包含PDGF和VEGF结合部分的融合蛋白及其使用方法

摘要

本发明提供包含PDGF和VEGF结合部分的融合蛋白，和编码所述融合蛋白的重组病毒颗粒。还提供包含所述融合蛋白和病毒颗粒的组合物及其使用方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35§USC119(e)要求于2013年3月13日提交的先前共同待决的美国临时专利申请第61/780,914号的权益，其公开文本在本文以其全文通过提述并入。

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发明领域

本发明涉及抑制PDGF途径和VEGF途径的融合蛋白、这些融合蛋白的组合物及其产生和使用方法。

发明背景

由生长因子(例如血管内皮生长因子(VEGF))的过量产生引起的新血管形成是如肿瘤生长、年龄相关性黄斑变性(AMD)和增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)等疾病的关键要素(Connolly等,JClinInvest.,1989,84(5):1470-8；Ferrara等,BiochemBiophysResCommun.,1989,161(2):851-9；andFerrara等,NatMed.,1998,4(3):336-40)。湿型AMD是特征为视网膜下方异常新生血管形成且经常导致永久性视力损失的最严重形式的AMD疾病。用抗体、可溶性VEGF受体阻断VEGF或抑制VEGF受体酪氨酸激酶活性是已在阻抑视网膜新生血管形成中显示有前途的临床前和临床结果的策略(Aiello等,PNAS,1995,92:10457-10461和Willet,等,NatMed.,2004,10:145-147)。然而，最近临床数据显示仅在VEGF抑制情况下，新血管组织通常不会退化，这是因为与内皮细胞相互作用且促使确立血液-视网膜屏障的外周细胞为新生血管内皮细胞提供存活信号且因此使得其对VEGF戒断具有抗性(Benjamin等,Development,1998,125(9)1591-8andPatelS.,Retina,2009,29(6Suppl):S45-8)。此外，增殖性视网膜中发现的血小板衍生的生长因子同型异构体B(PDGF-B)和PDGF受体-β(PDGFRβ)在外周细胞的招募对用于稳定发育中的脉管系统具有重要作用(Robbins等,InvestOpthVisSci.,1994,35(10):3649-63；Lindahl等,Development,1997,124:3943-3953；and等,Development,1999,126:3047-3055)。

VEGFR1(Flt-1)的VEGF结合功能已定位至第二细胞外结构域(ECD)(Davis-Smyth等,EMBOJ.,1996,15:4919-4927；Barleon等,JBiolChem.,1997,272:10382-10388；Wiesmann等,Cell,1997,91:695-704；和Davis-Smyth等,JBiolChem.,1998,273:3216-3222)。高亲和力VEGF-结合受体的天然选择性剪接形式，即可溶性VEGFR1(sFlt1)以主要起诱饵受体作用的分泌蛋白形式存在(Shibuya等,Oncogene,1990,5:519-524和Kendall等,PNAS,1993,90:10705-10709)。工程化的用于治疗用途的可溶性受体VEGF-Trap具有融合至VEGFR2(KDR)的第三结构域且融合至人IgG1Fc区的VEGFR1的第二结构域(Holash等2002)。先前显示PDGFRβ的细胞外区拮抗PDGF-B刺激的反应(Duan等,JBiolChem,1991,266(1)413-8andUeno等,Science,1991,252(5007):844-8)。利用PDGFRβ-Fc嵌合体的研究证实人PDGFRβECD1至3对于高亲和力PDGF-B配体结合是充分的(Heidaran等,FASEBJ.,1995,9(1):140-5andLokker等,JBiolChem,1997,272(52):33037-44)。在PDGFRβECD1至3融合至谷胱甘肽S-转移酶(GST)结构域时，还描述预二聚化对高亲和力PDGF-B配体结合的影响(等,Biochemistry,2000,39(9):2370-5)。

目前眼治疗需要由视网膜专家每月进行玻璃体内注射，持续数年。因此，需要改进的治疗剂和递送所述治疗剂至位点(例如眼)的方法。

发明概述

本文提供的本发明尤其公开了抑制PDGF途径和VEGF途径的融合蛋白、包含这些融合蛋白的组合物和包含含有编码所述融合蛋白的核酸的病毒颗粒的组合物以及所述融合蛋白和病毒颗粒的产生和使用方法，其用于治疗或预防如眼部疾病、炎性疾病、自体免疫疾病或癌症等疾病。

因此，在一个方面中，本发明提供融合蛋白，其包含：(a)PDGF受体的细胞外部分，(b)VEGF受体的细胞外部分，和(c)多聚化结构域，其中所述融合蛋白结合至PDGF和VEGF。在一些实施方案中，融合蛋白以如下次序自N末端至C末端排列：(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，PDGF受体是PDGFRβ。在本文的一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR的Ig样结构域D1-D3。在本文的一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR的Ig样结构域D1-D4。在本文的一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR的Ig样结构域D1-D5。在本文的一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含氨基酸序列SEQIDNO:1、2或3或与SEQIDNO:1、2或3具有至少85％同一性的氨基酸序列。在本文的一些实施方案中，VEGF受体的细胞外部分包含VEGF受体的Ig样结构域D2。在本文的一些实施方案中，VEGF受体的细胞外部分包含VEGFR1(FLT-1)的Ig样结构域D2。在本文的一些实施方案中，VEGF受体的细胞外部分包含VEGFR1(FLT-1)的Ig样结构域D2和VEGFR2的Ig样结构域D3。在本文的一些实施方案中，VEGF受体的细胞外部分包含VEGFR1(FLT-1)的Ig样结构域D1-D3。在本文的一些实施方案中，VEGF受体的细胞外部分包含氨基酸序列SEQIDNO:4或5或与SEQIDNO:4或5具有至少85％同一性的氨基酸序列。在本文的一些实施方案中，融合蛋白进一步包含PDGF受体的细胞外部分与VEGF受体的细胞外部分间的接头肽和/或VEGF受体的细胞外部分与多聚化结构域间的肽接头。在又一实施方案中，肽接头包含选自下组的氨基酸序列：Gly₉(SEQIDNO:47)、Glu₉(SEQIDNO:48)、Ser₉(SEQIDNO:49)、Gly₅-Cys-Pro₂-Cys(SEQIDNO:50)、(Gly₄-Ser)₃(SEQIDNO:51)、Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:52)、Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:53)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQIDNO:54)和Gly₉-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:55)。在本文的一些实施方案中，多聚化结构域是抗体的Fc区。在又一实施方案中，Fc区包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH3区或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和CH3区。在本文的一些实施方案中，Fc区包含氨基酸序列SEQIDNO:6或与SEQIDNO:6具有至少85％同一性的氨基酸序列。在本文的一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:13或15或与SEQIDNO:13或15具有至少85％同一性的氨基酸序列。在本文的一些实施方案中，融合蛋白呈多聚体形式。在本文的一些实施方案中，融合蛋白呈二聚体形式。

在一个方面中，本发明提供融合蛋白，其通过在产生融合蛋白的条件下培养包含编码本文公开的任何融合蛋白的核酸的宿主细胞和回收由宿主细胞产生的融合蛋白来产生。

在另一方面中，本发明提供包含两种融合蛋白的二聚体融合蛋白，其中每一融合蛋白包含本文公开的任何融合蛋白。

在又一方面中，本发明提供包含本文公开的任何融合蛋白和药物上可接受的载剂的组合物。

在再一方面中，本发明提供编码本文公开的任何融合蛋白的核酸。

在一些方面中，本发明还提供包含编码本文公开的任何融合蛋白的核苷酸序列的宿主细胞。

在一些方面中，本发明提供产生融合蛋白的方法，其包括在产生融合蛋白的条件下培养包含编码本文公开的任何融合蛋白的核酸的宿主细胞和回收由宿主细胞产生的融合蛋白。在其他实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。

在另一方面中，本发明提供递送融合蛋白至受试者的方法，其包含向受试者施用有效的量的本文公开的任何融合蛋白。在一些实施方案中，受试者患有黄斑变性或增殖性糖尿病性视网膜病变。在又一实施方案中，黄斑变性是湿型年龄相关性黄斑变性或干型年龄相关性黄斑变性。在本文的一些实施方案中，融合蛋白通过玻璃体内注射施用至受试者。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，受试者患有类风湿性关节炎、骨关节炎或哮喘。在一些实施方案中，受试者患有葡萄膜炎或角膜新生血管形成。

在一些方面中，本发明提供包含编码本文公开的任何融合蛋白的核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在又一实施方案中，病毒载体是重组腺相关病毒载体(rAAV)。在其他实施方案中，rAAV载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10的ITR。

在一个方面中，本发明还提供包含编码本文公开的任何融合蛋白的核酸的rAAV颗粒。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10的衣壳蛋白。在一些实施方案中，核酸包含不同于衣壳的血清型的血清型的ITR。在又一实施方案中，ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10的ITR。

在又一方面中，本发明提供产生rAAV颗粒的方法，其包括(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含(i)一个或多个AAV包装基因，其中每一所述AAV包装基因编码AAV复制或衣壳化蛋白；(ii)包含编码本文公开的任何融合蛋白且旁侧为至少一个AAVITR的核苷酸的rAAV前载体，和(iii)AAV辅助功能；和(b)回收由宿主细胞产生的rAAV颗粒。在又一实施方案中，rAAV颗粒是纯化的。

在再一方面中，本发明提供递送病毒载体至受试者的方法，其包括向受试者施用本文公开的任何rAAV颗粒，其中由rAAV颗粒编码的融合蛋白在受试者中表达。在一些实施方案中，本发明提供递送病毒载体至受试者的方法，其包括向受试者施用本文公开的任何rAAV颗粒，其中有效的量的由rAAV颗粒编码的融合蛋白在受试者中表达。在一些实施方案中，受试者患有黄斑变性或增殖性糖尿病性视网膜病变。在又一实施方案中，黄斑变性是湿型年龄相关性黄斑变性或干型年龄相关性黄斑变性。在本文的一些实施方案中，rAAV颗粒通过玻璃体内注射施用至受试者。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，受试者患有类风湿性关节炎、骨关节炎或哮喘。在一些实施方案中，受试者患有葡萄膜炎或角膜新生血管形成。

认为说明足以使得本领域的技术人员实践本发明。实际上，除那些本文所示和阐述的内容以外，本领域的技术人员根据上述说明将理解本发明的多种修改将落入附加权利要求的保护范围内。出于所有目的，本发明引用的所有出版物、专利和专利申请的全文通过提述并入本文。

附图简述

图1显示经截短PDGFR-β可溶性受体的生成。A)PDGFR-βIgG1Fc偶联二聚化形式PDGFR(D1-D5)9G-Fc、PDGFR(D1-D2)9G-Fc和PDGFR(D1-D3)9G-Fc以及PDGFR-β单体受体形式PDGFR(D1-D4)和PDGFR(D1-D5)的示意图。白色框指示PDGFR-β序列，其包括细胞外结构域和信号肽(sp)。对角线阴影框代表9Gly接头且黑色虚线框代表人IgG1Fc区的结构域CH2和CH3。B)在还原(左图)和非还原(右图)条件下单体PDGFR-β和IgG1Fc偶联二聚化可溶性受体形式的蛋白免疫印迹。利用抗PDGFR-β抗体检测蛋白。

图2显示经截短PDGFR-β可溶性受体的体积PDGFBB结合分析。A)与全尺寸IgG1Fc偶联二聚化形式PDGFR(D1-D5)9G-Fc相比的单体PDGFR-β可溶性受体形式PDGFR(D1-D4)和PDGFR(D1-D5)。B)与IgG1Fc偶联二聚化形式PDGFR(D1-D5)9G-Fc相比的二聚体IgG1Fc偶联sPDGFR-β可溶性受体形式PDGFR(D1-D2)9G-Fc和PDGFR(D1-D3)9G-Fc。将逐渐增加的体积(μl)的含有来自代表性转染的可溶性受体的条件培养基(CM)(x轴)与人PDGFBB配体一起温育过夜且通过ELISA测量未结合配体的量(y轴)。数据表示为平均值±SD(n＝3)；通过2因子ANOVA，所有受体的PDGF结合亲和力显著不同；Bonferroni检验；***P<0.001。

图3是VEGFR1/PDGFR-β和PDGFR-β/VEGFR1杂合蛋白(杂合体1至4)和其亲代构建体PDGFR(D1-D5)9G-Fc、PDGFR(D1-D3)9G-Fc和sFLT01的示意图。白色框指示PDGFR-β序列，灰色框指示VEGFR1(Flt-1)序列，其包括其细胞外结构域和信号肽(sp)。对角线阴影框代表9Gly或9Ser接头且黑色虚线框代表人IgG1Fc区的结构域CH2和CH3。

图4是在还原(左图)和非还原(右图)条件下与全尺寸IgG1Fc偶联二聚化形式PDGFR(D1-D5)9G-Fc(示为(D1-D5)9G-Fc)相比的VEGFR1/PDGFR-β和PDGFR-β/VEGFR1杂合蛋白(杂合体1至4)的蛋白免疫印迹。利用抗PDGFR-β抗体和抗Flt-1抗体检测蛋白。含有杂合体3和4的样品是来自个体转染的一式两份重复。

图5显示证实人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的VEGF诱导和VEGF+PDGF-β诱导的增殖由杂合蛋白、杂合体1至4抑制的图。A)仅用VEGF的HUVEC增殖分析：在仅VEGF(10ng/ml)存在下比较5μl含有可溶性受体的条件培养基(CM)对HUVEC增殖的抑制效应。B)在VEGF(10ng/ml)和PDGF(20ng/ml)存在下HUVEC竞争性增殖分析：在两种配体VEGF和PDGF存在下比较5μl含有可溶性受体的CM对HUVEC增殖的抑制效应。在一个分析中评估来自三个独立性转染(n＝3)的样品。数据表示为平均值±SD。单向ANOVA；Tukey检验；单独阳性对照VEGF+或VEGF+与PDGFBB+的组合对其他样品间的差异的***p<0.001。对照＝EGFPCM；VEGF+＝EGFPCM+10ng/mlVEGF；仅BB+＝EGFPCM+20ng/ml；VEGF+BB+＝EGFPCM+10ng/mlVEGF+20ng/mlPDGFBB。

