KSM22右旋糖苷酶漱口液在牙菌斑 及牙龈炎的防治方面效果要好，而且引起的副作用较小。2004年Masaru等人 再次证实了右旋糖苷酶漱口液可以有效地预防牙菌斑生物膜的形成，而且长期 使用后效果会越来越好。

目前国内关于右旋糖苷酶在牙菌斑生物膜防治中的应用的报道并不多见， 而且相对集中。1988年中国科学院微生物研究所孙晋武等人证明了淡紫拟青霉 右旋糖苷酶可以抑制变异链球菌产生胞外多糖，降低形成牙菌斑的可能性。此 后北京口腔医院赵宝荣等人通过动物实验及临床实验再次证实了淡紫拟青霉右 旋糖苷酶对牙菌斑的抑制作用。2007年四川大学华西口腔医学院蒋丹研究了美 国Sigma公司青霉属右旋糖苷酶对变异链球菌单菌种生物膜的作用效果，结果 显示右旋糖苷酶能降解变异链球菌生物膜中的胞外多糖。

尽管国内已出现关于右旋糖苷酶的部分防龋报道，但尚未出现含右旋糖苷 酶的口腔护理产品。究其原因主要包括右旋糖苷酶的微生物来源及右旋糖苷酶 的酶学特性。右旋糖苷酶的产生菌主要为霉菌，用霉菌来生产预防口腔牙菌斑 的右旋糖苷酶存在一定的安全性问题，且产酶时间长，如果用在牙膏中，还存 在碱性条件下不稳定的问题。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题在于扩展口腔护理微生物的种类，特别是开发安 全性能高的海洋芽孢杆菌在口腔护理中的应用，以改善现有技术存在的缺陷。

为此，本发明提供一种海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)，所述菌株为L-1，保藏 单位：武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏日期：2015年7月9日，保藏号： CCTCCM2015437。

所述菌株的16SrDNA基因序列为SEQIDNo.2。

本发明另一方面提供了一种海洋芽孢杆菌的菌株分离方法，包括下述步骤：

于温度为20～30℃的条件下，将渤海沉积物在固体培养基活化培养1～2天 后分离得到，其中，所述述固体培养基的质量组分如下：

心脑粉0.8～1.0份，蛋白胨0.5～0.75份、琼脂1.0～1.5份，人工海水100 份，pH为7.5～8.0。

本发明再一方面提供了一种海洋右旋糖苷酶的制备方法，包括下述步骤：

将所述海洋芽孢杆菌的菌株接种于液体种子培养基，在20～30℃的条件下 振荡培养24～36小时，获得种子培养液，其中，所述液体种子培养基的质量组 分如下：心脑粉0.8～1.0份，蛋白胨0.5～0.75份，灭菌天然海水100份，pH 为7.5～8.0；

按体积比为1～5％将步骤所述种子培养液接种于发酵培养基，经发酵培养 后，离心取上清，制得发酵液，其中，所述发酵培养基的质量组分如下：心脑 粉0.8～1.2份，蛋白胨0.1～0.5份，NaCl0.1～0.2份，Na₂HPO₄0.05～0.1份， 灭菌天然海水100份，pH为8.0；

将所述发酵液过滤膜，滤液经冷冻干燥后制得海洋右旋糖苷酶。

在一些实施例中，在完成上述步骤后，还包括将所述海洋右旋糖苷酶进行 分离纯化的步骤。

在一些实施例中，所述心脑粉是由牛心脑经过脱脂、冻干、研磨、过筛后 得到。

在一些实施例中，所述发酵培养的温度为20～30℃，时间为26～30h。

在一些实施例中，所述分离纯化温度为4～6℃。

此外，本发明还提供了的上述海洋右旋糖苷酶的用途，所述海洋右旋糖苷 酶在口腔护理、日化上的应用。

本发明的提供了一种海洋芽孢杆菌，将其应用于口腔护理、日化、海洋生 物医疗中，拓展了生物医疗微生物的范围。本发明应用于上述海洋芽孢杆菌制 备得到海洋右旋糖苷酶，对变异链球菌具有抑制其生物膜形成的功能，除了可 以应用于龋齿防治及在医疗，日化等方面以外，对海洋生物医药等方面也具有 巨大的应用潜力。

【附图说明】

图1为右旋糖苷酶产生菌株周围的蓝色透明圈；

图2为发酵温度与海洋胞外右旋糖苷酶酶活的关系图；

图3为发酵时间与海洋胞外右旋糖苷酶酶活的关系图；

图4为最适发酵条件下细菌的生长曲线(A)与产酶曲线(B)图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具 体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 用于解释本发明，而非限定本发明。

本发明提供一种海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)，所述菌株为L-1，保藏单位： 武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2015年7月9日，保藏号：CCTCC M2015437。

