用于抗因子Xa试验通用校准的工具和方法

摘要

本发明涉及凝固试验领域的诊断工具和方法。具体涉及测定在受试者样品中由第一抗凝剂引发的抗凝剂活性的方法，包括测量所述受试者的体液试验样品中的第一因子Xa活性，测量包含第二抗凝剂的预定的抗凝活性的至少一种基准样品中的第二因子Xa活性，基于第一和第二测量的因子Xa活性计算试验样品中包含的抗凝活性的通用参数，将抗凝活性的所述参数与至少三种抗凝剂的预期抗凝活性的预定范围相比较。此外提供了辅助所述方法的计算机程序代码以及实施所述方法的系统以及试剂盒。

说明书

本发明涉及凝固试验领域的诊断工具和方法。具体地，涉及测定在受 试者样品中由第一抗凝剂引发的抗凝剂活性的方法，包括测量所述受试者 的体液试验样品中的第一因子Xa活性，测量至少一种基准样品中的第二 因子Xa活性，所述基准样品包含第二抗凝剂预定的抗凝活性，基于第一 和第二测量的因子Xa活性计算试验样品中包含的抗凝活性的通用参数， 将抗凝活性的所述参数与至少三种抗凝剂的预期抗凝活性的预定范围相 比较。本发明还提供了协助该方法的计算机程序代码，以及实施所述方法 的系统和试剂盒。

任何较大的生物体均具有血液循环系统，其为不同的器官带来氧气和 营养，并处理掉二氧化碳和废物。然而为了血液循环系统能够工作，血管 中的损伤必须快速有效地闭合。此功能是由血液凝固系统完成的，其为能 够使血液形成血小板聚集物和纤维蛋白凝胶的复杂机制，后者能够拟合闭 合血管损伤。

然而，血液凝固不仅会导致止血，即血管损伤的闭合，还会导致血栓 形成和栓塞，即血管被血块关闭。血栓形成和栓塞可以有许多表现，例如 腿中的静脉血栓形成，肺栓塞，心肌梗塞和中风。因此血液凝固系统是重 要的挽救生命的过程，但是如果血液凝固闭合了重要的血管，其也可导致 严重的并发症，甚至导致患者死亡。

血液凝固系统中涉及的一个机制是凝血因子级联，其为一系列丝氨酸 蛋白酶类，经连续活化，并最终导致形成凝血酶——血液凝固系统的核心 酶。凝血酶能够将纤维蛋白原分解为纤维蛋白，其脱落，聚合为纤维蛋白 纤维，纤维蛋白纤维形成纤维蛋白凝块。凝血酶还活化辅因子，辅因子加 速自身的产生(因子V和因子VIII)，活化因子XIII——一种转谷氨酰胺酶， 其交联，从而稳定纤维蛋白凝块，凝血酶还是血小板的有力活化剂。

当个体衰老，并由于风险因子(例如糖尿病、肥胖、吸烟和遗传风险 因子)加速衰老，血栓形成事件的风险也逐渐增加。因此已研发抑制凝固 系统的药物，即所谓的抗凝剂。最成功的抗凝剂类药物之一是因子Xa的 抑制剂，因子Xa是一种将凝血酶原活化为凝血酶的丝氨酸蛋白酶。因子 Xa的形成是紧邻凝血酶活化之前的步骤。

因子Xa被几种不同药物抑制，例如低分子量肝素，戊多糖，利伐沙 班(Rivaroxaban)、阿哌沙班(Apixaban)、和未分级分离的(unfractionated) 肝素。这些药物具有不同的结构、分子、以及机制，但它们共有相同的特 征，即它们全都导致因子Xa的抑制，从而导致凝血酶产生的减少。

针对因子Xa的多数药物通常非常安全，不需要在临床应用中对其效 果进行常规监测。但仍然会有期望能够测量这些药物活性的情况：例如当 治疗医生怀疑患者可能不会按时按量服药，而想要控制药物水平，或如果 患者患有可能导致药物在循环中累积的疾病，从而导致出血并发症，或在 十分年老的患者、儿童或严重肥胖的患者中，或在患者接受抗凝剂治疗期 间经历并发症(即出血或血栓形成)的患者中，医生想要厘清当前的抗凝 状态。

通常使用两种总体测定法测量凝血因子的活性：凝血酶原时间(PT)和 激活的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。两种测定法中均在开始时刺激凝 固级联(在PT中通过组织因子，在aPTT中通过接触活化剂进行)，在一系 列酶促反应之后，凝血酶形成，样品凝固。试验开始和样品凝固之间的时 间为凝固时间，其指示凝血因子的活性。然而在两种测定法中，因子Xa 的形成均仅为许多步骤中的一步，因此aPTT和PT对于因子Xa的多数抑 制剂灵敏度低，并对实际药物活性的定量能力差(见例如EP1734369A1)。

已研发了定量因子Xa抑制的更具特异性的方法。测量因子Xa抑制 的测定法也称为―抗Xa试验‖或―抗因子Xa试验‖。这样的抗因子Xa试验 的共同特征在于将样品加入两种试剂：一种包含因子Xa，一种包含可被因 子Xa分解的肽底物。之后记录反应溶液中肽底物经由因子Xa的转化。肽 底物包含某个氨基酸序列，使其可以被因子Xa切割，其中转化速度与样 品中因子Xa的活性成比例。当底物被因子Xa分解，则介导信号反应，其 由分析器测量，该分析器实施所述抗Xa试验。通常提供可检测标记的化 学基团(例如色原或荧光团)与肽底物共价结合。当使用这样的产色肽底物 时，释放改变溶液颜色的基团，其可用光度计测量。当使用生荧光的底物 时，释放荧光基团，对反应进行电化学测量时，因子Xa对底物的分解导 致反应溶液离子结构的改变。不同底物的共同特征是，在每个情况中样品 中均发生信号反应，其与样品中因子Xa的浓度成比例，并有分析器记录。

在向样品中加入含因子Xa的试剂和加入含底物的试剂之间，可以有 温育步骤，使得样品中的因子Xa抑制剂可以抑制因子Xa。但也有不用这 样的温育步骤的测定法。任选地，还可加入影响测定法特异性的其他物 质，例如硫酸葡聚糖或抗凝血酶。

因此测定法的结果是吸光度的变化，或吸光度变化的速度(或荧光或任 何其他所使用的信号反应)。为简单起见，认为信号反应是以mE(毫单位消 光)表达的吸光度变化。

如本领域公知，使用此吸光度，用校准曲线计算抗凝剂浓度。当仅在 治疗上应用2类因子Xa抑制剂(即未分级分离的肝素(UFH)和低分子量肝 素(LMWH))时研发了此程序。通常，用定标物完成单独的校准曲线，其 包含渐增剂量的LMWH或UFH，测量这些定标物之后，分析器确定校准 曲线，以从血浆样品中测定的吸光度值计算抗凝剂浓度。