图6显示杂合蛋白的体积结合分析。A)与PDGFR(D1-D5)9G-Fc相比的杂合蛋白1至4的PDGFBB体积结合分析。B)与sFLT01相比的杂合蛋白1至4的VEGF体积结合分析。将逐渐增加的体积的含有来自代表性转染的可溶性受体的条件培养基(x轴)与人PDGFBB或VEGF配体一起温育过夜且通过ELISA一式三份地测量未结合配体的量(y轴)。

图7显示杂合蛋白的竞争性VEGF和PDGF无细胞结合分析。A)逐渐增加的条件培养基体积(x轴)和如通过PDGFBBELISA测量的未结合PDGF配体的量(y轴)中的杂合体3(杂合体编号3)、杂合体4(杂合体编号4)和PDGFR(D1-D3)9G-Fc的比较。B)逐渐增加的条件培养基体积(x轴)和如通过VEGFELISA测量的未结合VEGF配体的量(y轴)中的杂合体3(杂合体编号3)、杂合体4(杂合体编号4)和sFltT01的比较。

图8是显示AAV2的体内效力的图。小鼠脉络膜新生血管形成(CNV)激光模型中的杂合体4玻璃体内递送。比较AAV2.杂合体4(示为杂合体-4)、AAV2.sFLT02(示为sFLT02)、AAV2.PDGFR(示为PDGFR)处理的(左)眼中无新生血管形成的烧伤的数目(NV)与未经处理对侧(右；天然)眼。两只眼的数据(n＝20只眼/处理)表示为无CNV的烧伤的百分比。用于构建AAV2.PDGFR的PDGFR部分是PDGFR(D1-D3)9G-Fc。

发明详述

本发明尤其提供融合蛋白和其组合物，其抑制血浆衍生的生长因子(PDGF)信号通路和血管内皮生长因子(VEGF)信号通路。如本文所述本发明的融合蛋白包含PDGF受体(PDGFR)的细胞外部分、VEGF受体(VEGFR)的细胞外部分和多聚化结构域，其中融合蛋白分别结合至PDGF和VEGF用于抑制PDGF活性和VEGF活性。本文还提供产生融合蛋白的方法、递送融合蛋白的方法和使用融合蛋白治疗眼部疾病、自体免疫疾病、炎性疾病和/或癌症的方法。

I.一般技术

本文阐述或提述的技术和步骤通常为众所周知且由那些本领域的技术人员使用惯用方法普遍采用，例如，下列中所述的广泛应用方法：MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook等,第四版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2012)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel,等编辑,2003)；theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.)；PCR2:APracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.HamesandG.R.Taylor编辑,1995)；Antibodies,ALaboratoryManual(HarlowandLane,编辑,1988)；CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechniqueandSpecializedApplications(R.I.Freshney,第六版,J.WileyandSons,2010)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；MethodsinMolecularBiology,HumanaPress；CellBiology:ALaboratoryNotebook(J.E.Cellis,编辑,AcademicPress,1998)；IntroductiontoCellandTissueCulture(J.P.MatherandP.E.Roberts,PlenumPress,1998)；CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,andD.G.Newell,编辑,J.WileyandSons,1993-8)；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.WeirandC.C.Blackwell,编辑,1996)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.MillerandM.P.Calos,编辑,1987)；PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullis等,编辑,1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等,编辑,1991)；ShortProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等,编辑,J.WileyandSons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:APracticalApproach(D.Catty.,编辑,IRLPress,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:APracticalApproach(P.ShepherdandC.Dean,编辑,OxfordUniversityPress,2000)；UsingAntibodies:ALaboratoryManual(E.HarlowandD.Lane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999)；TheAntibodies(M.ZanettiandJ.D.Capra,编辑,HarwoodAcademicPublishers,1995)；和Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology(V.T.DeVita等,编辑,J.B.LippincottCompany,2011)。

II.定义

如本文所用“载体”指包含在体外或体内将递送至宿主细胞的核酸的重组质粒或病毒。

本文所用术语“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸的聚合物形式，或为核糖核苷酸或为脱氧核糖核苷酸。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰的非天然或衍生化核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸酯基团(如通常可于RNA或DNA中发现)或经修饰或取代的糖或磷酸酯基团。或者，多核苷酸的主链可包含合成亚单元(例如氨基磷酸酯)的聚合物且因此可为寡脱氧核苷酸氨基磷酸酯(P-NH2)或混合氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。另外，双链多核苷酸可通过合成互补链和使链在适当条件下退火或通过使用DNA聚合酶以及适当引物从而重新合成互补链来从化学合成的单链多核苷酸产物获得。

“重组病毒载体”是指包含一个或多个异源序列(即并非病毒起源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况中，重组核酸旁侧为至少一个、优选两个反向末端重复序列(ITR)。

“重组AAV载体(rAAV载体)”指包含一个或多个旁侧为至少一个、优选两个AAV反向末端重复序列(ITR)的异源序列(即并非AAV起源的核酸序列)的多核苷酸载体。这些rAAV载体可在存在于经合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)且表达AAVrep和cap基因产物(即AAVRep和Cap蛋白)的宿主细胞中时复制且包装至感染病毒颗粒中。在rAAV载体并入较大多核苷酸中(例如在染色体中或在另一载体(例如用于克隆或转染的质粒)中)时，则rAAV载体可称作“前载体”，其可通过在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下复制和衣壳化而“得以复苏”。rAAV可呈多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、直链人工染色体，其与脂质复合，囊封于脂质体内，且最优选在病毒颗粒、具体而言AAV中衣壳化。rAAV载体可包装至AAV病毒衣壳中以生成“重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)”。

“异源”意为衍生自与同其比较或其引入或并入的实体的剩余部分在遗传上不同的实体。举例而言，通过基因工程技术引入至不同细胞类型中的多核苷酸是异源多核苷酸(且在表达时，可编码异源多肽)。类似地，并入病毒载体中的细胞序列(例如，基因或其部分)是关于载体的异源核苷酸序列。

“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域众所周知的术语且指在病毒基因组末端发现的呈相对定向的相对较短序列。

“AAV反向末端重复(ITR)”序列(本领域众所周知的术语)是在天然单链AAV基因组的两个末端存在的约145个核苷酸序列。ITR的最外125个核苷酸可以两种任选定向中的任一种存在，从而导致不同AAV基因组间和单一AAV基因组的两端间的异质性。最外125个核苷酸还含有自互补性的若干较短区，从而允许在ITR的该部分中出现链内碱基配对。

“末端解析序列”或“trs”是在病毒DNA复制期间由AAVrep蛋白裂解的AAVITR的D区中的序列。突变末端解析序列难以由AAVrep蛋白裂解。

如参照病毒效价使用的术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等效物”或“基因组拷贝”指含有重组AAVDNA基因组的病毒体的数目，与感染性或功能性无关。特定载体制备中的基因组颗粒的数目可通过(例如)本文实施例或(例如)Clark等(1999)Hum.GeneTher.,10:1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278中所述的程序测量。

如参照病毒效价使用的术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”指感染和可复制性重组AAV载体颗粒的数目，如通过感染中心分析(还称作复制中心分析)测量，如(例如)McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述。

如参照病毒效价使用的术语“转导单位(tu)”指引起产生功能转基因产物的感染性重组AAV载体颗粒的数目，如(例如)本文实施例或(例如)Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124；orinFisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU分析)中所述的功能分析中所测量。

AAV的“辅助病毒”指允许AAV(其是缺陷性细小病毒)由宿主细胞复制和包装的病毒。已鉴别多种所述辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如痘疮)。腺病毒涵盖多个不同亚组，但最常使用亚组C的5型腺病毒(Ad5)。已知人、非人哺乳动物和禽类起源的多种腺病毒且其可自如ATCC等保藏机构获得。疱疹家族的病毒(其还可自如ATCC等保藏机构获得)包括(例如)单纯疱疹病毒(HSV)、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)。

“融合蛋白”指具有两个或多个共价连接在一起的部分的蛋白，其中所述部分各衍生自不同蛋白。

对于参考多肽或核酸序列而言，“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入空位(若需要)以达到最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸一致的氨基酸残基或核苷酸的百分比，且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。出于测定氨基酸或核酸序列同一性百分比的目的的比对可以为本领域的技术人员熟知的多种方式(例如使用公开获得的计算机软件程序，例如，那些阐述于CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等,编辑,1987),Supp.30,section7.7.18,Table7.7.1的软件，并且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR))实现。优选比对程序是ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware,Pennsylvania)。那些本领域的技术人员可测定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长范围内达成最大比对所需要的任何算法。出于本文目的，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表达为具有或包含对、与或针对给定氨基酸序列B的一定氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)计算如下：100×分数X/Y，其中X是在A与B的程序比对中由该序列比对程序评定为同一性匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应了解，倘若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A对B的氨基酸序列同一性％将不等于B对A的氨基酸序列同一性％。出于本文目的，给定核酸序列C对、与或针对给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者可表达为具有或包含对、与或针对给定核酸序列D的一定核酸序列同一性％的给定核酸序列C)计算如下：100×分数W/Z，其中W是在C与D的程序比对中由该序列比对程序评定为同一性匹配的核苷酸数，且其中Z是D中核苷酸的总数。应了解，倘若核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度，则C对D的核酸序列同一性％将不等于D对C的核酸序列同一性％。

“分离的”分子(例如，核酸或蛋白)或细胞意为其已自其天然环境的组份鉴别并分离和/或回收。

“有效的量”是足以实现有益或预期结果(包括临床结果)的量。有效的量可以一或多次施用来施用。就疾病状态而言，有效的量是足以改善、稳定或延迟疾病发展的量。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，例如猴子)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

如本文所用“治疗”是获得有益或期望临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望临床结果包括但不限于减轻症状、降低疾病程度、稳定疾病状态(即不恶化)、预防疾病扩展(即，转移)、延迟或减慢疾病进展、改善或缓和疾病状态和缓解病情(部分或全部)，无论是可检测或不可检测的。“治疗”还可意为与不接受治疗的预期存活相比延长存活。

提述“约”某一值或参数在本文中包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方案。举例而言，关于“约X”的说明包括对“X”的说明。

除非另有说明，否则本文所用冠词的单数形式“一个”和“所述”包括复数参照物。举例而言，词组“rAAV颗粒”包括一个或多个rAAV颗粒。

应理解，本文所述本发明的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案、“由其组成”和/或“基本上由其组成”。

III.融合蛋白和融合蛋白组份

血浆衍生的生长因子(PDGF)受体

血浆衍生的生长因子(PDGF)参与许多生物活动且已涉及多种疾病，例如动脉粥样硬化、肾小球性肾炎、血管成形术后血管再狭窄和癌症。存在调控PDGF信号通路的蛋白的血浆衍生的生长因子(PDGF)家族的至少四个成员，具体而言PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D。该四个PDGF经由同源二聚化或异源二聚化组装成二硫键连接二聚体。迄今已阐述PDGF的至少5种不同二聚体同型异构体且其包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和PDGF-AB，其都结合至PDGF受体(PDGFR)以激活PDGF信号通路。存在至少两种鉴别的PDGFR，即PDGFR-α和PDGFR-β。每一PDGFR具有细胞外区、跨膜结构域和具有细胞内酪氨酸激酶活性的细胞内区。PDGFR可二聚化以形成同源二聚体PDGFR-α/PDGFR-α或PDGFR-β/PDGFR-β和异源二聚体PDGFR-α/PDGFR-β。这些PDGFR二聚体形式中的每一种都识别PDGF的不同二聚体同型异构体。举例而言，PDGFR-α/PDGFR-α识别PDGF-AA、AB、BB和CC配体，PDGFR-α/PDGFR-β识别PDGF-AB、BB、CC和DD，且PDGFR-β/PDGFR-β识别PDGF-BB和DD。PDGF-AA和-BB结合位点的缺失诱变已定位至PDGFR-α的氨基酸1-314，而PDGF-BB结合位点已定位至PDGFR-β的氨基酸1-315。介导与PDGF的结合的这些PDGFR的细胞外区含有5个免疫球蛋白(Ig)样结构域，其各自长度在约88至约114个氨基酸范围内。参见Lokker等,JBiolChem.,1997,272(52):33037-44,Miyazawa等,JBiolChem.,1998,273(39):25495-502；andMahadevan等,JBiolChem.,1995,270(46):27595-600，其全文以提述并入本文。

本发明提供本身可为本文公开的任何融合蛋白的组份的PDGF受体的细胞外部分。因此，在一个方面中，本发明提供PDGFR的细胞外部分，其包括但不限于PDGFR-α和PDGFR-β。在本文的一些实施方案中，PDGFR来自哺乳动物，例如人。存在5个自PDGFR细胞外区的N末端开始至C末端编号为1、2、3、4和5的Ig样结构域。本文所用术语“PDGFR的细胞外部分”指PDGFR细胞外区中的5个Ig样结构域中的一个或多个。举例而言，“PDGFR的细胞外部分”指PDGFR的细胞外区中发现的5个Ig样结构域(例如Ig样结构域D1、Ig样结构域D2、Ig样结构域D3、Ig样结构域D4或Ig样结构域D5)中的任一个或多个。如PDGFR的“Ig样结构域D1”或“细胞外结构域(ECD)1”等本文所用术语具体而言指在PDGFR的细胞外区的N末端发现的第一Ig样结构域，PDGFR的“Ig样结构域D2”或“ECD1”具体而言指PDGFR的细胞外区的N末端的第二Ig样结构域等等。在本文中任一方面中，PDGFR的细胞外部分包含一种或多种PDGFR的至少一个Ig样结构域(选自PDGFR-α和PDGFR-β)。在一些方面中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的至少1、2、3、4、但不超过5个Ig样结构域。在一些方面中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的1至5、1至4、1至3或1至2个Ig样结构域。举例而言，PDGFR的细胞外部分可包含PDGFR的Ig样结构域D2。在另一实施例中，PDGFR的细胞外部分可包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1至D2。在又一实施例中，PDGFR的细胞外部分可包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1至D3、Ig样结构域D1至D4或Ig样结构域D1至D5。

