用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件

摘要

本发明公开了一种用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件，包括：单细胞捕获器，用于捕获细胞悬浮液中单细胞，其包括：第一导电基底；微流道；三维旋转器，用于对捕获的单细胞进行三维旋转，其包括：第二导电基底；多个竖直电极，以形成电极腔室，从而通电时在电极腔室内产生三维旋转电场；控制器，用于控制微流道内细胞悬浮液流速和方向，并对第一导电基底、多个竖直电极和第二导电基底施加电信号。本发明实施例的微流控器件，不仅能够准确地捕获单细胞，避免细胞样品的浪费，而且能够高效、快速、准确地实现细胞的三维旋转。

说明书

技术领域

本发明涉及单细胞旋转技术领域，特别涉及一种用于单细胞捕获及三维旋转的微流 控器件。

背景技术

目前，在单细胞旋转领域中主要是针对单个细胞进行二维平面的旋转，基本都是基于 平面电极对单细胞进行操作，二维旋转对于细胞的研究具有一定的局限性，首先无法控制 精确的旋转细胞的方位，其次无法全面的了解细胞的整个外貌特性。

然而，对细胞的三维旋转研究目前效果不显著。举例而言，例如一种新型的细胞三维 旋转结构，其设计的单细胞旋转结构能够很好的实现细胞的三维旋转，细胞能够在由电极 围成的腔室内旋转，但是由于细胞尺寸在10微米量级，采用移液枪将细胞放入电极腔室内 的方法比较笨拙，不仅效率很低，并且很难完成单细胞样品的进给，以及对细胞样品的浪 费量很大。因此，如何将单细胞放置进腔体是一件亟待解决的事情。

需要说明的是，由于细胞必须存在于细胞悬浮液中，因此单细胞捕获的主流方法是采 用流体力学的原理，设计具有特殊结构的微流控芯片来实现捕获。而相关技术中的单细胞 捕获方法在实现捕获时，具有以下缺点：1)不能准确控制细胞的捕获位置；2)所需要的 细胞悬浮液中细胞的样本要足够大，造成细胞样本的极大浪费；3)流道的几何形状设计的 非常复杂，增加了对流道的制备要求和成本；4)流道设计的很长，导致微流控芯片上每一 个有效捕获单位所占空间大，造成极大浪费。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的目的在于提出一种用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件，该微流 控器件不但可以准确地捕获单细胞，并且能够实现细胞的三维旋转。

为达到上述目的，本发明实施例提出了一种用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件， 包括：单细胞捕获器，用于捕获细胞悬浮液中单细胞，其中，所述单细胞捕获器包括：第 一导电基底；微流道，所述微流道与所述第一导电基底通过不可逆方式进行贴合；三维旋 转器，所述三维旋转器与所述单细胞捕获器通过可逆方式进行贴合，用于对捕获的单细胞 进行三维旋转，其中，所述三维旋转器包括：第二导电基底；多个竖直电极，所述多个竖 直电极嵌入在所述微流道中，所述多个竖直电极形成电极腔室，与信号发生装置相连，被 施加信号时在所述电极腔室内产生三维旋转电场，以对所述捕获的单细胞进行三维旋转； 以及控制器，所述控制器分别与所述第一导电基底、所述微流道、所述第二导电基底和所 述多个竖直电极相连，用于控制所述微流道内细胞悬浮液流速，并对所述第一导电基底、 所述多个竖直电极和所述第二导电基底施加电信号。

根据本发明实施例提出的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件，通过单细胞捕获 器捕获细胞悬浮液中单细胞，并且通过三维旋转器对捕获的单细胞进行三维旋转。通过控 制微流道内细胞悬浮液流速，并对多个竖直电极和第一、第二导电基底施加电信号实现单 细胞捕获及三维旋转，不但解决了单细胞放置困难的问题，而且能够精确快速的捕捉细胞， 减少样本需求量，以及实现单细胞三维旋转，并克服细胞旋转时位置容易偏移和下沉的问 题，提高三维旋转的稳定性，节约能源，降低成本。

另外，根据本发明上述实施例的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件还可以具有 如下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述电极腔室与所述微流道对准贴合，以使所 述电极腔室与所述流道相连通。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述微流道包括：细胞悬浮液进口与出口；主 流道；细胞捕获区，所述细胞捕获区与所述主流道具有预设体积流率比。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述控制器采用注射泵驱动或重力驱动推动所 述微流道内细胞悬浮液。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述控制器通过调整输入电信号实现对三轴中 任一轴的正方向与反方向的旋转。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述控制器对所述多个竖直电极和所述第一导 电基底施加初相位相反的交流电信号或交替施加直流电信号，并保持所述第二导电基底浮 置，从而在所述主流道内形成竖直向上的介电泳力以抬升所述细胞悬浮液中的单细胞，以 便于细胞能够流至所述细胞捕获区。