同时，已向临床实践中引入了若干其他因子Xa抑制剂，针对例如利 伐沙班、戊多糖、达那肝素(Danaparoid)的定标物和对照也是可获得的。

如今在任何较大的医院，均同时使用多种不同的抗凝剂。一些患者可 能在住院期间接受LMWH以预防深部静脉血栓形成(DVT)，其他患者可 能接受利伐沙班以预防心房颤动导致的中风，其他患者接受戊多糖以预防 髋关节置换手术中的DVT，而重症监护病房(ICU)的患者可能接受使用未 分级分离的肝素的治疗。

临床过程通常如下：辅助人员(例如抽血师、护士或较年轻的医师之一) 准备采血管用于采血，并填好说明需实施哪些测定的各个预订表格。采集 血液，与预订表格一起送到化验室。如果预订了LMWH、UFH、利伐沙 班或阿哌沙班试验，则实施抗因子Xa试验，并基于各校准曲线计算抗凝 剂浓度。而后该浓度通过化验室信息系统(laboratoryinformationsystem， LIS)递交给治疗医生，该系统通常通过内部网、或传真、信件或其他信息 手段可得。

然而，此预订测定法、校准、和结果表达的程序有若干缺陷。这些限 制影响程序的效率，且产生医疗风险。

例如，对于单个诊断方法(抗因子Xa-试验)需使用若干组定标物和对照 十分麻烦、昂贵且对化验室检查增加复杂性。设想如果每个化验室试验均 需要若干不同的校准、对照和技术检验程序(proficiencytesting procedure)，可想而知这将对化验室分析所涉及的努力和化验室花费增加 很大的负担。

此外还涉及风险，尤其是以下实例：如前所述血液试验的预订表格通 常不是由治疗医生本人所填，而是由医学教育水平或经验较低的辅助人员 (护士、抽血师、年轻医生)所填。如果现在辅助人员不小心预订了―LMWH‖ 试验，而患者接受利伐沙班，化验室将报告LMWH浓度，尽管患者可能 从未用此药物治疗过。这意味着化验室结果的表达比分析方法本身更具特 异性。所测量的是因子Xa抑制。然而，报告的却是具体药物的浓度。另 一种情况下，有可能评估患者的化验值的医生会看到血小板计数降低，同 时看到一定的LMWH浓度。该医生可能因此将此结果误解为肝素诱导的 血小板减少症。问题不仅仅在于错误的订单通过此过程传播，而是一开始 的错误信息通过该链被过高评价。如果护士告知医生该患者接受了 LMWH，医生可能会仔细检查该信息。然而如果医生从化验室的正式报告 收到―LMWH浓度‖，上面有负责的化验室人员签名，那么他会认为此信 息是正确的。

因此当前的诊断程序涉及校准程序的非常早期选择，其在很晚之后的 诊断过程中应用，用于校准的药物的错误选择在整个诊断过程中传播，并 被过高评价。诊断程序涉及一般性测量步骤(即因子Xa抑制)，而校准步骤 (针对各抗凝剂)对于使用者并不明确。校准程序是僵化的，即一旦报告了 结果，就无法改变校准，即使在过程早期就选择了错误的药物(Favaloro 2011，Pathology，Dec；43(7):682-92；Tripodi2013，ClinChem， Feb；59(2):353-62；和Gehrie2012，AmJHematol.，Feb；87(2):194-6).

本发明所面对的技术问题可视为提供满足上述需求的工具和方法。所 述技术问题由权利要求书和下文中描述的实施方案解决。

因此，本发明涉及测定在受试者样品中由第一抗凝剂引发的抗凝剂活 性的方法，包含：

(a)测量所述受试者的体液试验样品中的第一因子Xa活性；

(b)测量包含第二抗凝剂预定的抗凝活性的至少一种基准样品中的 第二因子Xa活性；

(c)基于第一和第二测量的因子Xa活性计算试验样品中包含的抗凝 活性的通用参数；和

(d)将抗凝活性的所述参数与至少三种抗凝剂的预期抗凝活性的预 定范围相比较，以确定抗凝剂活性。

本发明的方法优选为离体方法，即其在体外使用来自受试者的分离样 品进行。此外，可以包含上文详述的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可 涉及样品预处理或评估由所述方法得到的结果。所述方法可人工实施或经 自动化辅助。步骤(a)，和/或(b)可全部或部分由自动化辅助，例如分别为， 使用适当的机器人和感知设备用于在步骤(a)和/或(b)中的测定，和在步骤 (c)和(d)中在数据处理设备上使用计算机执行的计算或比较算法。优选至少 步骤c)和d)用计算机执行的算法进行。

根据本发明所使用的术语―测定抗凝剂活性‖指定性、定量或半定量地 测定抗凝剂活性在受试者样品中的存在。抗凝剂活性指化合物防止或抑 制血液凝固的能力，如本文他处更详细说明的。本发明的方法可以定量 或半定量地测定样品中存在的抗凝活性的量。此外，通过将从抗凝活性 衍生的参数与给定抗凝剂的预期抗凝活性的预定义范围相比较，还可以 鉴定在样品中引发抗凝剂活性的抗凝剂，即定性地测定(或鉴定)抗凝剂 活性。

如此处所使用的术语―抗凝剂‖指能够防止或抑制血液凝固的化合物。 血液凝固是熟知的过程，其中由血液形成纤维蛋白凝块，以避免由于例如 血管损伤导致的失血。血液凝固是涉及众多酶类和辅助物质的过程。为形 成纤维蛋白凝块，纤维蛋白原转化为纤维蛋白，后者随后相互交联。纤维 蛋白原和致使交联的酶——因子XIIIa均由蛋白酶凝血酶酶促活化。凝血 酶本身由因子Xa活化，后者则由组织因子/因子VIIa复合物或因子IXa/ 因子VIIIa复合物活化。因子VIIa、VIIIa和IXa也在血液凝固过程中依 次从其前体活化。由于这些酶以分级顺序彼此活化，这些酶的整体有时也 称作凝固级联。多种化合物已被描述为抗凝剂，其影响凝固级联的一种或 多种酶或辅助物质。例如香豆素类为植物来源的维生素K拮抗剂，其耗尽 生物体中维生素k的活性形式，后者作为辅助物质是凝血酶和因子VII、 IX和X活性所必需的。典型的香豆素类包括华法林，醋硝香豆醇，苯丙 香豆素，裂盒蕈色素，溴鼠灵或苯茚二酮。肝素是高度硫酸化的糖胺聚糖， 类似于另一类天然抗凝剂。它们活化抗凝血酶原III，后者封闭凝血酶和 凝固级联的其他酶(包括因子Xa)的活性，从而抑制纤维蛋白凝块形成。 通常，低分子量肝素(LMWH)或未分级分离的肝素(UFH)在抗凝治疗中作 为肝素使用。抗凝治疗还使用类肝素类(heparanoids)，例如达那肝素(也 称达那肝素钠(Orgaran))。若干药物，例如利伐沙班或阿哌沙班，据报 道为直接因子Xa抑制剂。其他因子Xa抑制剂包括戊多糖，例如磺达肝素 或艾屈肝素钠(Idraparinux)。因此第一抗凝剂可以是如上述的抗凝剂。 同样适用于根据本发明的第二抗凝剂。然而优选所述第一和第二抗凝剂是 不同的，即化学上不同的抗凝剂化合物。优选，所述第一和/或第二抗凝剂 选自由以下组成的组：LMWH、UFH、达那肝素、利伐沙班、戊多糖、和 阿哌沙班。