本文涵盖包含每一PDGFR的5个Ig样结构域的任一组合的细胞外部分。因此，在一个方面中，本发明提供包含两种PDGFR的至少一个Ig样结构域的PDGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含来自两种PDGFR(选自PDGFR-α和PDGFR-β)的至少一个Ig样结构域。举例而言，如本文所述融合蛋白可包含含有PDGFR-α的至少一个Ig样结构域和PDGFR-β的至少一个Ig样结构域的PDGFR的细胞外部分。在一些方面中，PDGFR的细胞外部分包含至少两种或多种PDGFR的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、但不超过10个Ig样结构域。在又一方面中，PDGFR的细胞外部分包含至少两种或更多种PDGFR的1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2个Ig样结构域。关于可用作PDGFR的细胞外部分的一部分的Ig样结构域的进一步说明，参见美国专利第5,686,572号、WO2006113277和Lokker等,JBiolChem.1997,272(52):33037-44，其全文都以提述并入本文。

在一些方面中，PDGFR的细胞外部分包含选自SEQIDNO:1-3的氨基酸序列。举例而言，包含氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的PDGFR的细胞外部分可为本文公开的任何融合蛋白的组份。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含选自SEQIDNO:7和8的氨基酸序列。

还涵盖本文所提供PDGFR的任何细胞外部分的氨基酸序列变体。举例而言，可通过改变编码蛋白的氨基酸序列改进PDGFR的细胞外部分的结合亲和力和/或其他生物性质。PDGFR的细胞外部分的氨基酸序列变体可通过向编码蛋白的核酸序列引入适当修饰或通过肽合成引入修饰制备。这些修饰包括例如在PDGFR的细胞外部分内的氨基酸序列的缺失、插入和/或取代。可实施缺失、插入和取代的任一组合以实现PDGFR的细胞外部分的最终氨基酸构建体，前提为最终构建体具有期望特性，例如结合至PDGF家族蛋白和/或抑制PDGF途径的激活。因此，本文提供可为本文公开的任何融合蛋白的组份的PDGFR的细胞外部分的变体。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含与PDGFR-α(例如，人PDGFR-α)的Ig样结构域D1、D2、D3、D4或D5中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含与PDGFR-β(例如，人PDGFR-β)的Ig样结构域D1、D2、D3、D4或D5中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含与选自SEQIDNO:1-3的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含与选自SEQIDNO:7和8的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

不限于理论，本文涵盖PDGFR的细胞外部分通过结合至PDGF家族蛋白以阻断其与PDGFR相互作用来抑制PDGF途径的激活。不限于理论，本文还涵盖PDGFR的细胞外部分可结合至PDGFR用于PDGF信号通路的显性负性抑制。在一些方面中，PDGFR的细胞外部分结合选自PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D的PDGF家族蛋白。在一些方面中，PDGFR的细胞外部分结合选自PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD的PDGF家族蛋白二聚体。在一些方面中，PDGFR的细胞外部分结合选自PDGFR-α和PDGFR-β的PDGFR。

PDGFR的细胞外部分可包含或可不包含用作信号序列用于PDGFR的细胞外部分自宿主细胞分泌的信号肽。信号肽可以可操作方式连接至编码目标蛋白(例如，PDGFR的细胞外部分)的核酸。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含信号肽。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分不包含信号肽。

血管内皮生长因子(VEGF)受体

存在调控VEGF信号通路的蛋白的VEGF家族的至少5个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PlGF)。此外，编码VEGF-A、VEGF-B和PlGF的mRNA的选择性剪接可生成这些蛋白的多种同型异构体。举例而言，VEGF-A的选择性剪接产生9种不同同型异构体，包括同型异构体VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆。蛋白的VEGF家族通过结合至跨膜VEGF受体的细胞外区激活VEGF信号通路。存在至少3种鉴别的VEGF受体：VEGFR1(还称作fms有关的酪氨酸激酶1(Flt-1))、VEGFR2(还称作激酶插入结构域受体(KDR))和VEGFR3(还称作fms样酪氨酸激酶4(Flt-4))。VEGFR各自含有包含7个免疫球蛋白(Ig)样结构域的细胞外区、单一跨膜结构域区段、近膜区段和细胞内蛋白-酪氨酸激酶结构域。VEGFR的细胞外区结合至蛋白的VEGF家族的不同成员。举例而言，VEGFR1结合VEGF-A、VEGF-B和PlGF；VEGFR2结合所有VEGF-A同型异构体、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E；且VEGFR3结合至VEGF-C和VEGF-D。关于VEGF和VEGFR介导的信号传导的综述，参见Roskoski,R等,CritRevOncolHematol.,2007,62(3):179-213，其全文以提述并入本文。

本发明提供本身可为本文公开的任何融合蛋白的组份的VEGF受体的细胞外部分。因此，在一个方面中，本发明提供包括但不限于VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的VEGFR的细胞外部分。在本文的一些实施方案中，VEGFR来自哺乳动物，例如人。存在7个自VEGFR细胞外区的N末端开始至C末端编号为1、2、3、4、5、6和7的细胞外Ig样结构域。本文所用术语“VEGFR的细胞外部分”指VEGFR细胞外区中的7个Ig样结构域中的一个或多个。举例而言，“VEGFR的细胞外部分”指VEGFR的细胞外区中发现的7个Ig样结构域(例如Ig样结构域D1、Ig样结构域D2、Ig样结构域D3、Ig样结构域D4、Ig样结构域D5、Ig样结构域D6或Ig样结构域D7)中的任一个或多个。如VEGFR的“Ig样结构域D1”或“细胞外结构域(ECD)1”等本文所用术语都具体而言指在VEGFR的细胞外区的N末端发现的第一Ig样结构域，VEGFR的“Ig样结构域D2”或“ECD2”二者具体而言指VEGFR的细胞外区的N末端的第二Ig样结构域，等等。在本文任何方面中，VEGFR的细胞外部分包含一或多种选自VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的VEGFR的至少一个Ig样结构域。在一些方面中，VEGFR的细胞外部分包含VEGFR(例如，VEGFR1)的至少1、2、3、4、5、6、但不超过7个Ig样结构域。在一些方面中，VEGFR的细胞外部分包含VEGFR(例如，VEGFR1)的1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个Ig样结构域。举例而言，VEGFR的细胞外部分可包含VEGFR1的Ig样结构域D2。在另一实施例中，VEGFR的细胞外部分可包含VEGR1的Ig样结构域D1至D3。在又一实施例中，VEGFR的细胞外部分可包含VEGFR1的Ig样结构域D2至D3或VEGFR2的Ig样结构域D1至D3。

本文涵盖包含每一VEGFR的7个Ig样结构域的任一组合的细胞外部分。因此，在一个方面中，本发明提供包含两种或多种VEGFR的至少一个Ig样结构域的VEGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含两种或多种选自VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的VEGFR的至少一个Ig样结构域。举例而言，如本文所述融合蛋白可包含含有VEGFR1的至少一个Ig样结构域和VEGFR2的至少一个Ig样结构域的VEGFR的细胞外部分。在另一实施例中，如本文所述融合蛋白可包含含有VEGFR1的Ig样结构域D2和VEGFR2的Ig样结构域D3至D4的VEGFR的细胞外部分。在另一实施例中，如本文所述融合蛋白可包含含有VEGFR1的Ig样结构域D2和VEGFR3的Ig样结构域D3的VEGFR的细胞外部分。在一些方面中，VEGFR的细胞外部分包含至少两种或更多种VEGFR的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、但不超过21个Ig样结构域。在又一方面中，VEGFR的细胞外部分包含至少两种或多种VEGFR的1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个Ig样结构域。关于可用作VEGFR的细胞外部分的一部分的Ig样结构域的进一步说明，参见美国专利第7,928,072号、WO2006113277、Davis-Smyth,T.,等,JBiolChem,1998,273:3216-3222,Holash,J.,等,PNAS,2002,99(17):11393-11398,andPechan,P.,等,GeneTher,2009,16:10-16，其全文都以提述并入本文。

在一些方面中，VEGFR的细胞外部分包含氨基酸序列SEQIDNO:4。在一些方面中，VEGFR的细胞外部分包含氨基酸序列SEQIDNO:5。举例而言，包含氨基酸序列SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的VEGFR的细胞外部分可为本文公开的任何融合蛋白的组份。

还涵盖本文所提供VEGFR的任何细胞外部分的氨基酸序列变体。举例而言，可通过改变编码蛋白的氨基酸序列改进VEGFR的细胞外部分的结合亲和力和/或其他生物性质。VEGFR的细胞外部分的氨基酸序列变体可通过向编码蛋白的核酸序列引入适当修饰或通过肽合成引入修饰制备。这些修饰包括例如VEGFR的细胞外部分内的氨基酸序列的缺失、插入和/或取代。可实施缺失、插入和取代的任一组合以实现VEGFR的细胞外部分的最终氨基酸构建体，前提为最终构建体具有期望特性，例如结合至VEGF家族蛋白和/或抑制VEGF途径的激活。因此，本文提供本身可为本文公开的任何融合蛋白的组份的VEGFR的细胞外部分的变体。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含与VEGFR1(例如，人VEGFR1)的Ig样结构域D1、D2、D3、D4、D5、D6或D7中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含与VEGFR2(例如，人VEGFR2)的Ig样结构域D1、D2、D3、D4、D5、D6或D7中的任一种的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含与VEGFR3(例如，人VEGFR3)的Ig样结构域D1、D2、D3、D4、D5、D6或D7中的任一种的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含与选自SEQIDNO:4和5的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

不限于理论，本文涵盖VEGFR的细胞外部分通过结合至VEGF家族蛋白以阻断其与VEGFR相互作用来抑制VEGF途径的激活。不限于理论，本文还涵盖VEGFR的细胞外部分可结合至VEGFR用于VEGF信号通路的显性负性抑制。在一些方面中，VEGFR的细胞外部分结合选自VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PlGF的VEGF家族蛋白。在一些方面中，VEGFR的细胞外部分结合VEGFR(例如，VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3)。

VEGFR的细胞外部分可包含或可不包含用作信号序列用于VEGFR的细胞外部分自宿主细胞分泌的信号肽。信号肽可以可操作方式连接至编码目标蛋白(例如，VEGFR的细胞外部分)的核酸。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含信号肽。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分不包含信号肽。

多聚化结构域

本发明提供本身可为本文公开的任何融合蛋白的组份的多聚化结构域(例如，抗体的Fc区)。多聚化结构域是多聚体蛋白中促使亚单元缔合以形成(例如)二聚体、三聚体、四聚体等的那些部分。本文所用术语“多聚化结构域”可用于指二聚化结构域、三聚化结构域、四聚化结构域等等。包含多聚化结构域的融合蛋白可与其他包含多聚化结构域的融合蛋白相互作用以产生融合蛋白多聚体(例如，融合蛋白二聚体)。举例而言，IgGFc区是如本文公开可融合至PDGFR的细胞外部分或VEGFR的细胞外部分的二聚化结构域。包含PDGFR的细胞外部分和IgGFc区的融合蛋白可与另一包含IgGFc区的融合蛋白二聚化以产生与至少PDGF具有多特异性的融合蛋白二聚体。多聚化结构域可为与另一多肽形成多聚体的任一多肽。本领域已知可使用的多聚化结构域。参见美国专利第7,928,072号和WO2006/113277。举例而言，可使用IgG1或IgG2λ重链的Fc区(例如仅CH3结构域或CH2和CH3两个结构域)作为多聚化结构域。还可使用来自免疫球蛋白同种型(例如IgA、IgM、IgD或IgE)的其他Fc区作为多聚化结构域。本文所用术语“Fc区”用于界定免疫球蛋白重链中含有恒定区的至少一部分的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226、或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，可存在或可不存在Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)。在一个实施方案中，多聚化结构域是抗体的Fc区。在又一实施方案中，抗体的Fc区选自IgGFc区、IgAFc区、IgMFc区、IgDFc区和IgEFc区。在又一实施方案中，抗体的Fc区选自IgG1Fc区、IgG2Fc区、IgG3Fc区和IgG4Fc区。在一些方面中，Fc区包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH3区。在一些方面中，Fc区包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和CH3区。本领域熟知编码包含Fc区的免疫球蛋白的氨基酸序列。举例而言，可在基因库登记号CAA75032下找到IgG1λ重链氨基酸序列。免疫球蛋白的Fc区可通过用酶木瓜蛋白酶裂解或通过其他方式获得。在一些实施方案中，Fc区包含氨基酸序列SEQIDNO:6。还可使用VEGF的多聚化结构域，例如VEGF-A的多聚化结构域。VEGF-A由在基因库登记号NM003376下显示的核酸编码。举例而言，VEGF-A的多聚化结构域由VEGF-A外显子3编码且可连接至本文公开的融合蛋白组份中的任一种，例如PDGFR的细胞外部分和/或VEGFR的细胞外部分。