进一步地，在本发明的一个实施例中，在实现绕z轴的旋转时，则对所述多个竖直电 极同时施加同频率不同初相位的交流电信号或交替施加直流电信号，保持所述第一导电基 底和所述第二导电基底浮置，在腔内产生绕z轴的旋转电场，每个竖直电极的初相位依次 增加或减少，则在腔内会产生旋转电场；在实现绕y轴的旋转时，则对以y-z平面对称的 竖直电极、所述第一导电基底和所述第二导电基底施加同频率初相位不同的交流电信号或 交替施加直流电信号，保持其它竖直电极浮置，在腔内产生绕y轴的旋转电场，或者对y-z 平面对称的竖直电极和所述第二导电基底施加同频率初相位不同的交流电信号或交替施加 直流电信号，保持所述第一导电基底和其余竖直电极浮置；以及在实现绕x轴的旋转时， 则对以x-z平面对称的竖直电极、所述第一导电基底和所述第二导电基底施加初相位不同 的交流电信号或交替施加直流电信号，保持其它竖直电极浮置，在腔内产生绕x轴的旋转 电场，或者对x-z平面对称的竖直电极和所述第二导电基底施加初相位不同的交流电信号 或交替施加直流电信号，保持所述第一导电基底和其余竖直电极浮置。

进一步地，在本发明的一个实施例中，上述微流控器件还包括：支撑基底，用于支撑 所述第二导电基底与所述多个竖直电极。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述多个竖直电极高于所述第二导电基底的上 边面预设长度。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述三维旋转器还包括：绝缘层，所述绝缘层 设置于所述第二导电基底与所述多个竖直电极之间。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显 和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件的结构示意图；

图2为根据本发明一个实施例的单细胞捕获器的结构示意图；

图3为根据本发明一个实施例的捕获细胞的微流道的结构示意图；

图4为根据本发明一个实施例的三维旋转器的结构示意图；

图5为根据本发明一个实施例的电极腔室的结构示意图；

图6为根据本发明一个实施例的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件的结构示意 图；

图7为根据本发明一个实施例的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件的工作示意 图；

图8为根据本发明一个实施例的细胞捕捉时流道侧面的流速和流线分布示意图；

图9为根据本发明一个实施例的细胞释放时流道侧面的流速和流线分布示意图；

图10为根据本发明一个实施例的利用介电泳力抬升细胞的电场分布示意图；

图11为根据本发明一个实施例的利用竖直电极实现细胞绕z轴旋转时的电场分布俯视 示意图；

图12为根据本发明一个实施例的利用两个竖直电极和底部电极实现细胞绕x/y轴旋转 侧视示意图；

图13为根据本发明一个实施例的利用两个竖直电极和顶部电极，底部电极实现细胞绕 x/y轴旋转侧视示意图；

图14为根据本发明一个实施例的利用竖直电极约束细胞位置时电极腔室的电场分布 图俯视示意图；

图15为根据本发明一个实施例的利用竖直电极约束细胞位置时电极腔室的电场分布 三维示意图；

图16为根据本发明一个实施例的悬浮细胞对应的电极腔室电场分布侧示意图；

图17为根据本发明一个实施例的实验流程图；以及

图18为根据本发明一个实施例的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件的工作流 程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或 者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者 隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上， 除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术 语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是 机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两 个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在 本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以 包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之 间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在 第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二 特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特 征水平高度小于第二特征。

下面参照附图描述根据本发明实施例提出的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控 器件。参照图1所示，该微流控器件10包括：单细胞捕获器20、三维旋转器30和控 制器40。单细胞捕获器20包括第一导电基底21和微流道22。三维旋转器30包括第 二导电基底31和多个竖直电极32。

其中，单细胞捕获器20用于捕获细胞悬浮液中单细胞。微流道22与第一导电基 底21通过不可逆方式进行贴合。三维旋转器30与单细胞捕获器20通过可逆方式进行 贴合，用于对捕获的单细胞进行三维旋转。多个竖直电极32嵌入在微流道22中，多 个竖直电极32与信号发生装置相连，以形成电极腔室，从而接通并施加电信号时在电 极腔室内产生三维旋转电场，以对捕获的单细胞进行三维旋转。控制器40分别与第一 导电基底21、微流道22、第二导电基底31和多个竖直电极32相连，控制器40用于 控制微流道22内细胞悬浮液流速和方向，并对第一导电基底21、多个竖直电极32和 第二导电基底31施加电信号。

在本发明的实施例中，本发明实施例的微流控器件10为一种基于流体力学和介电 泳学的集单细胞高效捕获和三维旋转功能为一体的器件，其能够实现高效精确捕捉单 细胞，并能准确将细胞转移至电极腔室，实现简便快捷的实验单细胞样品的进给，为 单细胞三维旋转提供便利，同时设计的新型芯片能够实现细胞的三维旋转，为研究单 细胞电学特性和三维成像等提供了更全面有效的手段。

进一步地，在本发明的一个实施例中，参照图1所示，电极腔室与微流道22对准 贴合，以使电极腔室与流道相连通。

具体地，本发明实施例的微流控器件10包括上下两个部分组成，上层器件为单细 胞捕获器件20，如图2所示，具体流道尺寸设计如图3所示，下层为单细胞的三维旋 转器件30，如图4所示，图5为电极所围成的电极腔室示意图。其中，上层的单细胞 捕获器件20与下层的三维旋转器件30通过可逆的方式进行贴合，以便后续进行拆洗 重复利用，其中上层的流道的捕获区域需要与下层的旋转腔体进行对准贴合，保证流 道与旋转腔体相连通，以便将捕获住的细胞由上层流道转移到下层电极围成的电极腔 室中。集成的芯片结构图如图6所示。

应理解，细胞的尺度范围在微米级别，但类型不限于细胞，可包括微米珠 (microbeads)、细胞、细胞内亚结构(cellorganelles)、DNA、蛋白质、微小动物如 秀丽隐杆线虫等。另外，器件使用时可以完全浸没在溶液中使用。