如此处所使用的术语―体液试验样品‖指包含抗凝活性的体液样品。优 选，所述体液试验样品为尿样品，全血样品或血浆样品。还涵盖预处理的 体液样品，例如柠檬酸盐血浆样品。

如此处所使用的术语―受试者‖指具有凝血系统的动物，优选指哺乳动 物，更优选指人。

术语―基准样品‖指包含第二抗凝剂的预定义的抗凝活性的样品，其在 本发明的方法中以校准目的使用。基准样品可通过对具有预定义的抗凝活 性基准样品或母样(mothersample)进行一定的稀释获得。通常，基准样 品中的抗凝活性由于其经过预定义是已知的，或者可以毫不费力地计算得 到。优选，根据本发明的基准样品包含由第二抗凝剂引发的预定义的抗凝 活性，更优选，第二抗凝剂选自由以下组成的组：LMWH、UFH、达那肝 素、利伐沙班、戊多糖、和阿哌沙班。优选，用于基准样品的抗凝剂的量 处于同样在体液样品中存在的范围。

应理解本发明的方法中可使用具有预定义的第二抗凝剂抗凝活性的 一种或多种基准样品用于确立校准。因此，术语―至少一种‖指一种或多种， 优选两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多基 准样品，其在所述样品中存在的预定义的抗凝活性彼此不同。

如此处所使用的术语―因子Xa‖指活化的丝氨酸-内肽酶，其能够通过 溶蛋白性裂解从凝血酶原活化凝血酶(E.C.3.4.21.6)。该酶也称为斯图尔特 -普劳厄因子(Stuart-Power-factor)或凝血酶原酶。多种动物物种(包括 人)中的该酶结构均为已知。人因子Xa前蛋白原的氨基酸序列存储于 NCBIReferenceNP_000495.1(GI:4503625)，小鼠氨基酸序列存储于 NCBIReferenceNP_001229297.1(GI:334724425)。如本文他处所讨论的， 因子Xa由于组织因子/因子VIIa复合物或因子IXa/因子VIIIa复合物的 蛋白水解裂解，从其前体因子X活化。应理解该术语也涵盖这样特定的因 子Xa蛋白的变体。这样的变体为在氨基酸序列中至少以一个氨基酸取代、 缺失和/或添加而有所不同的蛋白，且显示因子Xa活性。通常变体因子Xa 的氨基酸序列与上述特定因子Xa蛋白的氨基酸序列仍然具有至少50％， 60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％或99％同一性。 两条氨基酸序列之间的同一性程度可以用本领域熟知的算法确定。优选， 通过比较两条在比较窗口(例如氨基酸序列之一的全长或至少其50％)中 最优比对的序列确定同一性程度，其中为了最佳比对，与参考序列比较时， 比较窗口中的氨基酸序列片段可包含添加或缺失(例如缺口或突出端)。如 下计算百分比，通过测定在两条序列上均出现的相同氨基酸残基的位置数 产生匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数，将结果 乘以100以得到序列同一性百分比。用于比较的最佳序列比对可用以下实 施：Smith和Waterman1981，Add.APL.Math.2:482的局部同源性算法， Needleman和Wunsch1970，J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法， Pearson和Lipman1988，Proc.Natl.AcadSci.(USA)85:2444的相似性方 法搜索，这些算法的计算机实现(GAP，BESTFIT，BLAST，PASTA，和 TFASTA，见WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputer Group(GCG)，575ScienceDr.，Madison，WI)，或目测检查。如果已鉴 定两条序列用于比较，优选使用GAP和BESTFIT以确定其最佳对齐，从 而确定同一程度。优选地，使用5.00作为空位权重缺省值，0.30作为空位 权重长度缺省值。上述变体可以是等位变体或任何其他物种特异性同源 物、旁系同源物或直系同源物。此外，此处所指的变体包括因子Xa片段 或上述类型的变体，只要这些片段具有上述的必要生物性质即可。这样的 片段可以是例如因子Xa的降解产物或化学修饰形式，例如翻译后修饰的 变体。此外，变体还包括具有例如，改善的切割性质的遗传修饰的因子Xa 突变体。

如此处所使用的术语―因子Xa活性‖指生物活性因子Xa对样品赋予的 生物活性。包含生物活性因子Xa的样品能够通过蛋白水解切割凝血酶原 活化凝血酶。因子Xa活性可在根据本发明的方法的体液样品中提供，作 为内源存在的因子Xa活性，或通过对样品外源提供生物活性因子Xa或如 上述的其变体。本发明的方法还涵盖这样的体液样品，其中因子Xa活性 通过对样品外源补充因子X活化酶提供。可优选应用的因子X活化酶包括 血液凝固级联的内源活化酶，例如组织因子/因子VIIa复合物或因子IXa/ 因子VIIIa复合物，或其他天然存在或遗传改造的因子X活化酶，例如 RVV-X，来自山蝰蛇(Russel′sviper)毒或来自钝鼻蝰(Viperalebetina)， 洞蛇属物种(Bothropsspec.)，蝮蛇属物种(Akgistrodonspec)，或小 蝰属物种(Echisspec.)的毒液。

如此处所使用的术语―测量‖指定量地评估本发明的方法的样品中存在 的因子Xa活性，即测定样品因子Xa活性的量。测量因子Xa活性可通过 检测所述样品中存在的生物活性因子Xa的量完成。这样的检测通常可以 通过直接或间接检测因子Xa活性的测定法进行。由于根据本发明决定性 的因子Xa活性是切割凝血酶原的能力，从而是因子Xa的丝氨酸蛋白酶活 性，，适当的测定法优选目的在于评估包含因子Xa切割位点的底物由因 子Xa进行的切割反应。评估切割反应可以包括检测切割的底物量，以及 切割反应的速度。这两项参数均可定量评估样品中存在的因子Xa活性。 此外，因子Xa活性的测量还可通过直接检测样品中存在的生物活性因子 Xa分子的量进行，例如通过确认特异性抗体或适体进行。