在一些实施方案中，本文提供多聚化结构域的氨基酸序列变体。举例而言，可期望改进多聚化结构域的生物性质(例如，多聚化性质)。多聚化结构域的氨基酸序列变体可通过向编码蛋白的核酸序列引入适当修饰或通过肽合成引入修饰制备。所述修饰包括例如多聚化结构域内的氨基酸序列的缺失、插入和/或取代。可实施缺失、插入和取代的任一组合以获得多聚化的最终氨基酸构建体，前提为最终构建体具有预期特性，例如形成多聚体蛋白。因此，本文提供本身可为本文公开的任何融合蛋白的组份的多聚化结构域的变体(例如，抗体的Fc区)。在一些实施方案中，Fc区包含与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH3区的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc区包含与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和CH3区的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc区包含与氨基酸序列SEQIDNO：6具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。本领域熟知多聚化结构域的变体。例如，参见美国专利申请第2012/0251531号，其全文以提述并入本文。

接头

融合蛋白的组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分或多聚化结构域)可通过连接部分(例如肽接头)连接。优选地，接头增加融合蛋白组份的柔性且不显著干扰融合蛋白内的每一功能组份的结构。在一些实施方案中，接头部分是肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含2至100个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、但不大于100个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度介于5至75、5至50、5至25、5至20、5至15、5至10或5至9个氨基酸。例示性接头包括具有至少两个氨基酸残基的直链肽，例如Gly-Gly、Gly-Ala-Gly、Gly-Pro-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO:46)。合适的直链肽包括聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚脯氨酸、聚丙氨酸和由丙氨酰基和/或丝氨酰基和/或脯氨酰基和/或甘氨酰基氨基酸残基组成的寡肽。在一些实施方案中，肽接头包含选自下组的氨基酸序列：Gly₉(SEQIDNO:47)、Glu₉(SEQIDNO:48)、Ser₉(SEQIDNO:49)、Gly₅-Cys-Pro₂-Cys(SEQIDNO:50)、(Gly₄-Ser)₃(SEQIDNO:51)、Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:52)、Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:53)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQIDNO:54)和Gly₉-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:55)。

接头部分还可自其他聚合物(例如聚乙二醇)制备。所述接头可具有10至1000、10至500、10至250、10至100或10至50个乙二醇单体单元。合适的聚合物的大小应类似于由适当范围的氨基酸残基占据的大小。典型大小的聚合物可提供约10-25埃间距。

接头部分可为具有以非直链型式连接多个融合蛋白组份的分支“臂”的蛋白多价接头。在一些实施方案中，多价接头具有约3至40个氨基酸残基，其全部或一些提供与融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分或多聚化结构域)结合的附着位点。α氨基和α羧酸可用作附着位点。例示性多价接头包括但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚半胱氨酸、聚谷氨酸和聚天冬氨酸。任选地，氨基酸序列中可包括具有惰性侧链的氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸)。接头还可为非肽化学实体，例如在附着至融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)后适于施用(例如，眼部施用)的化学接头。化学接头可为双功能接头，其各自与融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)反应。或者，化学接头可为具有多个适当间隔的反应基团的支链接头，所述基团各自可与融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)的功能基团反应。融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)通过反应性功能基团附着且间隔开，以使空间位阻不会实质上干扰一些反应性功能基团(例如，胺、羧酸、醇、醛和硫醇)与肽间的共价键的形成。接头部分的实例包括但不限于公开于Tarn,J.P.,等,J.ofImmunolMethods,1996,196:17-32的那些。

接头部分可用于连接本文公开的融合蛋白的任一组份。举例而言，肽接头(例如，Gly₉(SEQIDNO:47))可用于将PDGFR的细胞外部分的C末端连接至VEGFR的细胞外部分的N末端且可进一步用于将VEGR的细胞外部分的C末端连接至多聚化结构域(例如，IgG1Fc区)的N末端。在一些实施方案中，在PDGFR的细胞外部分与多聚化结构域间使用接头。在一些实施方案中，在VEGFR的细胞外部分与多聚化结构域间使用接头。在一些实施方案中，在PDGFR的细胞外部分与VEGFR的细胞外部分间使用接头。在一些实施方案中，融合蛋白包含PDGFR的细胞外部分与VEGFR的细胞外区间的接头和VEGFR的细胞外区与多聚化结构域(例如，Fc区)间的接头。在一些实施方案中，融合蛋白包含至少一个接头、但不超过四个接头。举例而言，融合蛋白可自N末端至C末端以选自下组的次序包含(a)PDGFR的细胞外部分，(b)VEGFR的细胞外部分，(c)多聚化结构域(例如，IgG1Fc区)和至少一个接头：(1)接头、a、接头、b、接头、c、接头；(2)a、接头、b、接头、c、接头；(3)接头、a、接头、b、接头、c；(4)a、接头、b、接头、c；(5)a、接头、b、c；和(6)a、b、接头、c。在另一实例中，融合蛋白可从N末端至C末端以选自下组的次序包含(a)PDGFR的细胞外部分，(b)多聚化结构域(例如，IgG1Fc区)和至少一个接头：(1)接头、a、接头、b、接头；(2)接头、a、接头、b；(3)a、b、接头；(4)a、接头、b；(5)接头、b、接头、a、接头；(6)接头、b、接头、a；(7)b、a、接头；和(8)b、接头、a。

融合蛋白

本文提供对至少两种不同结合配偶体(例如，PDGF和VEGF)具有结合特异性的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含对PDGF家族的蛋白(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C或PDGF-D)的第一结合特异性和对VEGF(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PlGF)的第二结合特异性。在一些实施方案中，融合蛋白包含对PDGF家族的蛋白二聚体(例如，PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC或PDGF-DD)的第一结合特异性和对VEGF(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PlGF)的第二结合特异性。在一些实施方案中，融合蛋白包含对哺乳动物(例如，人)PDGF的第一结合特异性和对哺乳动物(例如，人)VEGF的第二结合特异性。在一些实施方案中，融合蛋白结合至与本文所述PDGFR中的任一种相同的PDGF。在一些实施方案中，融合蛋白结合至与PDGFR-α或PDGFR-β中的任一种相同的PDGF途径的组份。在一些实施方案中，融合蛋白结合至与PDGFR-α/PDGFR-α、PDGFR-β/PDGFR-β或PDGFR-α/PDGFR-β二聚体中的任一种相同的PDGF。在一些实施方案中，融合蛋白包含本文所述PDGFR中的任一者的PDGFR的至少一个细胞外部分。举例而言，融合蛋白可包含PDGFR-α的至少一个细胞外部分和PDGFR-β的至少一个细胞外部分。在另一实例中，融合蛋白可包含PDGFR-β的两个细胞外部分，例如Ig样结构域D1-D3和Ig样结构域D1-D5。在一些方面中，融合蛋白包含含有选自SEQIDNO:1-3的氨基酸序列的PDGFR的细胞外部分。在一些方面中，融合蛋白包含含有选自SEQIDNO:7和8的氨基酸序列的PDGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，融合蛋白结合至与本文所述VEGFR中的任一种相同的VEGF途径的组份。在一些实施方案中，融合蛋白结合至与VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3中的任一种相同的VEGF途径的组份。在一些实施方案中，融合蛋白包含本文所述VEGFR中的任一种的VEGFR的至少一个细胞外部分。举例而言，融合蛋白可包含VEGFR1的至少一个细胞外部分和VEGFR2的至少一个细胞外部分。在另一实例中，融合蛋白可包含VEGFR1的两个细胞外部分，例如Ig样结构域D2和Ig样结构域D1-D3。在一些方面中，融合蛋白包含含有选自SEQIDNO:4和5的氨基酸序列的VEGFR的细胞外部分。包含PDGFR的细胞外部分和VEGFR的细胞外部分的本文公开的任何融合蛋白可进一步包含多聚化结构域。在一些实施方案中，多聚化结构域是Fc区(例如，IgG1Fc区)。在一些实施方案中，Fc区包含氨基酸序列SEQIDNO:6。在一些实施方案中，包含PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和多聚化结构域的融合蛋白抑制PDGF和VEGF信号通路(例如，抑制PDGF和VEGF活性)。包含PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和多聚化结构域的本文公开的任何融合蛋白可进一步包含接头。接头可为如本文公开的任何接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，接头包含选自下组的氨基酸序列：Gly₉(SEQIDNO:47)、Glu₉(SEQIDNO:48)、Ser₉(SEQIDNO:49)、Gly₅-Cys-Pro₂-Cys(SEQIDNO:50)、(Gly₄-Ser)₃(SEQIDNO:51)、Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:52)、Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:53)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQIDNO:54)和Gly₉-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:55)。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含哺乳动物(例如，人)PDGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含哺乳动物(例如，人)VEGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，融合蛋白包含人PDGFR(例如，人PDGFR-β)的细胞外部分和人VEGFR(例如，人VEGFR1)的细胞外部分。

在一个方面中，本发明提供包含以下的融合蛋白：a)包含氨基酸序列SEQIDNO:1、2、3、7或8的PDGFR的细胞外部分；b)包含氨基酸序列SEQIDNO:4或5的VEGFR的细胞外部分；和c)包含氨基酸序列SEQIDNO:6的多聚化结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含：a)包含氨基酸序列SEQIDNO:1的PDGFR的细胞外部分；b)包含氨基酸序列SEQIDNO:4的VEGFR的细胞外部分；和c)包含氨基酸序列SEQIDNO:6的多聚化结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含：a)包含氨基酸序列SEQIDNO:3的PDGFR的细胞外部分；b)包含氨基酸序列SEQIDNO:4的VEGFR的细胞外部分；和c)包含氨基酸序列SEQIDNO:6的多聚化结构域。

本文提供以特定次序包含PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和多聚化结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含(a)PDGFR的细胞外部分、(b)VEGFR的细胞外部分和(c)Fc区，自N末端至C末端以a、b、c的次序排列。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1-D3。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1-D4。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1-D5。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含VEGFR(例如，VEGFR1)的Ig样结构域D2。在一些实施方案中，VEGFR的细胞外部分包含VEGFR(例如，VEGFR1)的Ig样结构域D1-D3。在一些实施方案中，多聚化结构域包含IgG1抗体的Fc区。

在一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:12。在其他实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:13。在又一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:14。在再一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:15。

还涵盖包含PDGFR的至少两个或多个细胞外部分、VEGFR的两个或多个细胞外部分和/或两个或多个多聚化结构域的融合蛋白。举例而言，融合蛋白可包含(a)PDGFR的细胞外部分、(b)VEGFR的细胞外部分和(c)Fc区，自N末端至C末端以a、a、b、c的次序或以a、b、b、c的次序排列。本文提供PDGFR的至少一个细胞外部分、VEGFR的至少一个细胞外部分和至少一个多聚化结构域的任一组合，如同本文已明确说明每一组合一般。

还涵盖包含PDGFR的细胞外部分和多聚化结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含(a)PDGFR的细胞外部分和(b)Fc区，自N末端至C末端以a和b的次序排列。在一些实施方案中，融合蛋白包含(a)PDGFR的细胞外部分和(b)Fc区，自N末端至C末端以b和a的次序排列。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1-D2。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1-D3。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1-D4。在一些实施方案中，PDGFR的细胞外部分包含PDGFR(例如，PDGFR-β)的Ig样结构域D1-D5。在一些实施方案中，多聚化结构域包含IgG1抗体的Fc区。本文提供PDGFR的至少一个细胞外部分和至少一个多聚化结构域的任一组合，如同本文已明确说明每一组合一般。

在一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:9。在一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:10。在一些实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO:11。

本发明中所述融合蛋白可包含PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域的修饰形式。举例而言，融合蛋白组份可具有翻译后修饰，包括(例如)糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。

在一些实施方案中，本文提供融合蛋白的氨基酸序列变体。举例而言，可期望改进PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域的结合亲和力和/或其他生物性质。融合蛋白的氨基酸序列变体可通过向编码PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域的核苷酸序列引入适当修饰或通过肽合成引入修饰制备。这些修饰包括例如PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域的氨基酸序列内的残基的缺失、插入和/或取代。可实施缺失、插入和取代的任一组合以获得最终构建体，前提为最终构建体具有期望特性(例如，结合至PDGF、结合至VEGF、抑制PDGF途径的激活、多聚体形成和/或抑制VEGF途径的激活)。在一些实施方案中，融合蛋白包含与如本文所公开包含任一PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域的融合蛋白的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。在一些实施方案中，融合蛋白变体包含与选自SEQIDNO:12-15的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，融合蛋白变体包含与选自SEQIDNO:9-11的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。

本文公开的氨基酸残基取代还包括保守取代。保守取代示于下表1中的“保守取代”标题下。若这些取代引起生物活性改变，则可引入更实质性的改变(表1中命名为“例示性取代”，或如下文参照氨基酸种类进一步阐述)，并筛选产物。可向本文提供的融合蛋白或蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分、多聚化结构域等)中的任一种中引入如表1中所示或如下文参照氨基酸种类描述的氨基酸取代。

表1.潜在的氨基酸取代

对蛋白或多肽生物性质的实质修饰可通过选择在维持下列特征的作用方面显著不同的取代来实现：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如，呈片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。可根据常见侧链性质对氨基酸进行分组：

(1)疏水性残基：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性残基：Asp、Glu；

(4)碱性残基：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族残基：Trp、Tyr、Phe；

(7)大的疏水性残基：正亮氨酸、Met、Val、Leu、Ile。

非保守取代必须将这些类别中的一种的成员交换为另一类别。

用于鉴别融合蛋白上用于诱变的优选位置的某些残基或区的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由CunninghamandWellsinScience,1989,244:1081-1085中所述。此处，鉴别残基或目标残基组(例如，带电残基，例如arg、asp、his、lys和glu)并由中性或带负电的氨基酸(最优选为丙氨酸或聚丙氨酸)代替以实现氨基酸与目标结合配偶体间的相互作用。随后通过在取代位点或针对取代位点引入另外或其他变体来改进那些显示对取代具有功能敏感性的氨基酸位置。因此，在预先确定引入氨基酸序列变异的位点时，突变本身的性质无需预先确定。举例而言，为分析给定位点处的突变性能，在目标密码子或区处实施ala扫描诱变或随机诱变并就期望活性对所表达的融合多肽变体加以筛选。