进一步地，在本发明的一个实施例中，微流道22包括：细胞悬浮液进口与出口、 主流道和细胞捕获区。其中，细胞捕获区与主流道具有预设体积流率比。

具体地，参照图2所示，单细胞捕获器20由透明的导电基底和微流道组成，导电 基底100和微流道200以不可逆的方式贴合在一起，微流道200包括细胞悬浮液进出 口201，202、主流道203、细胞捕获区204。其中，流道的尺寸可以根据细胞的尺寸进 行调整，不局限于本发明中的尺寸。流道的主流道203和捕获区204有一个体积流率 比，该值决定于流道的几何结构和尺寸。对于给定的几何结构，以体积流率比为目标 函数，对流道的尺寸来说，合适的选择应使体积流率比可以在1-4之间。

进一步地，在本发明的一个实施例中，三维旋转器30还包括：绝缘层(图中未具 体标示)。绝缘层设置于第二导电基底31与多个竖直电极32之间。

具体地，参照图4所示，下层的三维旋转器件30由透明的导电基底，绝缘层和嵌 入在微流道中的4个竖直电极(401-404)组成。由竖直电极围成一个电极腔室，细胞 600将在这个电极腔室内进行旋转。绝缘层300的作用是为了防止导电基底和竖直电极 之间发生短路。

应理解，每一个电极指的是一整块导电物质，如果多块导电物质通过导电介质或 半导体相互连接在一起则也指一个电极。每一个电极的形状可以是规则或不规则的任 意几何形状。在每一个方向上的有效尺寸在1μm-10cm。电极与外接电源相连，在空腔 内形成旋转电场。其中，上层流道的透明导电基底作为电极腔室的顶部电极。

进一步地，在本发明的一个实施例中，上述微流控器件10还包括：支撑基底(图 中未具体标示)。支撑基底用于支撑第二导电基底31与多个竖直电极32。

进一步地，在本发明的一个实施例中，参照图1所示，多个竖直电极32高于第二 导电基底31的上边面预设长度。也就是说，竖直电极必须高于底部电极的上表面预设 长度如1μm以上。

具体地，竖直电极和底部电极位于同一块绝缘支撑基底上。支撑基底可以是透明 材料，也可以是非透明材料。竖直电极指包含有一定高度(1μm以上)的电极，其外 轮廓并非一定需要竖直于水平面，形状可以是规则或不规则的任意几何形状。竖直电 极的个数最少是两个，可以是三个、四个、一直到一百个。底部电极的形状可以是规 则或不规则的任意几何形状，厚度从纳米级别到厘米级别。电极材料可以是任意的导 电物质。底部电极可以是透明材料，也可以是非透明材料。

进一步地，在本发明的一个实施例中，控制器40采用注射泵驱动或重力驱动等推 动微流道内细胞悬浮液。也就是说，对流速的控制可以采用注射泵，重力等驱动方式 来推动流体流动，改变流体流向可以采用改变注射泵运动方向，调整重力的相对高度 等方法来实现。

在本发明的实施例中，本发明实施例可以利用对流道内的流速和方向控制完成细 胞的捕捉和释放，对竖直电极和底部电极施加电信号产生旋转电场，进而对在所述器 件空腔内的细胞产生三维旋转。该方法属于非接触式旋转，且无需给细胞连接任何外 来物质，也属于非侵入式旋转。

进一步地，在本发明的一个实施例中，控制器40通过调整输入电信号实现对三轴 中任一轴的正方向与反方向的旋转。本发明实施例对电极施加的电信号可以是交流电 信号，也可以是直流电信号，但是必须在电极腔室内的空间产生三维旋转电场。

具体地，本发明实施例对不同轴的旋转需要对不同的电极组合施加电信号，而保 持某些电极浮置，并且通过调整输入电信号实现对三轴中任一轴的正、反两方向的旋 转。

进一步地，在本发明的一个实施例中，参照图1所示，控制器40对多个竖直电极 32和第一导电基底21施加初相位相反的交流电信号或交替施加直流电信号，并保持第 二导电基底31浮置，从而在主流道内形成竖直向上的介电泳力以抬升细胞悬浮液中单 细胞，以利于其流至细胞捕获区。

在实现细胞在流道中的抬升时，对竖直电极和顶部电极分别施加初相位相反的交 流电信号或交替施加直流电信号，保持底部电极浮置，在流道内会形成竖直向上的介 电泳力，在介电泳力的作用下细胞会被抬升，随着流体流动顺利到达捕获区。交流电 压的振幅100V以下，角频率最高达到10¹⁰rad/s。

进一步地，在本发明的一个实施例中，参照图1所示，在实现绕z轴的旋转时， 则对多个竖直电极32同时施加交流电信号或交替施加直流电信号，保持第一导电基底 21和第二导电基底31浮置，在腔内产生绕z轴的旋转电场，每个竖直电极的初相位依 次增加或减少；在实现绕y轴的旋转时，则对以y-z平面对称的竖直电极、第一导电基 底21和第二导电基底31施加初相位不同的交流电信号或交替施加直流电信号，保持 其它竖直电极浮置，在腔内产生绕y轴的旋转电场，或者对y-z平面对称的竖直电极和 第二导电基底31施加初相位不同的交流电信号或交替施加直流电信号，保持第一导电 基底21和其余竖直电极浮置；以及在实现绕x轴的旋转时，则对以x-z平面对称的竖 直电极、第一导电基底21和第二导电基底31施加初相位不同的交流电信号或交替施 加直流电信号，保持其它竖直电极浮置，在腔内产生绕x轴的旋转电场，或者对x-z 平面对称的竖直电极和第二导31电基底施加初相位不同的交流电信号或交替施加直流 电信号，保持第一导电基底21和其余竖直电极浮置。