然而优选地，根据本发明所述测量样品中所述因子Xa活性包括：

a)在允许底物的酶促转化的条件下，将所述样品与包含至少因子 Xa和因子Xa底物的试剂接触，从而底物的物理或化学性质以可检测的方 式改变；和

b)检测底物的物理或化学性质改变的程度；和

(c)将所述改变的程度与参考相比较，从而测量样品中的因子Xa活 性。

术语―试剂‖通常指两种试剂，一种包含生物活性因子Xa，另一种包含 其底物，即因子Xa底物。当两种试剂均加入样品时，因子Xa底物的酶促 转化反应开始，如果样品中存在抗凝剂活性，则反应可以得到抑制。可以 想见，两种试剂成分(即Fxa和FXa底物)也可以在一种试剂中提供，适当 的时候指在血浆样品加入混合物之前防止底物转化的发生。

应理解上述情况通常还可包括加入辅助化合物用于酶促转化，和/或用 某些抗凝剂对其进行抑制，和/或加入稳定剂。从而，可以稳定反应混合物 的组分和/或样品，反应的标准化或精确性或其灵敏度/特异性可以得到改 进。一种辅助化合物可以是抗凝血酶，其为肝素对因子Xa作用的主要成 分。其他化合物可包括硫酸葡聚糖，肝素拮抗剂例如1,5-二甲基-1,5-二氯 十一亚甲基聚甲溴化物或肝素酶，稳定剂例如白蛋白、明胶、甘氨酸、其 他蛋白、糖分子或可以改善试剂稳定性的任何其他化合物。还可加入抗微 生物物质以防止溶液中细菌污染或细菌生长。还可应用抗氧化剂或氧吸收 剂。

如此处所使用的术语―因子Xa底物‖指肽或多肽或非肽化合物，其可 被生物活性因子Xa的丝氨酸蛋白酶切割。肽或多肽因子Xa底物优选包含 因子Xa识别和切割位点，且可通过例如基因工程得到。因子Xa底物被因 子Xa切割后，底物的至少一种物理或化学性质改变。如此处所使用的术 语―物理或化学性质‖涵盖物理性质例如分子量，大小、密度、磁共振、极 化、光密度、粘度等，以及化学性质，例如荧光，共振能量转移性质、产 色性质、电化学性质、免疫学性质或生物化学性质。优选，所述物理或化 学性质选自由以下组成的组：荧光性质，光学性质和电化学性质。因此， 通常因子Xa底物是荧光、产色或产电(amperogenic)底物。荧光或产色 底物通常包含荧光团或生色团，以及猝灭部分，它们通过包含因子Xa切 割位点的接头分开。在未切割状态，猝灭部分抑制荧光或颜色。被因子Xa 切割后，猝灭部分无法再抑制荧光团的荧光或生色团的颜色。因此，切割 后荧光或颜色的程度可以与暴露于底物的因子Xa活性的程度相关。其他 因子Xa底物可使用例如供体荧光团和受体之间的共振能量转移。切割后， 无法再实现共振能量转移，其导致荧光改变。同样，改变的程度与底物所 接触的因子Xa活性相关。优选的底物包括产色底物S-2732(Suc-Ile-Glu (γ-pip)-Gly-Arg-pNAHCl)，CH₃SO₂-D-Leu-Gly-Arg-pNAAcOH， CH₃OCO-D-CHG-Gly-Arg-pNAAcOH，C₂H₅OCO-D-Val-Gly-Arg-pNA AcOH，CH₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNAAcOH， Cbo-Ile-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNAHCl，Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA2HCl或 荧光底物CH₃SO₂-D-CHA-Gly-Arg-AMCAcOH或 Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC。

然而如本领域技术人员已知的，存在许多不同的底物，其均可用于检 测FXa活性。

检测底物物理或化学性质的变化可通过适当分析器进行，其能够检测 变化及其程度。取决于物理或化学性质变化的性质，可使用不同的分析器， 此为技术人员所熟知。因此，分析器通常可依靠光学变量信号的测量(例如 吸光度或荧光)，电变量信号(例如电阻、电容、阻抗或其组合)，切割和未 切割状态下因子Xa底物的磁共振信号所衍生的信号。基于这样的信号的 强度变化，可以测定变化的程度，其与酶促反应的效率相关，从而与样品 中的因子Xa活性相关。应理解测量的因子Xa活性会被各样品中第一或第 二抗凝剂的存在产生的抗凝剂活性所影响。

计算抗凝活性的通用参数包含将来自体液样品的第一测量的因子Xa 活性与来自至少一种基准样品的第二测量的因子Xa活性相比较，其中因 子Xa活性的校准通用参数已被分配给所述第二测量的因子Xa活性。随后， 可以从所述校准通用参数得到体液试验样品中包含的抗凝活性的通用参 数。优选地，校准通用参数(P)由以下算式进行计算：P＝100+(100*测 量的抗凝活性)。所述计算优选可在数据处理装置上进行，例如自动执行所 述计算的具有可感知地植入的计算机程序代码的计算机。

体液样品中包含的抗凝活性的通用参数最终将与至少三种抗凝剂的 预期抗凝活性的预定范围相比较。取决于通用参数是否落入一种或多种抗 凝剂的预定义范围之中，或在这些范围之外，可以对患者体液样品中存在 的抗凝剂活性的强度、抗凝剂的性质和/或抗凝剂的量得出结论。此外，可 以计算对于抗凝剂特异的因子Xa活性，和/或确定可以施用于患者的抗凝 剂的剂量。因此，可以通过应用本发明的方法得到对患者进行抗凝剂治疗 的结论。比较以及潜在的结论得出可优选在数据处理装置上进行，例如具 有可感知地植入的适当的计算机程序代码的计算机。

通过分析来自适当患者群体的样品确定预定义的范围。例如可以分析 来自以预防剂量接受利伐沙班的患者的样品，在患者最后一次剂量2-3小 时后取血液样品。然后对所得值进行统计学分析，例如通过测定抗凝剂活 性的95％置信区间。上述分析将提供以预防剂量的利伐沙班治疗的患者的 预期峰值。

另一实例为分析以特定剂量LMWH治疗的样品，在马上要施用下一 LMWH剂量之前实施取样。此分析将提供以此特定剂量LMWH治疗的 患者中抗凝剂活性的预期波谷水平。

因此，优选本发明的方法还包含测定第一抗凝剂剂量的步骤，所述抗 凝剂基于步骤(d)中的测定结果施用给受试者。所述剂量的测定可以优选在 数据处理装置上进行，例如自动实施所述测定的具有可感知地植入的计算 机程序代码的计算机。