任何不参与维持融合蛋白或蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分、多聚化结构域等)的适当构型的半胱氨酸残基还可通常由丝氨酸取代，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可向融合蛋白或蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分、多聚化结构域等)添加半胱氨酸键以改进其稳定性。

在其他实施方案中，本发明的蛋白或肽可包含一种或多种非天然或修饰的氨基酸。“非天然氨基酸残基”指除那些上文所列举天然氨基酸残基者外的残基，其能够共价结合多肽链中的毗邻氨基酸残基。非天然氨基酸包括但不限于高赖氨酸、高精氨酸、高丝氨酸、吖丁啶羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素(desmosine)、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、戊基甘氨酸、哌可酸和硫代脯氨酸。修饰氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其可逆或不可逆地经化学阻断，或在其N末端氨基或其侧链基团上修饰，例如，N-甲基化D和L氨基酸、经化学修饰成另一功能基团的侧链功能基团。举例而言，修饰氨基酸包括甲硫氨酸亚砜；甲硫氨酸砜；天冬氨酸-(β-甲基酯)、天冬氨酸的修饰氨基酸；N-乙基甘氨酸、甘氨酸的修饰氨基酸；或丙氨酸甲酰胺和丙氨酸的修饰氨基酸。本领域已知其他非天然和修饰氨基酸和将其并入蛋白和肽中的方法(例如，参见Sandberg等,(1998)J.Med.Chem.41:2481-91；XieandSchultz(2005)Curr.Opin.Chem.Biol.9:548-554；HodgsonandSanderson(2004)Chem.Soc.Rev.33:422-430。

氨基酸序列插入包括氨基-(“N”)和/或羧基(“C”)末端融合物(长度在一个残基至上百或更多残基范围内)以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的融合蛋白或与细胞毒性多肽融合的融合蛋白。融合蛋白分子的其他插入变体包括允许形成蛋白多聚体的多肽与融合蛋白的N-或C末端的融合物。

本发明提供信号肽，在本文中还称作信号序列，其可为本文提供的任何融合蛋白的组份。举例而言，包含PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和多聚化结构域的融合蛋白可进一步包含异源肽，优选信号序列或在成熟融合蛋白的N末端具有特定裂解位点的其他肽。所选异源信号序列优选是由真核宿主细胞识别和加工(即通过信号肽酶裂解)的。对于不识别和加工天然哺乳动物信号序列的原核宿主细胞，真核(即哺乳动物)信号序列由选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II基因的前导序列的原核信号序列取代。对于酵母分泌而言，天然信号序列可经以下取代：例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母菌属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前导序列或WO90/13646中所述信号。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如单纯疱疹gD信号。信号肽在其自宿主细胞产生时可从融合蛋白完全裂解，或其可部分裂解。融合蛋白的混合群体可从宿主细胞产生，其中融合蛋白包含完全裂解信号序列(例如无信号序列)、部分裂解信号序列(例如信号序列的部分)和/或非裂解信号序列(例如完全信号序列)。举例而言，在N末端进一步包含信号肽的融合蛋白可在N末端由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基中的任一处裂解。在一些实施方案中，本文所述的任何融合蛋白包含用于从细胞进行蛋白分泌的信号肽。在一些实施方案中，本文所述的任何融合蛋白都不包含用于从细胞进行蛋白分泌的信号肽。

本发明提供包含两个融合蛋白的二聚体融合蛋白，其中每一融合蛋白包含本文公开的任何融合蛋白。在一个实施方案中，二聚体融合蛋白包含两个相同融合蛋白。在另一实施方案中，二聚体融合蛋白包含两个不同融合蛋白。本文公开的融合蛋白可形成两种或更多种融合蛋白的多聚体。多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体等)可自相同融合蛋白形成(例如，均多聚体)或自异源融合蛋白形成(例如，杂多聚体)。在另一实施方案中，多聚体融合蛋白包含至少一个包含选自SEQIDNO:12-15的氨基酸序列或与选自SEQIDNO:12-15的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白。在另一实施方案中，多聚体融合蛋白包含至少一个包含选自SEQIDNO:9-11的氨基酸序列或与选自SEQIDNO:9-11的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白。在实施方案中，融合蛋白以蛋白融合多聚体形式从包含编码该融合蛋白的核酸的宿主细胞回收。在一些实施方案中，融合蛋白经糖基化。举例而言，融合蛋白可自宿主细胞释放后在PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域经糖基化。

本文还提供包含本发明的融合蛋白和药物上可接受的载剂的药物组合物。药物组合物可适于本文所述多种施用模式，包括(例如)全身或局部施用。药物组合物可呈滴眼剂、可注射溶液形式或呈适于吸入(经由口或鼻)或口服施用的形式。在一些实施方案中，包含本文所述融合蛋白和药物上可接受的载剂的药物组合物适于施用于人。在一些实施方案中，包含本文所述融合蛋白和药物上可接受的载剂的药物组合物适于玻璃体内注射或局部施用至眼。所述药物上可接受的载剂可为无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源，例如花生油、大豆油、矿物油等等。还可采用盐水溶液和水性右旋糖、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液作为液体载剂、具体而言用于可注射溶液。药物组合物可进一步包含其他成份，例如防腐剂、缓冲液、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非毒性润湿剂或澄清剂、黏度增加剂和诸如此类。本文所述药物组合物可包装成单一单位剂型或呈多剂型形式。组合物通常调配为无菌且实质上等渗的溶液。组合物还可经调配以具有与眼和眼部组织的房水兼容的渗透值。这样的渗透值通常可在约200至约400毫渗摩尔/千克水(“mOsm/kg”)的范围内，但优选可为约300mOsm/kg。认为视网膜具有约283mOsm/kg的渗透值。

Ⅳ核酸、载体和宿主细胞

核酸

本文提供编码本文公开的融合蛋白组份中的任一种(例如PDGFR的细胞外部分和VEGFR的细胞外部分和多聚化结构域)的分离核酸。已针对两种受体类型PDGFR-α和PDGFR-β阐述编码哺乳动物PDGFR的核酸。例示性核酸序列可参见但不限于Yarden等,Nature,1986,323:226-232；Matsui等,Science,1989,243:800-803；美国专利申请案第07/771,829号，其是美国专利申请案第07/309,332号(现已放弃)的继续申请，美国专利第5,686,572号和WO2006/113277。编码人PDGFR-α和PDGFR-β的mRNA可分别参见基因库登记号NM_006206.4和NM_002609.3。在一些实施方案中，分离核酸编码包含选自SEQIDNO:1-3的氨基酸序列的PDGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，分离核酸编码包含与选自SEQIDNO:1-3的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的PDGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，编码PDGFR的细胞外部分的分离核酸选自SEQIDNO:16和17。本文还提供编码VEGFR的细胞外部分的分离核酸。已针对所有受体类型阐述编码哺乳动物VEGFR的核酸。例示性核酸序列可参见但不限于美国专利第7,928,072号和WO2006/113277。编码人VEGFR1和VEGFR2的mRNA可分别参见基因库登记号NM_001159920.1和NM_002253.2。编码人VEGFR3的mRNA可参见基因库登记号NM_002020.7和NM_182925.4。在一些实施方案中，分离核酸编码包含选自SEQIDNO:4和5的氨基酸序列的VEGFR的细胞外部分。在一些实施方案中，分离核酸编码包含与选自SEQIDNO:4和5的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VEGFR的细胞外部分。本文还提供编码多聚化结构域(例如，Fc区)的分离核酸。在一些实施方案中，分离核酸编码包含氨基酸序列SEQIDNO:6的多聚化结构域。在一些实施方案中，分离核酸编码包含与选自SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的多聚化结构域。

还提供编码如本文公开的融合蛋白的分离核酸。在一些实施方案中，分离核酸编码包含选自SEQIDNO:12-15的氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方案中，分离核酸编码包含选自SEQIDNO:9-11的氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方案中，分离核酸编码包含与选自SEQIDNO:12-15的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方案中，分离核酸编码包含与选自SEQIDNO:9-11的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方案中，编码融合蛋白的分离核酸包含选自SEQIDNO:21-24的核酸序列。在一些实施方案中，编码融合蛋白的分离核酸包含选自SEQIDNO:18-20的核酸序列。

编码融合蛋白或融合蛋白的组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分或多聚化结构域)的分离核酸序列可进一步包含编码接头的核酸序列。在一些实施方案中，核酸编码选自下组的接头：Gly₉(SEQIDNO:47)、Glu₉(SEQIDNO:48)、Ser₉(SEQIDNO:49)、Gly₅-Cys-Pro₂-Cys(SEQIDNO:50)、(Gly₄-Ser)₃(SEQIDNO:51)、Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:52)、Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:53),Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQIDNO:54)和Gly₉-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQIDNO:55)。

分离核酸可进一步包括编码信号肽的序列，该信号肽用作信号序列以从宿主细胞分泌融合蛋白。在一些实施方案中，分离核酸不包含编码信号肽的序列。

编码融合蛋白或融合蛋白的组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分或多聚化结构域)的分离核酸分子可呈RNA(例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式)形式或呈DNA(包括但不限于通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA)形式或其组合。DNA可为三链、双链或单链或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任一部分可为编码链，还称为有义链，或其可为非编码链，还称作反义链。分离核酸可从生物来源使用任一数目的那些本领域的技术人员已知的克隆方法获得。分离核酸还可通过直接化学合成通过已知方法制备。编码融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分或多聚化结构域)的核酸可通过多种本领域已知的方法(包括但不限于自天然来源分离或通过融合蛋白或融合蛋白组份的先前制备的变体或非变体型式的寡核苷酸介导的诱变、定点诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备)来制备。参见MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook等,第四版编辑,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,2012)andCurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel,等编辑,2003)。

载体

本发明涵盖核酸递送媒剂的用途，其用于将一个或多个编码融合蛋白或融合蛋白组份的核酸序列引入用于该蛋白的表达的细胞中。核酸递送媒剂的实例是脂质体、生物兼容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；和细菌、病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、黏粒、质粒、真菌载体和该技术中通常所用且已阐述用于表达于各种真核和原核宿主中的其他重组媒剂。在一些实施方案中，核酸递送媒剂是表达载体，例如质粒。载体可包括用以确立表达载体的惯用功能的任何元素，例如，启动子、核糖体结合元素、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可为组成型、可诱导型或可抑制型启动子。例示性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSVLTR、MoMLVLTR、磷酸甘油酸酯激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等,Gene,1991,108(2):193-9)和延长因子1-α启动子(EFl-α)启动子(Kim等,Gene,1990,91(2):217-23和Guo等,GeneTher.,1996,3(9):802-10)。本领域已知许多能够递送核酸至细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)的表达载体且在本文中可用于在细胞中产生融合蛋白或融合蛋白组份。举例而言，大肠杆菌若经质粒(例如pBR322)转化、修饰以包含编码融合蛋白的核酸，则可用于产生融合蛋白(Mandel等,J.Mol.Biol.,1970,53:154)。所表达融合蛋白或融合蛋白组份可从细胞收获且根据本领域已知且如本文中所述的惯用技术纯化。

宿主细胞

本文提供包含编码本文所述融合蛋白的核酸的宿主细胞。可通过本领域已知的任何方式向靶细胞提供编码融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)的核酸。在一些实施方案中，编码目标蛋白(例如，融合蛋白)的核酸在病毒载体中且已经包装载体，随后病毒体可用于感染细胞。在一些实施方案中，编码目标蛋白(例如，融合蛋白)的核酸在表达载体(例如质粒)中。适于特定细胞的转染或转化程序可用于将编码目标蛋白(例如，融合蛋白)的核酸引入靶细胞中。利用聚合物、脂质体或纳米球的配制物可用于递送编码目标蛋白(例如，融合蛋白)的核酸。可根据本发明的重组构建体转化或转染的细胞可以是对于那些本领域的技术人员方便的任一种。可使用的例示性细胞类型包括细菌、酵母、真菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞。可使用的例示性哺乳动物细胞包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、干细胞、造血细胞、上皮细胞、肌细胞、神经元细胞和角化细胞。可使用的其他例示性哺乳动物细胞包括但不限于COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、293细胞、NSO细胞、SP20细胞、3T3成纤维细胞、W138细胞、BHK细胞、HEPG2细胞、DUX细胞和MDCK细胞。这些细胞可用于产生并收获目标蛋白。在一些实施方案中，可向细胞或哺乳动物宿主提供转化或转染细胞。适于递送至细胞或哺乳动物宿主的细胞包括来自任何器官、肿瘤或细胞系的任何哺乳动物细胞类型。举例而言，可使用人、鼠类、山羊、绵羊、牛、狗、猫和猪细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在又一实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。

术语“宿主细胞”包括已经是或可以是本发明的载体的接受者和其子代的细胞。由于天然、意外或故意突变，子代可不必与初始亲代细胞完全相同(在形态学方面或在总DNA补体的基因组方面)。宿主细胞优选是真核细胞、优选哺乳动物细胞、最优选为人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在又一实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。

V.产生融合蛋白和融合蛋白组份的方法

本文提供产生如本文公开的本发明的融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)的方法。在一些方面中，提供产生如本文公开的任何融合蛋白的方法，其包括在产生融合蛋白的条件下培养包含编码本文公开的任何融合蛋白的核酸的宿主细胞和回收由宿主细胞产生的融合蛋白。在一些实施方案中，编码融合蛋白的核酸选自SEQIDNO:18-24。