在实现细胞的x-y平面中心位置约束时，对竖直电极施加初相位不同的交流电信号 或交替施加直流电信号，保持顶部电极和底部电极浮置，在电极腔室x-y平面中心位置 会形成介电泳力的平衡点，细胞因此被束缚在腔体中心位置。

在实现悬浮细胞时，对以竖直电极和底部电极施加初相位相反的交流电信号或交 替施加直流电信号，保持顶部电极浮置，所引起的场强变化会在腔内产生方向竖直向 上的介电泳力。当细胞所受介电泳力和细胞所受浮力之和等于细胞重力时，细胞将会 悬浮在溶液中。细胞的悬浮高度可以通过改变信号的幅值和频率来进行调节。

最后，在施加电信号时旋转细胞，停止施加电信号后细胞可停止旋转。

在本发明的实施例中，通过非接触方式来旋转细胞，避免了对细胞造成机械损伤， 对结构精巧易变形的生物细胞三维旋转具有特别的优势。使用中，无需对细胞添加任 何附着物(如表面或内部连接磁珠)，既节省了成本，也控制了原材料消耗和对环境 的影响。器件结构简单，加工容易，使用方便，易于与现有的x-y-z位移台集成使用， 构成完整的x-y-z位移和角度控制系统，成为一种通用性更强的基本的细胞操作工具。

为了使本领域的技术人员更容易理解，下面结合附图对本发明实施例的微流控器 件10进行详细介绍。首先对附图进行介绍：

图2为本发明器件的上层微流道部分示意图，基于“最小流阻原理”设计，流道层 200以不可逆的方式与导电基底100贴合在一起。细胞悬浮液通过注射泵从单细胞捕获 芯片的入口201泵入，经过芯片内特殊设计的流道(包括主流道203，细胞捕获区204) 进行单细胞捕获，多余的细胞和培养液从出口202流回到装有细胞悬浮液的装置，从 而节省细胞悬浮液。

图3为说明本发明利用“最小流阻原理”进行单细胞捕获的机理。当流体有捕获区 204和主流道203可选时，如果捕获区的体积流率Q₁与主流道的体积流率Q₂的比值 Q₁/Q₂大于1，则流体将优先通过捕获区，当细胞随细胞悬浮液流过收口时，细胞会被 流体动力卡在收口处，从而实现捕获。一旦捕获区中有细胞被卡在收口处，该通道因 被阻塞住其流阻会急剧变大，大大超过主流道的流阻，因此细胞悬浮液将选择从主流 道通过，从而绕过这个已经捕获了细胞的收口，从流道出口流出被回收利用。

图4为本发明器件的下层细胞三维旋转器件，由四个竖直电极401～404，底部导电 基底300和顶部电极100围成一个电极腔室405。底部导电基底需要镀上一层绝缘层 500防止与竖直电极发生短路，同时也要保证四个竖直电极之间相互独立。竖直电极， 绝缘层和底部导电基底贴合在一起。

图5为本发明中电极围成的电极腔室示意图，细胞600处在电极腔室中心位置， 通过对竖直电极401～404和底部电极300施加电信号，根据介电泳理论，会在电极腔 室内产生变化的电场，从而会产生作用在细胞上的介电泳力和扭矩，引起细胞的运动， 完成对细胞的控制操作。同时上层细胞捕获器件的基底为导电材料，可以作为电极腔 室的顶部电极100。

图6为本发明器件整体示意图，为了方便器件清洗重复利用，上层单细胞捕获器 件同下层单细胞旋转器件推荐以可逆的方式进行贴合。

图7为本发明器件工作示意图。通过注射泵或重力等驱动方式将细胞悬浮液从流 道入口泵入，单细胞由流道捕获区所捕获，其余的细胞由主流道从流道出口流出进行 循环利用。各个电极引出后接入至信号发生装置。待细胞捕获后，利用流体的作用力 将细胞移入至电极腔室，再通过信号发生装置施加电信号在电极上，对细胞进行旋转 等操作。

图8为本发明器件中不同流速下流道对应的侧面流线分布图。流道横截面积为 25μm×25μm，在流速为0.01m/s，1m/s，10m/s三种情况下对应的体积流率为：0.375μl/min， 37.5μl/min，0.375ml/min，流速越快，侧面的流线就越水平，当流速大于1m/s时，细 胞便能够顺利通过腔体上方到达捕获区，而不至于落入电极腔室。单细胞顺利捕获住 后，才能引起主流道和捕获区的流阻变化，保证只有一个细胞在捕获区，流道内多余 细胞会从主流道流出。

图9为本发明器件中利用反向的流体力释放捕获的单细胞进入腔室时对应的侧面 流线分布图。在0.01m/s流速下，单细胞会随着流体流动而掉入电极腔室内。通过控制 流体的速度和流动时间能够保证细胞落入电极腔室内。

图10为本发明器件中利用介电泳力抬升细胞，避免细胞到达捕获区的收口前落入 电极腔室。在顶部电极和四个竖直电极上施加相位相反的电信号V₁₀₀＝A*sin(ωt+0)， V_401～404＝A*sin(ωt+π)，在流道内能产生竖直向上的介电泳力，当细胞流经电极腔室上方 时，介电泳力能够将细胞抬升起来，配合图7中流体的方法，能够促进细胞顺利到达 捕获区。