本发明的方法特别优选的实施方案如下述：

在本发明方法的一个具体实施方案中，待分析的样品为柠檬酸盐血 浆。所述柠檬酸盐血浆与包含因子Xa和产色底物以及特别是S-2732的反 应混合物相接触。通常，所述反应混合物还包含缓冲液和稳定剂。酶促底 物的转化通常通过连续记录405nm处的溶液吸光度测量。底物被因子Xa 高速转化导致光密度激增，其由反应期间的δ-E表达(反应期间的光密度变 化)。低速转化导致低δ-E。取决于样品中针对试剂中因子Xa的抑制活性， 检测到不同的吸收率。优选应用四种基准样品。通常，所述样品包含针对 当前WHOLMWH标准校准的0，0.5，1和1.5抗因子Xa单位LMWH/ml。 基准样品可以以预混合形式提供，或可以通过对具有最高LMWH浓度的 基准样品进行适当稀释得到。校准的指定值优选为，0抗Xa单位/ml定 标物为100XU，0.5抗Xa单位/ml定标物为150XU，1抗Xa单位/ml定 标物为200XU，1.5抗Xa单位/ml定标物为250XU，其中―XU‖指针对 因子Xa的抗凝剂活性的任意单位。使用此校准，方法的结果以XU表达。 如果样品包含少量或无针对因子Xa的抗凝剂活性，XU接近100，并且如 果存在针对因子Xa的活性，则XU渐增升高。当多于一种的抗凝剂的预 期范围值为预定义时，可以通过与所述预期范围值相比较定性和定量地评 估抗凝剂活性。

在本发明的方法另一具体优选实施方案中，在将施用的抗凝剂分配为 测定的XU值后，可以从XU计算施用给受试者的抗凝剂的量。

用于计算通用抗凝剂单位的上述算法得到的典型试验结果约100 XU(无抗凝剂活性)，对于具有抗凝剂活性的样品，渐增至约150XU，200 XU或甚至更高的值。此单位系统容易记忆，但另一方面不与INR值(作为 凝血酶原时间的表达)或aPTT结果相混淆。然而，基本本发明的方法，显 而易见还可以定义其他单位系统，其中例如不具有抗凝剂的样品可具有0 XU，1XU或1000XU，或任何其间的值的结果。

出人意料地发现根据本发明可以校准针对一种抗凝剂的因子Xa抑制 测定法的结果，以任意单位表达该结果，并使用此校准评估其他抗凝剂药 物的活性。从而，得到通用校准技术，对于许多针对此途径的药物，其允 许标准化因子Xa抑制试验的结果。此外发现，可以在评估抗凝剂活性的 后期，基于通用校准的结果，计算对应于测量的通用因子Xa抑制活性的 个体药物活性，从而允许医生基于测定的因子Xa抑制活性计算药物活性。

从试验效率的角度，本发明的方法优点在于其可简化工作流程，因为 对于抗因子Xa试验只需要一种校准，这意味着只需要一组定标物，一组 对照和一项水平检验程序。并且简化了预订过程，因为只要预订一项试验 (抗因子Xa-试验)，而非有若干不同选择(LMWH，UFH，利伐沙班，阿哌 沙班等)。此外，从医疗价值角度，降低了风险，因为该测定程序的结果的 表达与试验程序本身一样通用。而在现有技术中，测定结果的表达导致与 试验本身一样更加特异性的药物浓度，当诊断过程早期(即预订试验时) 发生错误时，其可产生误解和错误。使用本发明的方法，结果表达为通用 因子Xa抑制单位，从而反应所测量的，即因子Xa抑制。在现有技术试验 中，例如可能报道利伐沙班浓度，尽管患者可能接受了阿哌沙班、戊多糖 或任何其他抑制因子Xa的药物。

本发明的方法中，所报道的与所测量的(即因子Xa抑制)更加紧密相 关。这消除了如下风险，在诊断链早期试验的错误预定在整个诊断过程中 传播并最终导致化验室报道错误的信息(例如利伐沙班浓度，尽管患者并未 接受此药物)。根据本发明的方法，仍然可以以药物浓度表达结果，但这是 在诊断链后期决定的，且对医生是透明的，医生会在化验室信息系统中选 择药物，并要求从抗因子Xa活性计算药物浓度，或这将基于系统中可得 的药物处方信息在医院信息系统这一层次自动进行。

除非下文另外说明，则上述给出的术语的解释和定义适应性应用于所 有下述实施方案。

在本发明的优选方法中，所述方法还包含基于测定的抗凝剂活性推荐 治疗或诊断措施的步骤。

如此处所使用的术语―治疗措施‖指影响或可能取决于受试者凝血情况 的任何措施。优选，治疗措施包括施用药物，适应性更改药物剂量，应用 手术，伤口和损伤处理，适应性调整生活方式和/或营养等。如此处所使用 的术语―诊断措施‖指旨在测定受试者凝血情况的任何措施，包括本发明的 方法。诊断措施包括选择诊断试验，以及决定诊断的频率。

在本发明的另一优选方法中，所述方法还包含基于测定的抗凝剂活性 应用治疗或诊断措施的步骤。

在本发明的又一优选方法中，所述方法还包含基于测定的抗凝剂活性 管理受试者的步骤。

本发明还涉及可感知地植入数据处理器的计算机程序代码，所述计算 机程序代码至少实施本发明的方法的步骤c)和d)。

此外，本发明涉及测定在受试者样品中由第一抗凝剂引发的抗凝剂活 性的系统，包含：

(a)分析单元，其能够测量所述受试者样品中和包含第二抗凝剂预 定的抗凝活性的至少一种基准样品中的因子Xa活性；和

(b)评估单元，其包含(i)计算机实现的算法，其基于第一和第二测 量的因子Xa活性计算试验样品中包含的抗凝活性的通用参数，和(ii)计算 机实现的算法，其将抗凝活性的所述参数与至少三种抗凝剂的预期抗凝 活性的预定范围相比较。

如此处所使用的术语―系统‖涉及布局，其中上述单元相互有效连接， 从而可以实现抗凝剂活性的测定。所述单元可包含在分离的外壳或在单一 外壳之中。两个单元优选通过有线或无线方式有效连接，例如通过无线 LAN，蓝牙或因特网。因此，单元间不一定在物理距离上相邻近。然而， 所述有效连接需要将由分析单元测量的因子Xa活性传输至评估单元，从 而所述评估单元可基于传输的因子Xa活性数据实施上述评估步骤。