(1)温育宿主细胞

使产生本发明的融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)所用的细胞在本领域已知且适于所选宿主细胞培养的培养基中生长。合适的培养基的实施例包括Ham'sFlO(Sigma)、最小必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI1640(Sigma)、Dulbecco's改良Eagle's培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)(DMEM,Sigma)和LuriaBroth(LB)。另外，以下文章中所述的任何培养基可作为培养基用于细胞：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号或第5,122,469号；WIPO公开案第WO90/03430号、第WO87/00195号；或美国专利Re.30,985。若需要，给定培养基通常补充有激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、DHFR、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素、痕量元素和葡萄糖或等效能源。还可包括那些本领域的技术人员会知晓的适当浓度的任何其他必需补充剂。培养条件(例如温度、pH等)是先前与选择用于表达的细胞一起使用的那些，且将为那些本领域的技术人员已知。对于大肠杆菌生长而言，例如，优选温度在约20℃至约39℃、更佳约25℃至约37℃，甚至更佳在约30℃。培养基的pH可为约5至约9的任何pH，主要取决于宿主有机体。对于大肠杆菌而言，pH优选约6.8至约7.4，且更优选约7.0。若在表达载体中使用可诱导型启动子，则在适于激活启动子的条件下诱导蛋白表达。举例而言，若PhoA启动子用于控制转录，则可在用于诱导的磷酸盐限制培养基中培养转化的宿主细胞。根据所用载体构建体，可使用多种其他诱导剂，如本领域已知。

(2)融合蛋白或融合蛋白组份的纯化

在使用重组技术时，本文所述融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)可在细胞内、在壁膜间隙中产生，或直接分泌至培养基中。若多肽在细胞内产生，则作为第一步骤，蛋白回收通常包括通常通过如渗透冲击、超音波处理或溶解等方式使细胞破碎。在细胞破碎后，通过例如离心或超滤去除宿主细胞或经溶解片段的颗粒碎屑。若多肽分泌至培养基中，则通常首先使用市场有售的蛋白浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)过滤并浓缩来自这些表达系统的上清液。在任一前述步骤中可包括如PMSF等蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外来污染物生长。

从这些细胞制备的融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)的组合物可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化。在一些实施方案中，蛋白A或蛋白G用作亲和配体用于亲和层析中。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于存于融合蛋白中的任何免疫球蛋白Fc区的物种和同种型(Lindmarketal.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)。在一些实施方案中，蛋白A作为亲和配体用于分离和纯化如本文所述融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)。在一些实施方案中，蛋白G作为亲和配体用于分离和纯化如本文所述融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)。亲和配体所附着的基质最经常为琼脂糖，但可使用其他基质。机械上稳定的基质(例如定孔玻璃(controlledporeglass)或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯)使得可允许相比使用琼脂糖获得更快的流速和更短的处理时间。取决于回收的融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)，还可使用其他蛋白纯化技术，例如在离子交换管柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅、肝素、SEPHAROSE^TM、或阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸管柱)上层析、以及层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在一些实施方案中，回收的融合蛋白是基本上纯的。在又一实施方案中，所回收融合蛋白至少是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯的任一种。在任一个或多个初步纯化步骤后，可使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液对包含目标融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)和污染物的混合物实施低pH疏水相互作用层析，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)实施。

一般而言，制备用于研究、测试和临床应用中的融合蛋白或融合蛋白组份(例如，PDGFR的细胞外部分、VEGFR的细胞外部分和/或多聚化结构域)的各种方法已在本领域充分确立，与上述方法一致和/或如由那些本领域的技术人员认为适用于特定目标融合蛋白或融合蛋白组份。

(3)融合蛋白或融合蛋白组份的生物活性

蛋白可使用常用已知方法纯化并鉴别，所述方法例如在免疫亲和力或离子交换管柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅上或阳离子交换树脂(例如DEAE)上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用(例如)SephadexG-75凝胶过滤；疏水性亲和力树脂、使用固定于基质上的合适的结合配偶体的配体亲和力、离心、ELISA、BIACore、蛋白免疫印迹分析、氨基酸和核酸测序和生物活性。

可表征或评定本文公开的融合蛋白或融合蛋白组份的生物活性，包括但不限于与靶结合配偶体(例如，PDGF和/或VEGF家族蛋白)的亲和力、竞争性结合(例如，阻断与PDGFR或VEGFR的靶结合的配偶体)、抑制活性(例如，抑制PDGF或VEGF途径激活)、抑制细胞增殖、抑制肿瘤生长和抑制血管生成(例如，脉络膜新生血管形成)。在一些实施方案中，可评定本文公开的融合蛋白或融合蛋白组份的体内或体外生物活性。在本文所述的任何分析中，分析于4℃、20℃至28℃(例如，25℃)或37℃的温度实施。

可评定本文公开的融合蛋白或融合蛋白组份与结合配偶体(例如PDGF家族蛋白(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C或PDGF-D)、PDGF家族蛋白的二聚体(例如，PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC或PDGF-DD)或VEGF家族蛋白(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PlGF))的亲和力。许多评定结合亲和力的方法已为本领域所知且可用于鉴别融合蛋白或融合蛋白组份与结合配偶体的结合亲和力。结合亲和力可表示为裂解常数(Kd)值或半最大有效浓度(EC50)值。用于测定结合亲和力(例如，Kd值)的技术已为本领域所熟知，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)和BIAcore。参见HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,CSHPublications,NY(1988)；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,(2009)；Altschuh等,Biochem.,31:6298(1992)；和由PharmaciaBiosensor公开的BIAcore方法，所有所述方法都以提述并入本文。举例而言，可使用ELISA测定融合蛋白与结合配偶体的结合亲和力。在一些实施方案中，使用ELISA分析融合蛋白与PDGF-BB的结合。在此例示性分析中，将所分泌融合蛋白连续稀释，与20pM最终浓度的人PDGFBB配体混合并于室温在回转式振荡器平台上温育过夜。温育后，通过人PDGF特异性ELISA(HumanPDGF-BBDuoSet产品编号DY220,R&DSystems)测量未结合PDGF-BB的量。使用Prism5.0d(GraphPadSoftware公司)分析结合亲和力的统计显著性且使用2因子ANOVA检验进行计算，随后Bonferroni校正。在又一实施例中，使用ELISA分析融合蛋白与VEGF家族蛋白的结合。在例示性分析中，将所分泌融合蛋白连续稀释，与20pM最终浓度的人VEGF混合并于室温下在回转式振荡器平台上温育过夜。随后通过人VEGF特异性ELISA(HumanVEGFQuantikineELISA试剂盒目录编号DVE00,R&DSystems)测量未结合VEGF的量。

在本文所述任何实施方案中的中，融合蛋白对于抑制活性(例如，抑制PDGF活性和/或VEGF活性)的EC50为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10^-8M或更小，例如，10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。在本文所述任何实施方案中，融合蛋白对于结合配偶体(例如，PDGF和/或VEGF)的Kd为约小于以下的任何值：约1.0mM、500μM、100μM、50μM、25μM、10μM、5μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、95nM、90nM、85nM、80nM、75nM、70nM、65nM、60nM、55nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、5pM、4pM或3pM，包括所述值，包括介于这些数值间的任何值。在一些实施方案中，与本文所述野生型融合蛋白的结合相比，本文所述融合蛋白变体以较高亲和力结合至结合配偶体。在一些方面中，与结合配偶体由包含选自SEQIDNO:9-15的氨基酸序列的融合蛋白的结合相比，融合蛋白变体以10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10,000(包括所述值，包括介于这些数值间的任一值)倍亲和力中的至少任一种结合至结合配偶体。

在一些实施方案中，可评定本文公开的融合蛋白的抗增殖活性(例如减少细胞增殖)。本领域已知许多用于评定融合蛋白的抗增殖性质的方法。在一个例示性分析中，可使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以证实VEGF依赖性和/或PDGF依赖性细胞增殖由本文所述融合蛋白的抑制。在此分析中，在VEGF和/或PDGF存在下将融合蛋白施加至HUVEC并测量细胞增殖。举例而言，将HUVEC(HUVEC-CambrexBioScienceWalkersville,Inc)以2,000个细胞/孔的密度接种于补充有5％胎牛血清(Invitrogen)的培养基199(Invitrogen)中的96孔板中并沉降过夜。在温育后，将培养基更换为补充有5％胎牛血清(Invitrogen)培养基199(Invitrogen)，以100μl/孔的最终体积含有相等体积(5μl)收获细胞培养物和最终浓度为10ng/ml的仅重组hVEGF-165配体(R&DSystems目录编号293-VE)或与最终浓度为20ng/ml的PDGF-BB配体(R&DSystems目录编号220-BB)组合的。将细胞于37℃下在5％CO₂中温育三至四天。以20μl/孔添加CellTiter96AQ_ueousOneSolutionReagent(PromegaCat#G3580)且4小时后取490nm的吸光率以测定通过融合蛋白的细胞增殖抑制。在一些实施方案中，使用本领域熟知的技术测量融合蛋白的抗血管生成性质。在例示性分析中，使用湿型年龄相关性黄斑变性的动物模型分析眼中新生血管形成通过融合蛋白的抑制。在该分析中，在第0研究天用向左眼(OS)中单一玻璃体内注射融合蛋白或包含编码融合蛋白的核酸的rAAV颗粒处理正常成年小鼠的眼，而右眼(OD)未经处理。在第28研究天在双眼中使用激光(例如，每只眼放置3个烧伤，200mW功率，50μm斑点，100ms)诱导CNV。对小鼠灌注FITC-葡聚糖并在第42研究天安乐死。采集眼，固定于10％中性缓冲福尔马林(formalin)中且随后制备脉络膜铺片以检查新生血管形成的程度。与对侧(OD)眼比较经处理(OS)眼中无CNV的烧伤的数目以测定融合蛋白的效力。例如，参见实施例5。

VI.病毒颗粒和产生病毒颗粒的方法

本文还提供包含编码本文所述融合蛋白的核酸的病毒颗粒。病毒载体可用于递送编码融合蛋白或融合蛋白组份的核酸用于表达特定靶组织(例如，患病组织)内的靶细胞中的蛋白。已知许多病毒物种，且出于递送核酸至靶细胞的目的已对许多病毒进行研究。可将外源性核酸插入载体(例如腺病毒、部分缺失腺病毒、完全缺失腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒等)用于递送至细胞。在一些实施方案中，细胞在个体中且病毒经由静脉内、肌内、门静脉内或其他施用路径递送。最常用病毒载体包括衍生自腺病毒、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒(包括慢病毒，例如人免疫缺陷性病毒(HIV))的那些。对于例示性病毒载体而言，参见美国专利第7,928,072号和WO2006/113277，两个案件的全文都以提述并入本文。

在一些实施方案中，病毒颗粒是包含含有一或两个AAVITR的核酸和编码本文所述融合蛋白且侧接一或两个ITR的序列的重组AAV颗粒。核酸在AAV颗粒中衣壳化。AAV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，核酸包含在转录方向上以可操作方式连接的组份、包括转录起始和终止序列的控制序列和目标蛋白编码序列(例如，编码融合蛋白的核酸)。这些组份在5'和3'末端旁侧为功能AAVITR序列。“功能AAVITR序列”意为ITR序列按预期用于AAV病毒体的复苏(rescue)、复制和包装的功能。参见Davidson等,PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等,J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan等,GeneTher.,2009,16:10-16，所有全文都以提述并入本文。对于实践本发明的一些方面，重组载体包含衣壳化必需的AAV的至少所有序列和物理结构用于通过rAAV感染。用于本发明载体中的AAVITR无需具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.GeneTher.,1994,5:793-801中所述)，且可通过核苷酸的插入、缺失或取代改变或AAVITR可衍生自若干AAV血清型中的任一种。当前已知AAV的40种以上血清型，且继续鉴别新血清型和现存血清型的变体。参见Gao等,PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等,PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis等,J.Virol.,2003,77(12):6799-810。认为任何AAV血清型的使用都在本发明范围内。在一些实施方案中，rAAV载体是衍生自AAV血清型(包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R、AAVrh.10、AAV11或AAV12)的载体。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R、AAVrh.10、AAV11或AAV12的ITR。在一些实施方案中，选自SEQIDNO:12-15的编码融合蛋白的核酸旁侧为至少一个AAVITR。在一些实施方案中，核酸选自SEQIDNO:21-24。在其他实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R、AAVrh.10、AAV11或AAV12的衣壳蛋白。在其他实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白(Gao,等J.Virol.2004,78(12):6381)。

使用不同AAV血清型以优化特定靶细胞的转导或靶向特定靶组织(例如，患病组织)内的特定细胞类型。rAAV颗粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。举例而言，rAAV颗粒可包含AAV2衣壳蛋白和至少一个AAV2ITR或其可包含AAV2衣壳蛋白和至少一个AAV1ITR。在另一实例中，rAAV颗粒可包含AAV1衣壳蛋白和至少一个AAV2ITR。在再一实例中，rAAV颗粒可包含AAV1和AAV2二者的衣壳蛋白，且进一步包含至少一个AAV2ITR。本文提供用于产生rAAV颗粒的AAV血清型的任一组合，如同本文已明确说明每一组合一般。