图11为本发明器件中实现细胞绕z轴的旋转。选取竖直电极401～404作为工作电 极，顶部电极100和底部电极300处于浮置状态。分别在四个电极上施加 V₄₀₁＝A*sin(ωt+0)，V₄₀₂＝A*sin(ωt+π/2)，V₄₀₃＝A*sin(ωt+π)，V₄₀₄＝A*sin(ωt+3π/2)。在 电极腔室中电场具有顺时针旋转的变化，细胞在介电泳扭矩的作用下发生顺时针旋转。

图12为本发明器件中利用介电泳力实现细胞的绕向x/y轴旋转。选取底部电极300 同两个相对的竖直电极401，403或者402，404作为工作电极，其余两个竖直电极和 顶部电极处于悬空状态。分别在四个电极上施加V_401/402＝A*sin(ωt+0), V₃₀₀＝A*sin(ωt+π/2),V_403/404＝A*sin(ωt+π)，图10细节图表示电极腔室中心位置的电场具 有顺时针旋转的变化，且电场幅值相对均匀，细胞在介电泳扭矩的作用下发生顺时针 旋转。

图13为本发明器件中实现细胞竖直旋转的另一种电极配置。竖直方向上选取顶部 电极100和底部导电基底300同两个相对的竖直电极401，403或者402，404作为工 作电极，其余两个竖直电极处于浮置状态。分别在四个电极上施加V₁₀₀＝A*sin(ωt+0), V_401/402＝A*sin(ωt+π/2),V₃₀₀＝A*sin(ωt+π),V_403/404＝A*sin(ωt+3π/2)，图10细节图表示电 极腔室中心位置的电场具有顺时针旋转的变化，且电场幅值相对均匀，细胞在介电泳 扭矩的作用下发生顺时针旋转。

图14为本发明器件中利用介电泳力实现细胞的x-y平面中心位置约束。在相邻的 竖直电极上施加相位相反的信号，V₄₀₁＝V₄₀₃＝A*sin(ωt+0)，V₄₀₂＝V₄₀₄＝A*sin(ωt+π)，在 电极腔室的中心位置的电势会形成一个极小值，细胞在介电泳的作用下会被束缚在中 心位置。

图15为本发明器件中利用介电泳力实现细胞的中心位置约束时对应的三维电势图。 在电极腔室的中心位置电场强度为最低，则在中心位置会有个介电泳力的平衡点，所 受合力为零，一旦细胞偏移了中心位置，即偏移了介电泳力场的平衡点，会受到一个 合力不为零，而指向平衡点的力，这个力会将细胞推回到电极腔室中心直到细胞所受 合力为零，平衡为止。

图16为本发明器件中利用介电泳力实现细胞的悬浮。细胞在悬浮液中会受到重力 的影响而发生下沉，一旦细胞下沉与底部电极接触后，由于细胞与电极之间的粘附作 用，细胞将很难再悬浮起来。本发明在底部电极300和四个竖直电极上分别施加相位 相反的信号，V₃₀₀＝A*sin(ωt+0)，V_401～404＝A*sin(ωt+π)。会在电极腔室内产生竖直向上 的介电泳力，当介电泳力和浮力之和等于细胞重力时，细胞受力达到平衡则处于悬浮 状态。在细胞做旋转运动的同时施加悬浮信号，能够让细胞更为持久稳定的旋转。

图17为本发明器件的工作流程框图，分为细胞进给，细胞捕获细胞释放，细胞位 置约束、悬浮和旋转，细胞回收。

图18为本发明器件的工作流程示意图。

其次，结合以上附图对本发明实施例的微流控器件10进行详细介绍：

图2所示为单细胞捕获器件示意图。本发明实施例的器件可以有很多结构不同的 流道，可以用于捕获不同类型和尺寸的细胞。不失一般性，以下叙述中认为流道结构 相同。流道设计成有一个入口和出口，流道的形状为口字形，口字形右下角设计设计 有一个比流道大部分尺寸更窄的收口，这个收口及其附近区域称作细胞捕获区204，用 于捕获住流经的细胞悬浮液中的细胞，流道尺寸不变的其它区域称作主流道203，能够 让细胞悬浮液无障碍通过。

根据流阻原理，要让细胞捕获区204能够被动地捕获住细胞，则必须把细胞捕获 区204的流阻设计得低于主流道203的流阻，而流阻高低可以用另一个更加方便的参 数来描述，就是体积流率，定义为单位时间内流过流道的液体的体积。如图3所示， 当流体有主流道203和捕获区204可选时，如果捕获区的体积流率Q₁与主流道的体积 流率Q₂的比值Q₁/Q₂大于1，则流体将优先通过捕获区204，则细胞随细胞悬浮液流过 收口时，细胞会被流体动力卡在收口处，从而实现捕获。重要的是，一旦捕获区204 中有细胞被卡在收口处，该通道因被阻塞住其流阻会急剧变大，大大超过主流道203 的流阻，因此细胞悬浮液将选择从主流道203通过，从而绕过这个已经捕获了细胞的 收口，多余的细胞悬浮液将从主流道203的出口处流出，被收集起来以作它用。W₂和 H数值的选择由匹配细胞大小的原则来定，其余的四个变量L₁,L₂,L₃和W₁则需要选择 合适的值使得Q₁/Q₂大于1。假设待捕获的细胞大小为15-20微米，W₂＝H＝25稍微大 于细胞直径以防止细胞悬浮液阻塞，选择一组值为：L₁＝90μm,L₂＝6μm,L₃＝90μm, W₁＝10μm。

