产右旋糖苷酶海洋菌株的诱变及其克隆表达研究

摘要

右旋糖苷酶可以水解水溶性多糖中的α-1，6糖苷建，因此该酶可以广泛的应用于制糖工业、水果饮料的制造等领域。近些年，右旋糖苷酶还被应用于牙茵斑的预防、血液替代品的制作等。目前已经报道过的右旋糖苷酶多来自于霉菌菌属，和细菌来源的右旋糖苷酶相比，真菌来源的右旋糖苷酶存在发酵周期长、具有一定的安全隐患等缺点。
　　本文主要对一株分离自海泥的海洋氧化节杆菌Arthrobacter KQ11用常压室温等离子体诱变的方法（ARTP）进行诱变，经过两轮的诱变得到了两株正突变菌4-1和4-13，这两株突变菌的酶活力分别提高了19％和30％。和野生的海洋节杆菌相比，突变菌株的最适作用温度和最适作用pH都发生了一定的变化。电镜观察到突变菌的细胞表面有明显的凹陷。提取野生菌株和两株突变菌株的基因组，经过聚合酶链式反应获得右旋糖苷酶的酶基因，经过基因比对，和野生海洋节杆菌KQ11相比，突变菌右旋糖苷酶基因的碱基对发生了改变，其相应的氨基酸位点也发生了改变。右旋糖苷酶的三级结构显示第472位的氨基酸位于无规卷曲处，可能该位点位于右旋糖苷酶的底物结合和催化的位点，这就是突变菌株酶活提高的原因。
　　为了进一步提高产右旋糖苷酶突变菌株的产酶活力，对突变菌4-13的培养基配方进行优化，经过单因素实验、PB实验、最陡爬坡实验和中心复合实验得到了突变菌的最适发酵条件和培养基配方，在最佳条件下突变菌4-13的酶活是野生菌KQ11的1.58倍。
　　克隆突变菌4-13的右旋糖苷酶基因，并与载体pEt-28a双酶切之后，将酶切产物于载体相连后倒入感受态的受体细胞。用含氨苄青霉素的LB培养基培养重组大肠杆菌，当菌浓度达到0.7时，加入诱导物IPTG诱导产酶，离心搜集菌泥并超声破碎，离心后取上清并加入5ml的镍柱中，经镍柱纯化后和蛋白凝胶电泳证明，当嘧蹉的浓度为500mM时，洗脱出来的单一峰为右旋糖酐酶纯酶。纯酶酶学性质结果表明，纯酶的最作用温度为60℃，最适作用pH为6.5。金属离子K+、NH4+、Mg2+或Co2+能提适高纯酶酶活，而金属离子Cu2+或Fe3+则抑制酶活力。右旋糖苷酶的主要最终水解产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖。
　　右旋糖苷酶可以特异性的水解水溶性多糖的α-1，6糖苷建，所以其在牙菌斑的防治方面有很好的应用前景。经扫描电镜和激光共聚焦扫描电镜观察表明，右旋糖苷酶不仅可以有效的抑制正在形成的生物膜，而且还对已经形成的生物膜有很好的清除作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 右旋糖苷酶的研究进展

1．1 右旋糖苷酶的定义及分类

1．2 右旋糖苷酶的来源

1．3 右旋糖苷酶的应用

1．4 常压室温等离子体诱变的研究进展

1．5 牙菌斑防治的研究进展

1．6 论文研究的意义和内容

第二章 海洋氧化节杆菌KQ11的常压室温等离子体诱变育种

1 材料方法

1．1 材料

2 实验方法

2．1 诱变方法

2．2 突变菌的遗传稳定性

2．3 突变菌株细胞表面的变化

2．4 突变菌株的右旋糖酐酶的分子量

2．5 突变菌酶学性质比较

2．6 突变位点的检测

2．7 酶活力的测定

3 结果与分析

3．1 突变菌的筛选

3．2 突变菌的遗传稳定性

3．3 突变菌细胞表面的变化

3．4 突变菌株右旋糖苷酶的分子量

3．5 突变菌菌株酶学性质的检测

3．6 突变位点的检测

第三章 突变菌株产酶条件的优化

1 试验材料

1．1 材料

2 实验方法

2．1 单因素优化

2．2 Plackett-Buman和爬坡实验

2．3 响应面和中心复合实验

3 结果与分析

3．1 单因素实验结果

3．2 PB和最陡爬坡实验

3．3 响应面和中心复合实验

3．4 响应面验证试验

第四章 右旋糖苷酶的纯化和性质研究

1 材料

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 培养基配方

2 方法

2．1 酶活力测定

2．2 突变菌4-13工程菌的构建

2．3 右旋糖苷酶的纯化

2．4 纯酶酶学性质研究

2．5 纯酶的底物特异性

2．6 纯酶的反应终产物

3 结果与分析

3．1 工程菌的构建

3．2 右旋糖苷酶的纯化

3．3 纯酶的酶学性质

3．4 纯酶的底物特异性

3．5 最终水解产物分析

第五章 右旋糖酐酶的应用

1 实验材料

1．1 菌株来源

1．2 实验材料

2 试验方法

2．1 药物最低抑制生物膜浓度

2．2 右旋糖苷酶对正在形成的生物膜的抑制

2．3 右旋糖苷酶对不同时间生物膜形成的影响

2．4 右旋糖苷酶对已形成的生物膜的清除作用

3 实验结果

3．1 药物最低抑制生物膜浓度

3．2 右旋糖苷酶对培养不同时间的生物膜的影响

3．3 右旋糖苷酶对不同时间生物膜形成的影响

3．4 右旋糖苷酶对已形成的生物膜的清除

全文结论

创新点

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

致谢