经测定，所述芽孢杆菌的菌株16SrDNA基因序列为SEQIDNo.2，经检索， 在Genebank数据库中未发现完全相同的序列。

由于筛选的微生物为芽孢杆菌，已经作为口腔护理产品来源菌株，芽孢杆 菌已在化妆品生产名录内，无需再做额外检测。

本发明另一方面提供了一种海洋芽孢杆菌的菌株分离方法，包括下述步骤：

于温度为20～30℃的条件下，将渤海沉积物在固体培养基活化培养1～2天 后分离得到，其中，所述述固体培养基的质量组分如下：心脑粉0.8～1.0份， 蛋白胨0.5～0.75份、琼脂1.0～1.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0。

上述原料来源广泛，制备简单，成本相对较低。

本发明再一方面提供了一种海洋右旋糖苷酶的制备方法，包括下述步骤：

将所述海洋芽孢杆菌的菌株接种于液体种子培养基，在20～30℃的条件下 振荡培养24～36小时，获得种子培养液，其中，所述液体种子培养基的质量组 分如下：心脑粉0.8～1.0份，蛋白胨0.5～0.75份，灭菌天然海水100份，pH 为7.5～8.0；按体积比为1～5％将步骤所述种子培养液接种于发酵培养基，经发 酵培养后，离心取上清，制得发酵液，其中，所述发酵培养基的质量组分如下： 心脑粉0.8～1.2份，蛋白胨0.1～0.5份，NaCl0.1～0.2份，Na₂HPO₄0.05～0.1 份，灭菌天然海水100份，pH为8.0；将所述发酵液过滤膜，滤液经冷冻干燥 后制得海洋右旋糖苷酶。

该海洋右旋糖苷酶的制备方法中，所述心脑粉是由牛心脑经过脱脂、冻干、 研磨、过筛后得到，本发明用牛心脑诱导，进行细菌菌株胞外右旋糖苷酶的产 酶发酵，产酶活力明显增强。

该海洋右旋糖苷酶的制备方法中，所述发酵培养的温度为20～30℃，时间 为26～30h，本发明采用优化的发酵条件，使菌株胞外发酵液中酶活达到100.02 ±9.0U/mL，与现有技术相比胞外酶活明显提高。

本发明的提供了一种海洋芽孢杆菌，将其应用于口腔护理、日化、海洋生 物医疗中，拓展了生物医疗微生物的范围。本发明应用于上述海洋芽孢杆菌制 备得到海洋右旋糖苷酶，对变异链球菌具有抑制其生物膜形成的功能，除了可 以应用于龋齿防治及在医疗，日化等方面以外，对海洋生物医药等方面也具有 巨大的应用潜力。

实施例1

菌株L-1的分离

于温度为20～30℃的条件下，将渤海沉积物在固体培养基活化培养1～2天 后分离得到，其中，所述述固体培养基的质量组分如下：心脑粉0.8～1.0份， 蛋白胨0.5～0.75份、琼脂1.0～1.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0。采用 上述分离方法得到所述海洋芽孢杆菌。

菌株L-1的鉴定

对所得菌株L-1分别进行分子鉴定结果如下：

分子鉴定结果：所述L-2菌株的16SrDNA基因序列为SEQIDNo.2，根据 以上的鉴定结果，将其进行保藏，保藏信息如下：保藏单位为武汉大学中国典 型培养物保藏中心，保藏日期为2015年7月9日，保藏号为CCTCCM2015437。

实施例2

实验1-不同底物海洋胞外右旋糖苷酶效果的测定：

将无菌的不同含量的底物加入到接种菌株的培养基中，诱导细菌分泌胞外 右旋糖苷酶。不同底物的诱导效果如表1所示。

表1.不同诱导物对菌株发酵产弹性蛋白酶的影响

实验2-不同发酵条件对海洋胞外右旋糖苷酶酶活的影响

控制其他变量，分别只改变培养基中心脑用量、培养温度和培养时间来研 究不同因素对酶产量的影响，结果如图1到图4所示。

从图1可以看出菌株CF6-2的最适产酶温度在17.5到22.5℃之间，温度 过高或过低都不利于酶的分泌。图2则反映了不同培养时间下产酶量的变化。 在15h到25h之间酶活直线增长，25h时达到最高，25h之后酶活出现小幅下 降，但一直维持在较高水平。

经过优化后的发酵方法为采用制备的心脑粉作为诱导物，心脑粉0.8～1.2 份，蛋白胨0.1～0.5份，NaCl0.1～0.2份，Na2HPO40.05～0.1份，灭菌天然海 水100份，pH为8.0；结果如图4，在18～20℃发酵。菌株CF6-2在培养5h后 进入对数期，15h后达到稳定期，发酵液中菌体浓度达到顶峰，之后的20h之 内基本保持在这一水平，到第35h略有下降。发酵液酶活从第7.5h快速增加， 在第26.5h达到最高值100.02±9.0U/mL.

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任 何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本 发明权利要求的保护范围内。