根据本公开的分析单元优选为独立设备，或在更大的仪器中的模块， 其实施一种或多种检测，例如以定量和/或定性方式测量因子Xa活性。例 如，分析单元可实施或辅助移液、配量、混合样品和/或试剂。分析单元可 包含试剂容纳单元，以容纳试剂，从而实施测定法。可将试剂安排在例如 容器形式、或盛有单个试剂或试剂组的盒中，置于适当的容器中或位于储 存区室或运送装置中。根据一些实施方式，分析单元可配置为用于分析物 的光学检测，所述分析物为例如在其被因子Xa酶促转化之前和/或之后产 色、产荧光或产电的底物。配置为用于光学检测的示例性分析单元包含配 置为将电磁能转化为电信号的装置，其包括单和多元件两者，或阵列光学 检测器。根据本公开，光学检测器能够监测光学电磁信号，并提供相对于 基线信号的电输出信号或响应信号，指示置于光学通道中的样品中分析物 的存在和/或浓度。这样的装置还可包括例如，光电二极管，包括雪崩光电 二极管，光电晶体管，光导检测器，线性传感器阵列，CCD检测器，CMOS 检测器，包括CMOS阵列检测器，光电倍增管，和光电倍增管阵列。根据 某些实施方案，光学检测器，例如光电二极管或光电倍增管，可包含其他 信号调节或处理电子配件。例如，光学检测器可包括至少一种前置放大器， 电子滤光器，或集成电路。适当的前置放大器包括，例如，集成化，跨阻 抗，和电流增益(电流反射镜)前置放大器。此外，根据本公开的一种或多 种分析单元可包含光源用于发光。例如，分析单元的光源可由至少一种光 发射元件组成(例如发光二极管、电力辐射源例如白炽灯，电致发光灯，气 体放电式灯，高强度放电式灯，激光)，用于测量被检验的样品分析物浓度 或产生能量转移(例如，通过荧光共振能量转移或催化酶)。此外，系统的 分析单元可包括一个或多个温育单元(例如，在允许底物的酶促转化的条件 下，将所述样品与包含至少因子Xa和因子Xa底物的反应混合物相接触， 从而底物的物理或化学性质以可检测的方式改变)。

此外，此处公开的系统的分析单元可包含、或有效连接于反应器或小 池进料单元。示例性进料单元包括液体加工单元，例如移液单元，以将样 品和/或试剂递送至反应器。移液单元可包含可重复使用的可洗针头，例如 钢针头，或一次性使用吸管端。分析单元还可包含一个或多个混合单元， 例如振荡器，以摇动包含液体的小池，或搅拌叶板，以混合小池或试剂容 器中的液体。

评估单元通常包含数据处理装置，其实施上述算法，用于计算通用参 数，并将其与至少三种抗凝剂的预期抗凝活性的预定范围相比较。所述预 定义的范围可以存储在存储器中，存储器通常也包含在评估单元中。数据 处理装置例如可以是通用计算机或便携计算装置。还应理解多个计算装置 可以一起使用，例如通过网络或其他转移数据的方法，以实施此处公开的 方法的一个或多个步骤。示例性计算装置包括台式计算机，笔记本电脑， 个人数据助手(―PDA‖)，例如掌上设备(cellulardevices)，平板电脑(tablet computers)，服务器等。基本上，数据处理装置包含能够实现多种指令， 例如计算机程序代码形式的算法的处理器。数据处理装置通常能够访问存 储器。存储器是计算机可读介质，可包含单个存储装置或多个存储装置， 位于计算机设备本地或计算设备可例如通过网络访问。计算机可读介质可 以是任何可得的可由计算机设备读取的介质，包括易失的和不易失的介 质。此外，计算机可读介质可以是可移动的和不可移动的介质之一或两者。 例如但不限于，计算机可读介质可包含计算机存储介质。示例性计算机存 储介质包括但不限于，RAM，ROM，EEPROM，闪速存储器或任何其他 存储技术，CD-ROM，数字多功能光碟(DVD)或其他光盘存储，盒式磁带 (magneticcassettes)，磁带(magnetictape)，磁盘存储器或其他磁盘 存储装置，或其他任何介质，其可用于存储多条能够由数据处理装置存取 并由所述装置的信息处理器执行的指令。

通常存在于评估单元的软件通常可包括指令，所述指令由数据处理装 置的处理器执行时，可实施此处公开的方法的一个或多个步骤。一些指令 可经适应性修改以产生信号，其控制其他机器的操作，从而可通过那些控 制信号进行操作，以转化远离计算机本身的材料。所述指令还可包含算法， 其通常被视为导致期望结果的自相容的一系列步骤。这些步骤需要对物理 量进行物理操作。通常但非必需的，这些量为电脉冲或磁脉冲或信号形式， 能够被存储、转移、转化、组合、比较或进行其他操作。通常由于常用的 原因，证明有时提及这些信号如数值、字符(characters)、显示数据、数字 等作为提及这样的信号所体现或表达的物理物件或现象是方便的。但应注 意，所有这些和相似的术语都应与适当的物理量相关联，并在此仅作为应 用于这些量的方便的标签使用。根据本公开的一些实施方案，用于计算通 用参数和用于将其与至少三种抗凝剂的预期抗凝活性的预定范围相比较 的算法，通过执行指令进行体现和实施。数据处理装置还可访问输出装置。 示例性输出装置包括例如传真机，显示器，打印机和文件。根据本公开的 一些实施方案，数据处理装置可实施此处公开的方法的一个或多个步骤， 并随后通过输出装置提供输出。

优选地，计算抗凝活性通用参数的计算机执行的算法将第一测量的因 子Xa活性与来自至少一种基准样品的第二测量的因子Xa活性相比较，其 中因子Xa活性的校准通用参数已被分配给所述第二测量的因子Xa活性， 并从所述校准通用参数得到体液试验样品中所包含的抗凝活性的通用参 数。

此外，本发明提供了用于测定样品中的第一抗凝剂引发的抗凝剂活性 的试剂盒，其包含至少一种基准样品和优选地因子Xa和因子Xa底物，所 述基准样品包含第二抗凝剂预定的抗凝活性。

如此处所使用的术语试剂盒‖指一组上述成分，优选分别提供或在单个 容器中提供。样品以及因子Xa和因子Xa底物可在本发明的试剂盒中以―即 用型‖液体形式或干燥形式提供，其中因子Xa和因子Xa底物在两个分离 的容器中提供，或组合提供。后者的情况中可能需要加入溶剂以实施本发 明的方法。适当的溶剂为技术人员所熟知，并可优选包括在本发明的试剂 盒中。试剂盒还可包括对照、缓冲剂、和/或试剂。试剂盒还包含实施本发 明的方法的说明，以及至少3种抗凝剂期望值的信息。这些说明可以是手 册、可电子访问的信息的形式，或可由计算机程序代码提供，其可以实施 本发明方法中所提及的计算和比较，并在计算机或数据处理装置上执行时 实现抗凝剂活性的测定。计算机程序代码可在数据存储介质或装置上提 供，例如光学存储介质(例如光盘)，或直接在计算机或数据处理装置上提 供。