在一些方面中，本发明提供包含重组自身互补基因组的病毒颗粒。具有自身互补基因组的AAV病毒颗粒和使用自身互补AAV基因组的方法阐述于美国专利第6,596,535号、第7,125,717号、第7,765,583号、第7,785,888号、第7,790,154号、第7,846,729号、第8,093,054号和第8,361,457号；和WangZ.,等,(2003)GeneTher10:2105-2111中，其全文各自以提述并入本文。包含自身互补基因组的rAAV通过其部分互补序列(例如，转基因的互补编码和非编码链)将快速形成双链DNA分子。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV基因组的AAV病毒颗粒，其中rAAV基因组包含第一异源多核苷酸序列(例如，融合蛋白编码链)和第二异源多核苷酸序列(例如，融合蛋白非编码或反义链)，其中第一异源多核苷酸序列可与第二多核苷酸序列沿其大部分或所有长度形成链内碱基对。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列由促进链内碱基配对的序列连接；例如，发夹DNA结构。发夹结构为本领域已知，例如在siRNA分子中。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列由突变ITR(例如右侧ITR)连接。在一些实施方案中，ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQIDNO:41)。突变ITR包含含有末端解析序列的D区的缺失。因此，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白在突变ITR处不会裂解病毒基因组，且因此以5’至3’次序包含以下的重组病毒基因组将包装于病毒衣壳中：AAVITR、包括调控序列的第一异源多核苷酸序列、突变AAVITR、与第一异源多核苷酸呈相反定向的第二异源多核苷酸和第三AAVITR。在一些实施方案中，本发明提供包含重组病毒基因组的AAV病毒颗粒，该重组病毒基因组包含功能AAV2ITR、编码融合蛋白的第一多核苷酸序列、包含D区的缺失并且缺少功能末端解析序列的突变AAV2ITR、包含与编码第一多核苷酸序列和功能AAV2ITR的融合蛋白的序列互补的序列的第二多核苷酸序列。

rAAV颗粒可使用本领域已知的方法产生。例如，参见美国专利第6,566,118号、第6,989,264号、第6,995,006号。在实践本发明中，用于产生rAAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞还可为包装细胞(其中AAVrep和cap基因稳定维持于宿主细胞中)或生产细胞(其中稳定维持AAV载体基因组)。例示性包装和生产细胞衍生自293、A549或HeLa细胞。AAV载体使用本领域已知的标准技术纯化并调配。

在一些方面中，提供产生如本文所公开rAAV颗粒的方法，其包括：(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含(i)一个或多个AAV包装基因，其中该AAV包装基因各自编码AAV复制或衣壳化蛋白；(ii)包含编码本文公开的任何融合蛋白且旁侧为至少一个AAVITR的核酸的rAAV前载体，和(iii)AAV辅助功能；和(b)回收由宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，核酸编码选自SEQIDNO:12-15的融合蛋白。在一些实施方案中，该至少一个AAVITR选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R和AAVrh.10ITR。在一些实施方案中，该衣壳化蛋白选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12衣壳蛋白及其类似物。在其他实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV9衣壳和包含AAV2ITR、突变体AAV2ITR和编码融合蛋白的转基因的重组自身互补基因组。在又一实施方案中，rAAV颗粒是纯化的。本文所用术语“纯化”包括不含至少一些还可存在于其中rAAV颗粒天然存在或初始从中制得之处的其他组份的rAAV颗粒的制备。因此，例如，分离rAAV颗粒可使用纯化技术制备以将其自来源混合物(例如培养裂解物或生产培养上清液)制备。富集可以多种方式、例如通过溶液中存在的DNase抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的比例或通过感染性测量，或其可相对来源混合物(例如污染物，包括制造培养污染物或过程中污染物，包括辅助病毒、培养基组份和诸如此类)中存在的第二潜在干扰物质测量。

本文还提供包含含有编码本发明的融合蛋白的核酸的rAAV颗粒和药物上可接受的载剂的药物组合物。药物组合物可适于本文所述多种施用模式，包括(例如)全身或局部施用。包含编码本文所述融合蛋白的核酸的rAAV的药物组合物可(例如)通过静脉内注射、通过导管(参见美国专利第5,328,470号)或通过立体定位注射(Chen等,1994,PNAS,91:3054-3057)全身引入。药物组合物可呈滴眼剂、可注射溶液形式或呈适于吸入或口服施用的形式。在一些实施方案中，包含本文所述rAAV和药物上可接受的载剂的药物组合物适于施用人。在一些实施方案中，包含本文所述rAAV和药物上可接受的载剂的药物组合物适于玻璃体内注射或局部施用至眼。这些药物上可接受的载剂可为无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，例如花生油、大豆油、矿物油等等。还可采用盐水溶液和水性右旋糖、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液作为液体载剂、具体而言用于可注射溶液。药物组合物可进一步包含其他成份，例如防腐剂、缓冲液、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非毒性润湿剂或澄清剂、黏度增加剂等等。本文所述药物组合物可包装成单一单位剂量或呈多剂量形式。组合物通常调配为无菌且实质上等渗的溶液。组合物还可调配以具有与眼和眼部组织的房水兼容的渗透值。所述渗透值通常可在约200至约400mOsm/kg，但优选可为约300mOsm/kg。可用于储存和/或递送表达载体或病毒载体的眼部溶液已公开于例如WO03077796A2中。

VII.使用融合蛋白和病毒颗粒的处理方法

本发明的方法使用本文公开的任何融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白结合PDGF蛋白或VEGF蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白结合PDGFR蛋白和VEGFR蛋白。本文所述融合蛋白可具有以下特性中的一种或多种：(a)结合PDGF家族中的一种或多种蛋白，例如PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C或PDGF-D；(b)结合VEGF家族中的一种或多种蛋白，例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PIGF；(c)阻断PDGF家族蛋白与PDGF受体结合；(d)阻断VEGF家族蛋白与VEGF受体结合；(e)抑制PDGF信号通路和/或VEGF信号通路的激活；(f)治疗和/或预防如眼部疾病、自体免疫疾病、炎性疾病或癌症等疾病。融合蛋白的活性可在体外和/或体内测量。

本发明提供通过向个体施用有效的量的本文所述任何融合蛋白治疗疾病(例如眼部疾病、炎性疾病、自体免疫疾病或癌症)的方法。在一些实施方案中，治疗疾病的方法包含向个体施用有效的量的包含融合蛋白的组合物。在一些实施方案中，治疗疾病的方法包含向个体施用有效的量的包含编码融合蛋白的核酸的rAAV。还提供通过向个体施用有效的量的本文所述任何融合蛋白治疗或预防疾病(例如眼部疾病、炎性疾病、自体免疫疾病或癌症)的一个或多个方面或症状的方法。在一些实施方案中，治疗或预防疾病的一个或多个方面或症状的方法包含向个体施用有效的量的包含融合蛋白的组合物。在一些实施方案中，治疗或预防疾病的一个或多个方面或症状的方法包含向个体施用有效的量的包含编码融合蛋白的核酸的rAAV。

本文所述方法可用于治疗多种疾病，包括但不限于炎性疾病、眼部疾病、自体免疫疾病或癌症。在一些实施方案中，欲治疗的疾病包括但不限于类风湿性关节炎、炎性关节炎、骨关节炎、癌症、年龄相关性黄斑变性(AMD)(例如湿型AMD或干型AMD)、特征在于新生血管形成(例如脉络膜新生血管形成)的眼部疾病、葡萄膜炎(例如前葡萄膜炎或后葡萄膜炎)、色素性视网膜炎和糖尿病性视网膜病变。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗自体免疫疾病。在一些实施方案中，自体免疫疾病是类风湿性关节炎、多发性硬化症或全身性红斑狼疮。类风湿性关节炎(RA)是导致关节发炎的慢性自体免疫疾病。尽管RA主要影响滑膜关节，但其可影响周围组织和器官。RA的病理学涉及可导致软骨破坏和关节的关节强直(融合)的发炎过程。RA的其他病理表达包括血管炎(血管发炎)，其可影响几乎任何器官系统且可引起其他并发症，包括多神经病、皮肤溃疡和内脏梗塞。胸膜肺表现包括胸膜炎、间质性纤维化、卡普兰综合征(Caplan’ssyndrome)、胸膜肺结节、肺炎、类风湿肺病和动脉炎。其他表现包括多种关节周结构(例如伸面)上以及胸膜和脑膜上的炎性类风湿性结节的发生。骨骼肌无力和萎缩是常见的。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗炎性疾病。在一些实施方案中，炎性疾病是炎性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、慢性发炎、刺激性肠疾病、肺发炎或哮喘。炎性关节炎指可由自体免疫疾病(例如，强直性脊柱炎、幼年型特发性关节炎、混合型结缔组织病、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、硬皮病、薛格连氏综合征(Sjogren’sSyndrome)、斯蒂尔病(Still’sDisease)和全身性红斑狼疮)引起的关节发炎。炎性关节炎还可由某些类型的细菌(例如对于反应性关节炎)或由关节中的晶体结构的沉积物(例如对于痛风和假痛风)引起。炎性关节炎的特征性症状是一个或多个关节疼痛和肿胀，该关节可较其他关节温暖。长期不活动后关节僵硬(例如在早上或在长时间静坐后)是极为常见症状。患有炎性关节炎的患者通常具有多个关节病状。骨关节炎(还称作退行性关节炎或退行性关节病)是一组涉及关节(包括关节软骨和软骨下骨)退化的机械异常。症状可包括关节疼痛、压痛、僵硬、锁住和有时积液(即，存在增加的关节内流体)。多种病因(例如，遗传性、发育性、代谢性、肥胖症有关和机械病因)可起始导致软骨损失的过程。随着软骨的分解产物释放至滑液空间中，位于关节之下的细胞(cellsliningthejoint)试图将其移除。新的骨生长物或“骨刺”可形成。经常，在骨由软骨保护的不那么充分时，骨可暴露且受损。这些骨变化以及关节发炎引起疼痛。由于继发于疼痛的减少运动，区域肌肉可萎缩，且韧带可变得更松弛。

持续性失调血管生成发生在多种疾病状态(例如癌症)中。在癌症中，细胞不受控地分化且生长，从而形成恶性肿瘤，其血管化并侵入身体的附近部分。癌症还可经由淋巴系统或血流扩散(转移)至更远的身体部分。癌症的病因可为环境(由于暴露于化学物质、辐射或由于生活方式)、遗传性或感染性。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌、乳癌、肺癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、尿道癌(例如，膀胱癌)、肾癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、淋巴或骨髓谱系的造血性癌症、头颈癌、鼻咽癌(NPC)、神经胶母细胞瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、腺癌、间质起源的癌(例如纤维肉瘤或横纹肌肉瘤)、软组织肉瘤和癌、绒毛膜癌、肝母细胞瘤、卡波西氏肉瘤(Karposi'ssarcoma)或威姆氏肿瘤(WiIm'stumor)。

可用本文公开的方法和组合物治疗与血管生成相关的其他疾病。这些疾病包括动脉粥样硬化、晶状体后纤维增生症、甲状腺增生(包括格雷弗氏病(grave'sdisease))、肾病综合征、子癫前症(preclampasia)、腹水、心包积液(例如与心包炎相关)和胸腔积液。

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗眼部疾病。在一些实施方案中，眼部疾病是AMD(例如湿型AMD或干型AMD)、葡萄膜炎、色素性视网膜炎、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变和涉及局部发炎过程的其他眼病。在一些实施方案中，眼部疾病的特征在于新生血管形成，例如脉络膜新生血管形成。在一些实施方案中，眼部疾病是角膜移植的结果。在一些实施方案中，本发明提供治疗或预防眼部疾病的一个或多个方面或症状(包括但不限于形成眼玻璃膜疣、眼或眼组织中发炎和损失视力)的方法。在某些实施方案中，本文所述组合物和方法可用于检测和/或治疗葡萄膜炎，即葡萄膜(即巩膜下方眼的中间层)发炎。在美国，估计葡萄膜炎导致约10％-20％失明。葡萄膜传统上分成3个区域，自前至后为虹膜、睫状体和脉络膜。葡萄膜的首要功能是营养和气体交换、光吸收和由睫状突分泌房水。葡萄膜炎通常与暴露于毒素、感染和/或自体免疫病症相关。然而，在许多情况中，病因未知。葡萄膜炎可影响一只或两只眼。症状可快速发展且可包括视力模糊、视野中的浮动暗点、眼睛疼痛、眼睛发红和对光敏感。葡萄膜炎的最常见形式是前葡萄膜炎或虹膜炎，其涉及虹膜发炎。睫状体平坦部炎是指眼睛中间、即介于虹膜与脉络膜间的葡萄膜发炎。后葡萄膜炎影响眼睛后部，即，脉络膜。与后葡萄膜炎相关的发炎还可影响视网膜(视网膜炎)或眼睛后部的血管(血管炎)。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗色素性视网膜炎(RP)。RP是由视网膜的光感受器(视杆细胞和视锥细胞)或视网膜色素上皮异常引起的可遗传眼病。该疾病可导致进行性视力损失且经常导致失明。RP的症状包括在晚上或低光中视力降低、侧(周边)视力损失和在晚期情形中中央视力损失。RP的诊断取决于经由视野测试和视网膜电描记术的光感受器细胞功能的进行性损失的文件记载。已知至少35个遗传位点会引起“非综合征性色素性视网膜炎”(即，并非另一疾病的结果或较宽综合征的部分的RP)。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗糖尿病性视网膜病变。糖尿病性视网膜病变指由糖尿病的并发症引起的视网膜的损害。具体而言，血管壁因高血糖症受损，从而改变血液-视网膜屏障的形成并使得视网膜血管更具渗透性。受损血管使流体和脂质渗漏至黄斑中，从而引起黄斑肿胀(即，黄斑水肿)，使得视力模糊。随着疾病进展，其进入增殖阶段，其中血管沿视网膜并在填充眼睛的玻璃体液中生长。这些血管可流血、使视力模糊且例如破坏视网膜、引起视网膜脱落或引起新生血管性青光眼。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)。AMD的特征在于中央视力进行性损失，这是由于称为黄斑的视网膜的区域中的光感受器细胞的损害而发生。AMD已广泛地分成两种临床状态：湿式形式和干式形式，其中干式形式占总病例的80-90％。干型AMD的特征在于形成黄斑玻璃膜疣，即在眼的布鲁赫氏膜(Bruch'smembrane)与视网膜色素上皮间累积的细胞外物质的微黄色或白色累积物。湿型AMD占严重视力损失的约90％，其与新生血管形成(其中血管自视网膜下方的脉络膜生长)和这些新血管的泄漏相关。血液和流体的累积可引起视网膜脱离，随后快速光感受器变性和呈任一形式的AMD的视力损失。人们普遍认为，湿式形式的AMD在干式形式后进行且由干式形式产生。