因此，要让单细胞捕获器件能够成功运行，必须保证Q₁/Q₂的值至少大于1，涉及 到如何设计及优化该芯片中流道的几何形状和尺寸。图3中标出了6个关键的参数， 其中主流道的宽度和深度取决于所要捕获的细胞尺寸，在设计中可以作为一个常数来 处理，其余的参数则可以以Q₁/Q₂为目标函数进行优化。具体的优化方法在专利申请 CN104388301A中已经具体介绍过，在此不再赘述。

单细胞捕获是整个实验的前提，上下两部分器件贴合在一起后，上层流道的捕获 区204与下层电极腔室405相联通，当细胞经流道流经电极腔室405上方时，可能会 落入电极腔室内，如果单细胞落入电极腔室而没有到达捕获区的收口，后续的细胞会 继续进入电极腔室，造成拥堵，影响实验的进行。为了避免细胞直接落入电极腔室， 需要对细胞悬浮液的速率进行控制。图8为不同流速下流道侧面的流线分布图。选取 了0.01m/s,1m/s,10m/s三个速率进行分析，流道截面为25um×25um，对应的体积流率 为0.375μl/min，37.5μl/min，0.375ml/min。当流速越大，在流道内的流线就越水平，相 应地，细胞就会随着流体越容易到达捕获区的收口处。具体的流速需要根据不同结构 尺寸进行分析，不局限于以上的速率分析实例。为了更好的实现单细胞捕获，可以同 时借助介电泳力的作用来抬升细胞，具体方法会在后面进行阐述。

待单细胞捕获后需要将单细胞转移到电极腔室内，由单细胞捕获实例中可知，在 竖直面上，流速越慢流线就越弯曲，细胞就越容易进入电极腔室内。利用反向的低流 速流体(202为溶液入口，201为溶液出口)将细胞推入电极腔室内。图9为流速为0.01m/s 时的流线分布图，细胞会随着流体落入电极腔室。待细胞落入电极腔室后，停止泵入 溶液，使细胞处于电极腔室中。释放细胞的流速不局限于0.01m/s，不同结构尺寸的流 道对应不同的速率。

本发明实施例在空间上布置至少2个竖直电极和1个顶部电极1个底部电极。各 电极必需通过适当的方式实现相互绝缘，以便施加独立的互不影响的电信号。必需对 电极组合施加合适的电信号(包括电压的幅度、角频率和初相位)，以在腔体中产生 旋转电场，该电场进而旋转在腔内的细胞。此外，电极的几何形状和尺寸决定了腔内 瞬时电场强度在空间上的分布。为减小旋转中需要的电压幅度，电极的几何形状和尺 寸可以通过建模仿真进行优化。为获得更加精确的旋转角度，电极的数目也可以加以 调整，通过建模仿真进行优化。为能控制旋转的速度，可以通过调整施加的电压幅度、 角频率和初相位来实现。本发明使用透明电极作为底部电极，可以允许使用者在显微 镜下通过透射光观察细胞来实现细胞成像和操作。如果用户对底部电极的透明性没有 要求，也可以使用非透明电极。

在电极上施加直流电信号或者连续施加交流电信号V_i＝Asin(ωt+Φ_i)(i＝1，2，3， 4，对应于相邻电极的编号)。为了解释上的方便，本发明实施例所批露的最简单直接 的方式是对所有电极连续施加交流电信号，且交流电压振幅(A)和角频率(ω)相同； 但是实际上具体实施中每个电极上的电压振幅和角频率也是可以有所差别的。A的具 体数值可根据旋转的目标速度来确定，取决于腔的大小、细胞的物理特性、细胞周围 的介质等等诸多因素，一般可以在100V以下。角频率的范围很广，可以达到10¹⁰rad/s。

为了能让单细胞更顺利的流过腔体上方到达捕获区的收口处，除了上述的流速控 制的方法，也可以通过介电泳的方法来抬升细胞。在竖直电极上和顶部电极100上施 加相位差为π的信号，V₁₀₀＝A*sin(ωt+0)，V_401～404＝A*sin(ωt+π)。在流道中会有竖直向 上的介电泳力，当细胞流经腔体上方时，会因介电泳力的作用而被抬升起来，随着流 体的流动细胞会流向捕获区收口处。

为实现对细胞的绕x轴或y轴旋转，此器件至少需要2个竖直电极和1个底部电 极，同时也可以采用2个竖直电极和1个顶部电极和1个底部电极的形式来实现绕x 轴或y轴旋转。竖直电极的个数、形状可以随意，尺寸和材料也可以按需调整。为方 便理解此发明，下面以图5所示4个竖直电极和1个顶部电极，1个底部电极为例，来 说明具体实施方式。

为实现绕z轴的某一方向上的旋转，四个电极401、402、403、404可交替施加直 流电信号或者连续施加交流电信号V_i＝Asin(ωt+Φ_i)(i＝1，2，3，4，对应于相邻电极 的编号)。为了解释上的方便，本发明实施例所批露的最简单直接的方式是对所有电 极连续施加交流电信号，且交流电压振幅(A)和角频率(ω)相同；但是实际上具体 实施中每个电极上的电压振幅和角频率也是可以有所差别的。A的具体数值可根据旋 转的目标速度来确定，取决于腔的大小、细胞的物理特性、细胞周围的介质等等诸多 因素，一般可以在100V以下。角频率的范围很广，可以达到10¹⁰rad/s。初相位可以简 单地取为Φ_i＝(i-1)π/2，也就是每两个相邻电极的初相位差别为π/2；这个值在具体 实施中也是可以调整的。在实现绕z轴的旋转时，底部电极300保持浮置。图4所示 为四个电极施加交流电信号时，在一个电压周期内，在四个电极内形成的腔内的中心 点处可以明显观察到绕z轴旋转的电场，此电场会带动场内的细胞旋转。