本发明的另一方面涉及如上述的方法，计算机程序代码，系统或试剂 盒，其中测量因子IIa活性，而非因子Xa活性。

因此，本发明还涵盖测定在受试者样品中由第一抗凝剂引发的抗凝剂 活性的方法，包含：

(a)测量所述受试者的体液试验样品中的第一因子IIa活性；

(b)测量包含第二抗凝剂预定的抗凝活性的至少一种基准样品中的 第二因子IIa活性；

(c)基于第一和第二测量的因子IIa活性，计算试验样品中包含的抗 凝活性的通用参数；

(d)将抗凝活性的所述参数与至少三种抗凝剂的预期抗凝活性的预 定范围相比较，以确定抗凝活性。

如此处所使用的术语―因子IIa‖指活化的丝氨酸-内肽酶，其能够通过 溶蛋白性裂解将纤维蛋白原活化为纤维蛋白(E.C.3.4.21.5)。此外，该酶还 能够将因子XI转化为XIa，VIII转化为VIIIa，V转化为Va。该酶也称 为凝血酶。该酶的结构在多种动物物种(包括人)中均为熟知的。凝血酶 的人前蛋白原氨基酸序列存储于NCBI参考号(Reference)NP_000497.1 (GI:4503635)，小鼠氨基酸序列存储于NCBI参考号NP_034298.1(GI: 6753798)。如本文他处所讨论的，凝血酶由于被因子Xa蛋白水解裂解， 从其前体凝血酶原活化。应理解，该术语也涵盖这样特异性的凝血酶蛋白 的变体。这样的变体为如下的蛋白，其氨基酸序列因至少一个氨基酸取代、 缺失和/或添加而不同，并显示凝血酶活性。变体凝血酶的氨基酸序列通常 仍然与上述特异性凝血酶蛋白的氨基酸序列有至少50％，60％，70％， 80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％或99％同一性。两条氨基酸 序列之间的同一性程度可以用本领域熟知的算法确定。优选，通过比较两 条在比较窗口(例如氨基酸序列之一的全长或至少其50％)中最优比对的 序列确定同一性程度，其中为了最佳比对，与参考序列比较时，比较窗口 中的氨基酸序列片段可包含添加或缺失(例如缺口或突出端)。如下计算百 分比，通过测定在两条序列上均出现的相同氨基酸残基的位置数产生匹配 的位置数，用匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数，将结果乘以100 以得到序列同一性百分比。用于比较的最佳序列比对可用以下实施：Smith 和Waterman1981，Add.APL.Math.2:482的局部同源性算法，Needleman 和Wunsch1970，J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，Pearson和 Lipman1988，Proc.Natl.AcadSci.(USA)85:2444的相似性方法搜索，这 些算法的计算机实现(GAP，BESTFIT，BLAST，PASTA，和TFASTA， 见WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup (GCG)，575ScienceDr.，Madison，WI)，或目测检查。如果已鉴定两条 序列用于比较，优选使用GAP和BESTFIT以确定其最佳对齐，从而确定 同一程度。优选地，使用5.00作为空位权重缺省值，0.30作为空位权重长 度缺省值。上述变体可以是等位变体或任何其他物种特异性同源物、旁系 同源物或直系同源物。此外，此处所指的变体包括凝血酶片段或上述类型 的变体，只要这些片段具有上述的必要生物性质即可。这样的片段可以是 例如凝血酶的降解产物或化学修饰形式，例如翻译后修饰的变体。此外， 变体还包括具有例如，改善的切割性质的遗传修饰的凝血酶突变体。

如此处所使用的术语―因子IIa或凝血酶活性‖指生物活性凝血酶对样 品赋予的生物活性。包含生物活性凝血酶的样品能够通过蛋白水解切割从 纤维蛋白原活化纤维蛋白。凝血酶活性可根据本发明的方法在体液样品中 提供，作为内源存在的凝血酶活性，或通过对样品外源提供生物活性凝血 酶或如上述的其变体。本发明的方法还涵盖这样的体液样品，其中凝血酶 活性通过对样品外源补充凝血酶活化酶提供。可优选应用的凝血酶活化酶 包括血液凝固级联的内源活化酶，例如因子Xa。

在上述方法的优选实施方案中，所述第一和所述第二抗凝剂是不同 的。

在任何上述方法的优选实施方案中，样品中所述因子IIa活性的所述 测量包含：

a)在允许底物的酶促转化的条件下，将所述样品与包含至少因子 IIa和因子IIa底物的反应混合物接触，从而底物的物理或化学性质以可 检测的方式改变；和

b)检测底物的物理或化学性质改变的程度；和

(c)将所述改变的程度与参考相比较，从而测量样品中的抗因子IIa 活性的量。更优选，所述物理或化学性质选自由以下组成的组：荧光性质， 光学性质和电化学性质.

优选的底物涵盖产色底物Bz-FVR-pNA， H-D-Phe-Homopro-Arg-pNA·2乙酸盐，Sar-Pro-Arg-pNA， Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH，H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH， H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH，H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH， H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH，H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH或 CH₃OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH以及荧光底物Boc-Val-Arg-AMC· HCl，Boc-VPR-AMC，Bz-FVR-AMC或H-D-CHA-Ala-Arg-AMC· 2AcOH。

然而如本领域技术人员所已知的，许多不同的现有底物均可用于检测 FXa活性。

在任何上述方法的另一优选实施方案中，所述受试者为哺乳动物，优 选为人。

在任何上述方法的又一优选实施方案中，其中所述体液试验样品为尿 样品，全血样品或血浆样品。

在任何上述方法的优选实施方案中，计算抗凝活性的通用参数包含将 第一测量的因子IIa活性与来自至少一种基准样品的第二测量的因子IIa 活性相比较，其中抗因子IIa活性的校准通用参数已被分配给所述第二测 量的因子IIa活性，从所述校准通用参数得到体液试验样品中包含的抗凝 活性的通用参数。更优选，分配的通用参数(P)由以下算式进行计算:P＝ 100+(因子*用于校准的抗凝剂的量或活性)。

所述因子应以这样的方式选择，其使得抗凝剂的典型治疗量将提供 200IIU的通用抗凝参数(抗因子IIa活性的任意单位)。

在任何上述方法的优选实施方案中，所述第一和/或第二抗凝剂选自由 以下组成的组：重组水蛭素，达比加群，阿加曲班和比伐卢定。

在任何上述方法的另一优选实施方案中，至少步骤c)和d)通过计算机 执行的算法进行。

还涵盖可感知植入数据处理器的计算机程序代码，所述计算机程序代 码实施在任一上述方法的至少步骤c)和d)。

此外，涵盖了用于测定在受试者样品中由第一抗凝剂引发的抗凝剂活 性的系统，包含：

(a)分析单元，其能够测量所述受试者样品中和包含第二抗凝剂预定 的抗凝活性的至少一种基准样品中的因子IIa活性；和

(b)评估单元，其包含(i)计算机实施的算法，其基于第一和第二测量 的因子IIa活性，计算试验样品中包含的抗凝活性的通用参数，和(ii)计算 机实施的算法，其将抗凝活性的所述参数与至少三种抗凝剂的预期抗凝活 性的预定范围相比较。

在上述系统的优选实施方案中，所述计算抗凝活性通用参数的计算机 执行的算法将第一测量的因子IIa活性与来自至少一种基准样品的第二测 量的因子IIa活性相比较，其中因子IIa活性的校准通用参数已被分配给 所述第二测量的因子IIa活性，从所述校准通用参数得到体液试验样品中 包含的抗凝活性的通用参数。