对同一细胞绕z轴的另一方向上的旋转可以简单地仅仅通过交换电极202和电极 204的初相位来实现，也就是交换电极202和电极204的交流信号源。

为实现细胞绕x轴的某一方向上的旋转，竖直电极401、403和底部电极300要施 加电信号，底部电极接地或者接到一个直流源上，竖直电极402、404此时浮置。分别 在三个电极上施加V₄₀₁＝A*sin(ωt+0),V₃₀₀＝A*sin(ωt+π/2),V₄₀₄＝A*sin(ωt+π)。施加的相 位差不局限于上述配置，三个电极上依次存在递增或递减的相位差，均能在电极腔室 的中心位置产生一个旋转的电场。图11所示为电极腔室的侧面的电场分布图。图11 细节图表示电极腔室中心位置的电场具有顺时针旋转的变化，电场幅值因为电极分布 不对称，在一个周期内的各个时刻幅值有所不同。细胞在旋转电场作用下会作顺时针 旋转。对同一细胞绕y轴的另一方向上的旋转可以简单地仅仅交换电极401和电极403 的初相位来实现，即交换电极401和电极403的交流信号源。

同理，为实现细胞绕y轴的某一方向上的旋转，竖直电极402、404和底部电极200 要施加电信号，底部电极接地或者接到一个直流源上，竖直电极401、403此时浮置。 竖直电极402和404和底部电极上的交流电信号可分别为V₄₀₁＝A*sin(ωt+0), V₃₀₀＝A*sin(ωt+π/2),V₄₀₂＝A*sin(ωt+π)。这三个电极施加交流电场的初相位也可以是别 的值，并非局限于这里的0，π/2和π。对同一细胞绕x轴的另一方向上的旋转可以简 单地仅仅交换电极402和电极404的初相位来实现，即交换电极402和电极404的交 流电信号源。

上述实现细胞绕x轴或y轴是利用两个竖直电极和底部电极来实现，同样可以利 用顶部电极配合两个竖直电极401，403或402，404和底部电极300来实现细胞绕x 轴或y轴旋转。分别在四个电极上施加V₁₀₀＝A*sin(ωt+0),V_401/402＝A*sin(ωt+π/2), V₃₀₀＝A*sin(ωt+π),V_403/404＝A*sin(ωt+3π/2)。图12所示为电极腔室的侧面的电场分布图。 图12细节图表示电极腔室中心位置的电场具有顺时针旋转的变化，因电极在竖直方向 上分布对称，故电场幅值在各个时刻相对一致，细胞在旋转电场的作用下发生顺时针 旋转。电极上施加的相位差不局限于上述配置，四个电极上依次存在递增或递减的相 位差，均能在电极腔室中心位置的产生一个旋转的电场。对同一细胞绕x轴或y轴的 另一方向上的旋转可以简单地仅仅交换两个竖直电极上的初相位来实现，即交换两个 竖直电极的交流电信号源。

为实现细胞在电极腔室的x-y平面中心位置约束。在相邻的竖直电极上施加相位差 为π的信号。如V₄₀₁＝V₄₀₃＝Asin(ωt)和V₄₀₂＝V₄₀₄＝Asin(ωt+π/2)。图14为电极腔室的电 场分布俯视图。图15为电极腔室内电场强度的三维图。在电极腔室x-y平面中心位置 会形成一个电场强度的极小值，在平面中心位置会形成介电泳力的平衡点，细胞因此 被束缚在腔体中心位置。本方法能够确保细胞处于中心位置，从而保证细胞在做旋转 运动时位置不会发生偏移。

为实现细胞能够在电极腔室内克服重力影响，保持悬浮状态。在竖直电极和底部 电极上施加相位差为π的信号。V₃₀₀＝A*sin(ωt+0)，V_401～404＝A*sin(ωt+π)。会在电极腔 室内产生竖直向上的介电泳力，当介电泳力和浮力之和等于细胞重力时，细胞便会达 到平衡，处于悬浮状态。在细胞做旋转运动的同时施加电信号使其悬浮，能够让细胞 更为持久稳定的运动。

在本发明的实施例中，导电基底100可以采用在透明材质的表面镀一层导电介质， 如可以用氧化铟锡(ITO)导电玻璃，在导电基底100上钻孔201，202作为溶液的进 出口，利用光刻加工的方法在基底上形成微流道结构203，204，如可选用光刻负胶 (SU8)，并且导电基底300可以采用在透明材质的表面镀一层导电介质，如可以用氧 化铟锡(ITO)导电玻璃，在导电基底300上镀上一层绝缘层500，防止底部电极与竖 直电极之间发生短路，利用光刻加工的方法在基底上形成微流道结构，如可选用光刻 负胶(SU8)，将导电银胶混合碳纳米粉注入到微流道结构中，并固化形成电极401～404， 同时要保证电极能够围成一个电极腔室405。