最后提供了用于测定样品中由第一抗凝剂引发的抗凝剂活性的试剂 盒，其包含含有第二抗凝剂预定的抗凝活性的至少一种基准样品，和优选 地因子IIa和因子IIa底物。

说明书中所有引用的参考，其全部公开内容和本说明书中具体提及的 公开内容在此以参考方式引入本文。

附图

图.1显示使用LMWH定标物的通用校准。校准以称为―XU‖的任意 单位实施，并分配给aXaU/ml(aXa＝抗因子Xa)。

图.2显示不同实验室中肝素的校准曲线(图.2A实验室A，图2B实 验室B，图2C实验室C，和图.2D实验室D)。

图.3显示不同实验室中利伐沙班的校准曲线(图.3A实验室A，图3 B实验室B，图3C实验室C，和图.3D实验室D)。

图.4显示不同实验室中达那肝素钠的校准曲线(图.4A实验室A，图 4B实验室B，图4C实验室C，和图.4D实验室D)。

图.5显示不同实验室中的通用校准曲线(图.5A实验室A，图5B实 验室B，图5C实验室C，和图.5D实验室D)。

图.6显示来自通用校准单位的肝素(A)，利伐沙班(B)和达那肝素钠 (C)活性的校准曲线。

实施例

下列实施例应仅仅阐明本发明或其方面。它们而不应以任何方式视为 限制本发明的范围。

实施例1:因子Xa拮抗剂通用校准概念的评估(Unitest)

本研究的目的在于显示通用校准允许使用单一校准曲线监测针对因 子Xa的若干不同抗凝剂，而非现有技术中使用若干校准曲线。还应显示 其可以将通用校准的结果转化为实际药物浓度。

将3种不同抗凝剂的对照样品(低分子量肝素，利伐沙班＝Xarelto 达那肝素＝Orgaran)送到4个实验室，在3天中一式双份分析。在 第1天还测定各抗凝剂的校准曲线。

除了计算个体校准之外，还测定通用校准。

下文中评估了与个体校准相比，通用校准是否在三个中心提供了良 好的一致性。

将下列定标物送至实验室，并在第1天测定：

表1：不同实验室的定标物列表

将下列对照送至实验室，在1-3天分析：

表2：不同实验室的对照列表

测定法依如下实施：

分析前重构样品。将样品加入含牛因子Xa的溶液，再加入含产色底 物S-2732(Suc-Ile-Glu(γ-pip)-Gly-Arg-pNA，HCl)的第二溶液。测量溶液 的光密度，报道光密度的变化。所测定的血浆定标物和对照购自Hyphen biomed，抗Xa测定购自InstrumentationLaboratory。

使用LMWH定标物确定通用校准。以称为―XU‖的任意单位实施校 准。指定aXaU/ml与XU的关系如下：

以XU为单位的抗凝剂活性＝100+100*以aXaU/ml为单位的抗凝 剂活性；见图.1。

分别在三天中分析送到实验室的样品，并报道结果。

表3：校准的原始数据

表4：对照的原始数据

表5：对照的原始信号(mE)的平均值和变异系数(CV)

平均原始信号 cv 正常对照 1163 16.7％ LMWH对照 CI 962 20.0％ LMWH对照 CII 821 20.7％ LMWH对照 C3 700 20.8％ LMWH对照 C4 560 20.5％ 利伐沙班对照 C1 639 20.0％ 利伐沙班对照 C2 187 14.7％ 达那肝素钠对照 C1 791 19.7％ 达那肝素钠对照 C2 556 21.6％

这解释了为何首先需要校准。尽管所有4个中心均使用了同一批试 剂，相同的对照分析仍测量到约20％的CV，仅仅由于各中心所使用的设 备不同。

图2至5显示了不同校准和实验室的结果。图.2显示4个实验室对肝 素的校准曲线，图.3对利伐沙班，图4对达那肝素钠。图.5显示4个实验 室中建立的通用校准曲线。

表6：图2至5中显示不同校准的回归曲线和R^2值

表7：测定的抗凝剂浓度

分析显示了对各对照实施的24个测量的个体结果、平均值和CV(4个 实验室，3天，各2个测定)。

分析还揭示了校准个体药物的标准策略的问题：无抗凝剂的样品可 容易地成为阴性，其通常报道为(例如)0或<0.05aXaU/ml。例如当对临 床试验的结果进行统计学分析时，这仍然可能导致数学问题。

表8：使用通用校准的测量结果

与以抗凝剂浓度表达结果(现有技术)相比，使用通用校准的分析显示 显著更好的CV。并且无抗凝剂活性的结果表达的问题也未出现。

实施例2：基于通用校准测定抗凝剂活性

表9：所有三种抗凝剂来自4个实验室的校准曲线。校准曲线以原始 数据显示(δ-E＝dE)并以XU表达(通用校准＝Unitest)。

基于在四个中心测定的定标物平均XU值，计算校准曲线，以从XU 值确定抗凝剂活性；见图.6。

表10：校准的回归曲线和R^2值，以从通用校准的XU值计算抗凝剂 浓度

当使用这些回归曲线以从XU值计算抗凝剂浓度时，对于LMWH样 品(和无抗凝活性的对照样品)得到下列结果：

表11：对于LMWH样品，来自XU值的抗凝剂浓度

当使用回归曲线从XU值计算抗凝剂浓度时，对利伐沙班样品(和无 抗凝剂活性的对照样品)得到下列结果：

表12：对于利伐沙班样品来自XU值的抗凝剂浓度

当使用这些回归曲线从XU值计算抗凝剂浓度时，对达那肝素钠样品 (和无抗凝剂活性的对照样品)得到下列结果：

表12：对于达那肝素钠样品来自XU值的抗凝剂浓度

表13：通过个体校准和通过通用校准测定的对照平均值和CV的比 较：

表13显示从通用校准得到的药物浓度数据与从个体校准得到的数据 非常相似。

高利伐沙班对照的高CV可通过如下事实解释，即对于此数据点外推 XU值，因为XU校准的最高定标物仅为260XU，而高利伐沙班对照为约 400XU。现实生活的情况中，高于最高校准物的值将被表达为(例如)> 260XU，或将允许有限的外推(例如达最高校准值的110％)。

本质上，通用校准使得可以使用单一校准曲线/一组对照/一项水平检 验程序/一项SOP监测针对因子Xa的若干不同抗凝剂，而不是现有技术中 所使用的若干校准曲线，若干组对照，若干SOP。使用通用校准在不同 天数和中心间的一致性与使用个体校准时相当或更好。并且终于可以将 通用校准的结果转化为实际药物浓度。总之，此方法具有显著简化监测因 子Xa抑制剂，降低成本和改善工作流程的可能性，同时降低风险并改善 诊断方法的灵活性。

新的抗凝剂被不断引入临床实践中。本发明的方法的益处之一是针对 Fxa和/或FIIa的新抗凝剂可容易地使用本发明的测定法检测，而无需修 饰试验或校准程序。且另一方面，对于校准程序，可应用抗凝剂或合成或 天然来源的因子IIa和/或因子Xa的其他抑制剂。