需要注意的是，待上层和下层器件制作完成后，将两个器件对准贴合，需要保证 上层流道的捕获区204同下层的电极腔室405相联通，贴合方式选为可逆贴合，以便 后续拆洗重复利用，并且对四个竖直电极401～404和顶部100与底部电极300，加上引 脚，以便对电极施加外部电信号。在使用器件时，可以把此器件完全或部分浸没于溶 液中，或者置于空气中。在溶液环境中操作细胞时，待细胞落入电极腔室后，对电极 按具体实施方式中前半部分所述方法施加外部电信号，即可实现对细胞的三维旋转， 悬浮，位置约束等操作，以及竖直电极401、402、403、404的个数、形状、尺寸、材 料和制作是可以按需调整、灵活使用的，整个器件的结构和制作也可以有多个变体。 拥有个数更多的电极，可以实现更准确的角度控制。对电极施加交替直流电场，可以 替代连续交流电场。此外，电极100、300、401、402、403、404的形状并不仅限于前 述形状，可以是任何规则或不规则形状。本发明限定电极在每一个方向上的有效尺寸 在1μm-10cm。

本发明实施例不仅能够准确地捕获单细胞而且避免了细胞样品的浪费，而且能够 高效、快速、准确地实现细胞的三维旋转，解决如下问题：

1)单细胞进给困难：常规的方法使用移液枪来进行细胞放置，但细胞直径大概是 10微米量级，移液器最小滴量也在0.1μl,是细胞体积的上千倍，单细胞几乎不可能顺 利的进入旋转电极腔室结构中，由于单细胞的进给困难给实验带来了很多的不便，降 低了实验的效率和质量。

2)样本量需求大：常规的方法因为不能有效的捕获单细胞，故所需要的细胞的样 本量要足够大，不仅造成细胞样本的极大浪费，而且捕获效率上也无法保证。尤其针 对一些稀少珍贵的细胞，大的样本需求量带来的成本相当高。

3)细胞三维旋转及稳定性：现常用的细胞旋转方法都是基于平面电极，这种结构 的旋转仅限于二维旋转，无法实现对细胞的三维旋转，也就完成不了细胞的全方位旋 转，同时也限制了对细胞的研究。在最近我们提出过一种新型的细胞三维旋转专利中， 细胞在旋转过程中，由于重力的影响会发生下沉，当细胞下沉到与底部电极相接触后， 会与电极粘滞在一起，同时细胞容易偏离水平面的中心位置，在竖直旋转过程中会发 生左右偏移，旋转的稳定性有待提升。

根据本发明实施例提出的用于单细胞捕获及三维旋转的微流控器件，通过单细胞 捕获器捕获细胞悬浮液中单细胞，并且通过三维旋转器对捕获的单细胞进行三维旋转。 通过控制微流道内细胞悬浮液流速，并对多个竖直电极和第一、第二导电基底施加电 信号实现单细胞捕获及三维旋转，不但解决了单细胞放置困难的问题，而且能够精确 快速的捕捉细胞，减少样本需求量，以及实现单细胞三维旋转，并克服细胞旋转时位 置容易偏移和下沉的问题，提高三维旋转的稳定性，节约能源，降低成本。

流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括 一个或更多个用于实现特定逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段 或部分，并且本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或 讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能， 这应被本发明的实施例所属技术领域的技术人员所理解。

在流程图中表示或在此以其他方式描述的逻辑和/或步骤，例如，可以被认为是用于实 现逻辑功能的可执行指令的定序列表，可以具体实现在任何计算机可读介质中，以供指令 执行系统、装置或设备(如基于计算机的系统、包括处理器的系统或其他可以从指令执行 系统、装置或设备取指令并执行指令的系统)使用，或结合这些指令执行系统、装置或设 备而使用。就本说明书而言，"计算机可读介质"可以是任何可以包含、存储、通信、传播 或传输程序以供指令执行系统、装置或设备或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用 的装置。计算机可读介质的更具体的示例(非穷尽性列表)包括以下：具有一个或多个布 线的电连接部(电子装置)，便携式计算机盘盒(磁装置)，随机存取存储器(RAM)，只 读存储器(ROM)，可擦除可编辑只读存储器(EPROM或闪速存储器)，光纤装置，以及 便携式光盘只读存储器(CDROM)。另外，计算机可读介质甚至可以是可在其上打印所述 程序的纸或其他合适的介质，因为可以例如通过对纸或其他介质进行光学扫描，接着进行 编辑、解译或必要时以其他合适方式进行处理来以电子方式获得所述程序，然后将其存储 在计算机存储器中。

应当理解，本发明的各部分可以用硬件、软件、固件或它们的组合来实现。在上述实 施方式中，多个步骤或方法可以用存储在存储器中且由合适的指令执行系统执行的软件或 固件来实现。例如，如果用硬件来实现，和在另一实施方式中一样，可用本领域公知的下 列技术中的任一项或他们的组合来实现：具有用于对数据信号实现逻辑功能的逻辑门电路 的离散逻辑电路，具有合适的组合逻辑门电路的专用集成电路，可编程门阵列(PGA)，现 场可编程门阵列(FPGA)等。

本技术领域的普通技术人员可以理解实现上述实施例方法携带的全部或部分步骤是可 以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中， 该程序在执行时，包括方法实施例的步骤之一或其组合。

此外，在本发明各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理模块中，也可以是各 个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个模块中。上述集成的模块既 可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能模块的形式实现。所述集成的模块如果以 软件功能模块的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，也可以存储在一个计算机可读 取存储介质中。

上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定 指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。