本文提供递送有效的量的融合蛋白至受试者的方法。融合蛋白可在组合物中递送至受试者。融合蛋白还可通过包含编码融合蛋白的核酸的rAAV递送至受试者。本文涵盖包含融合蛋白的组合物或包含编码融合蛋白的核酸的rAAV。

本文所述组合物可经由任一路径施用受试者，该路径包括但不限于静脉内(例如，通过输注泵)、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口服、吸入、囊泡内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经皮、经胸膜、动脉内、局部、吸入(例如，以喷雾形式)、黏膜(例如经由鼻黏膜)、皮下、经皮、胃肠道、关节内、脑池内、心室内、颅内、尿道内、肝内和瘤内。在一些实施方案中，组合物在血管内(例如静脉内(IV)或动脉内)施用。在一些实施方案中，组合物直接施用至动脉内。在一些实施方案中，组合物全身(例如通过静脉内注射)施用。在一些实施方案中，组合物局部(例如通过动脉内或眼内注射)施用。

在一些实施方案中，组合物直接施用眼或眼组织。在一些实施方案中，组合物以(例如)滴眼剂局部施用眼。在一些实施方案中，组合物通过注射至眼(眼内注射)或与眼相关的组织施用。组合物可通过(例如)眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下注射、特农囊下注射、眼球后注射、眼球周注射或球周巩膜后递送来施用。这些方法已为本领域已知。举例而言，对于视网膜药物递送的例示性眼周路径的说明，参见Raghava等,ExpertOpin.DrugDeliv.,2004,1(1):99-114。组合物可施用至例如玻璃体、房水、巩膜、结膜、巩膜与结膜间的区域、视网膜脉络膜组织、黄斑或受试者眼中或靠近眼的其他区域。组合物还可以植入体形式施用至受试者。优选植入体是生物相容和/或生物可降解的持续释放配制物，其在一段时间内逐渐释放化合物。药物递送的眼部植入体已为本领域熟知。例如，参见美国专利第5,501,856号、第5,476,511号和第6,331,313号。组合物还可使用电离子透入法(包括但不限于美国专利第4,454,151号和美国专利申请公开案第2003/0181531号和第2004/0058313号中所述的电离子透入方法)施用至受试者。

组合物的最佳有效的量可按经验确定且将取决于疾病的类型和严重程度、施用路径、疾病进展和个体的健康状况、质量和身体区域。所述确定为本领域的技术人员已知。举例而言，在眼内施用时，可以DNAse颗粒抗性(drp)效价为约10⁴至约10¹⁴drp/剂量向个体施用一定量的包含编码本文所述融合蛋白的核酸的rAAV。在一些实施方案中，可以约10⁵至约10¹³、约10⁶至约10¹²、约10⁷至约10¹¹、约10⁸至约10¹⁰、约10⁹至约10¹⁰、约10¹⁰至约10¹¹或约10¹¹至约10¹²drp/剂量向个体施用一定量的包含编码融合蛋白的核酸的rAAV。

包含融合蛋白的组合物可以单一日剂量施用，或总日剂量可以每日两次、三次或四次的分开剂量施用。包含融合蛋白的组合物还可一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、一月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次、每九个月一次或每年一次施用。包含含有编码融合蛋白的核酸的rAAV的组合物可施用得较不频繁，例如，每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每年一次。在一些实施方案中，包含含有编码本文所述融合蛋白的核酸的rAAV的组合物的单一剂量每年施用一次。组合物还可于持续释放配制物中例如于植入体中施用，该植入体在一段时间内逐渐释放化合物以使用，且允许较不频繁地施用组合物，例如一月一次、每2-6个月一次、每年一次或甚至单一施用。持续释放装置(例如丸粒、纳米颗粒、颗粒、纳米球、微球体等等)可通过注射施用或手术植入于眼或与眼相关的组织中的不同位置中(例如眼内、玻璃体内、视网膜下、眼周、结膜下、或特农囊下(sub-Tenons))。

本发明组合物(例如融合蛋白或包含编码融合蛋白的核酸的rAAV)可单独或与一种或多种其他治疗剂组合使用。举例而言，本发明组合物可单独施用或与已知对年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜附着或受损视网膜组织具有有益效应的其他治疗剂组合施用。例示性治疗剂包括补体抑制剂、抗血管生成剂、抗VEGF试剂(包括但不限于Macugen(哌加他尼钠(pegaptanibsodium))、Eylea(VEGFTrap-Eye)和抗VEGF抗体(例如或)和抗PDGF试剂(例如Fostiva^TM)。本发明组合物可与显示有益于降低黄斑变性进展至晚期阶段的风险的营养补充剂(例如维生素C、维生素E、β胡萝卜素、锌氧化物和铜)组合施用。其他有用的辅因子包括减轻症状的辅因子，包括杀菌剂、抗生素、抗病毒和抗真菌剂和镇痛药和麻醉剂。在一些实施方案中，以同时施用形式提供组合，其中融合蛋白或包含编码融合蛋白的核酸的rAAV和至少一种治疗剂在相同组合物中一起施用或在不同组合物中同时施用。在一些实施方案中，以单独施用形式提供组合，其中融合蛋白或包含编码融合蛋白的核酸的rAAV的施用可在至少一种治疗剂的施用之前、同时和/或之后发生。顺序施用间间隔可按照至少(或可替换地小于)分钟、小时或天。

本文所述组合物还可结合其他AMD疗法(例如光动力疗法)使用。光动力疗法需要静脉内施用维速达尔(Visudyne，维替泊芳(verteporfin))，其后将特定波长的光施加至异常血管。光激活维速达尔并除去血管。或者，本文所述组合物可与激光疗法结合使用，此需要使用高能激光束以破坏黄斑下方的异常血管。

VIII.制品和试剂盒

还提供呈合适的包装的包含本文所述组合物(例如，融合蛋白或rAAV颗粒)的试剂盒或制品。适于本文所述组合物(例如眼用组合物)的包装已为本领域已知，且包括(例如)小瓶(例如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、柔性包装(例如，密封Mylar或塑料袋)等等。这些制品可进一步灭菌和/或密封。

本发明还提供包含本文所述组合物的试剂盒且可进一步包含关于使用组合物的方法(例如本文所述用途)的说明。本文所述试剂盒可进一步包括商业和用户角度期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和具有实施本文所述任何方法的说明的包装插页。举例而言，在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述融合蛋白/或编码本文所述融合蛋白的rAAV、适于眼内注射的药物上可接受的载剂和下列一种或多种：缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和具有实施眼内注射的说明的包装插页。

实施例

实施例1：sPDGFR-β/Fc融合蛋白的产生

PDGF-β受体(PDGFR-β)胞外域(ectodomain)含有5个自蛋白的N末端至C末端编号为1至5的细胞外结构域(ECD)。使用全长PDGFR-β胞外域以产生若干截短可溶性PDGFR-β(PDGFR-β)单体和二聚体蛋白(图1A)。

制备两种PDGFR-β单体构建体，其在全长PDGFR-β胞外域PDGFR(D1-D5)(SEQIDNO:7)的N末端或在含有前四个ECD的PDGFR-β胞外域PDGFR(D1-D4)(SEQIDNO:8)的N末端处含有PDGFR-β信号肽(SP)。三个PDGFR-β二聚体构建体通过将PDGFR-β胞外域(ECD)的所有五个、前三个或前三个结构域经由9个甘氨酸残基(9Gly)组成的肽接头融合至人免疫球蛋白G1重链片段(IgG1Fc)的N末端产生且分别称为PDGFR(D1-D5)9G-Fc(SEQIDNO:9)、PDGFR(D1-D3)9G-Fc(SEQIDNO:10)和PDGFR(D1-D2)9G-Fc(SEQIDNO:11)。类似于单体构建体，所有二聚体构建体都在融合全长或经截短PDGFR-β胞外域的N末端含有SP。对于PDGFR(D1-D2)9G-Fc的构建而言，使用质粒pCMV6-XL5-PDGFRB(目录编号SC309979；Origene,Rockville,MD)作为模板，并使用向模板中引入限制位点SpeI(PDGFRBPR6SpeIF:5’-GACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG(SEQIDNO:25)和AgeI(PDGFRBPR7AgeIR:5’-ACCGGTGGATGACACCTGGAGTCTG(SEQIDNO:26)的引物。在以下循环参数下实现PCR产物的扩增：50℃1个循环持续2min，95℃1个持续10min的循环，95℃40个持续15sec的循环，和60℃持续60sec。使用TOPOCloningKit(Invitrogen)将PCR产物插入pCR-BluntII-TOPO质粒中且通过测序来验证PCR产物插入物的序列，然后亚克隆至质粒pCMV/K-D2-9Gly-Fc(关于pCMV/K-D2-9Gly-Fc的说明，参见PechanP.,等GeneTher.(2009),16:10-16)的SpeI和AgeI位点中，以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的PDGFR(D1-D2)9G-Fc(SEQIDNO:20)的开放阅读框的质粒pCMV-PDGFR-S-(D1-D2)-9Gly-Fc。对于PDGFR(D1-D5)9G-Fc的构建而言，使用质粒pCMV6-XL5-PDGFRB(目录编号SC309979；Origene,Rockville,MD)作为模板，并使用向模板中引入限制位点AccI(PDGFRB-PR1-AccF：5’-CTATGTCTACAGACTCCAGGTGTC(SEQIDNO:27)和AgeI(D5-PR9-AgeI-RevR：5’-ACCGGTAAAGGGCAAGGAGTGTGGC(SEQIDNO:28)的引物。在以下循环参数下达成PCR产物的扩增：50℃1个持续2min的循环，95℃1个持续10min的循环，95℃40个持续15sec的循环，和60℃达60sec。随后使用TOPOCloningKit(Invitrogen)将PCR产物插入pCR-BluntII-TOPO质粒中并通过测序验证pTOPO-PDGFRB(D3-D5)中的PCR产物插入物的序列。将来自质粒pCMV-PDGFR-S-(D1-D2)-9Gly-Fc的622个碱基对(bp)SpeI-AccI片段插入质粒pTOPO-PDGFRB(D3-5)的SpeI和AccI位点中以生成质粒pTOPO-PDGFR(D1-D5)。随后将来自质粒pTOPO-PDGFR(D1-D5)的1,596bpSpeI-AgeI片段插入质粒pCMV-PDGFR-S-(D1-D2)-9Gly-Fc的SpeI和AgeI位点中以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的PDGFR(D1-D5)9G-Fc(SEQIDNO:18)的开放阅读框的质粒pCMV-PDGFR-(D1-D5)-9Gly-Fc。对于PDGFR(D1-D3)9G-Fc的构建，使用质粒pCMV-PDGFR(D1-5)9G-Fc作为模板，连同向模板中引入限制位点SpeI(PDGF02F：5’-CCTCCACCGGTGTAGCCGCTCTCAACCACGGT(SEQIDNO:29)和AgeI(PDGF03R：5’-CCCGGGACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG(SEQIDNO:30)的引物。在下列循环参数下实现PCR产物的扩增：95℃1个持续1min的循环，95℃35个持续30sec的循环，60℃持续30sec和72℃持续1min。将PCR产物插入质粒pCMV-PDGFR(D1-5)9G-Fc的SpeI和AgeI位点中以使PDGFR(D1-3)9G-Fc(SEQIDNO:19)的开放阅读框完整。对于PDGFR(D1-D5)的构建，将质粒pCMV-sPDGFR(D1-D5)-9G-Fc的5307bpAgeI-EagI片段连接至由寡核苷酸D5-SV40F：CCGGTTAGGGA(SEQIDNO:31)和D5-SV40B-2：GGCCTCCCTAA(SEQIDNO:32)组成的退火寡核苷酸片段，以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的PDGFR(D1-D5)(SEQIDNO:16)的开放阅读框的质粒pCMVPDGFRB(D1-D5)。对于PDGFR(D1-D4)的构建，将质粒pCMV-sPDGFR(D1-D5)-9G-Fc的4924bpBbvCI-EagI片段连接至由寡核苷酸D4-SV40F：TGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGTAGC(SEQIDNO:33)和D4-SV40B：GGCCGCTACTCCAGCACTCGGACAGGGACATTGATCTGTAGCTGGAAGGAGAGCTGGACC(SEQIDNO:34)组成的退火寡核苷酸片段，以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的PDGFR(D1-D4)(SEQIDNO:17)的开放阅读框的质粒pCMV-PDGFRB(D1-D4)。

成熟蛋白(不包括SP区)的预测分子量对于PDGFR(D1-D5)是56.2kDa且对于PDGFR(D1-D4)是43.6kDa。作为单体的成熟蛋白(不包括SP区)的预测分子量对于PDGFR(D1-D5)9G-Fc是82.7kDa，对于PDGFR(D1-D2)9G-Fc是46.7kDa，且对于PDGFR(D1-D3)9G-Fc是58.2kDa。编码这些蛋白构建体的质粒用于转染293细胞。转染后72小时收集细胞的培养基且使用粗条件培养基(CM)分析分泌PDGFR(D1-D5)、PDGFR(D1-D4)、PDGFR(D1-D5)9G-Fc、PDGFR(D1-D2)9G-Fc和PDGFR(D1-D3)9G-Fc蛋白。通过蛋白免疫印迹分析确认PDGFR(D1-D5)9G-Fc、PDGFR(D1-D2)9G-Fc和PDGFR(D1-D3)9G-Fc蛋白同源二聚体通过经其各别构建体转染的细胞的产生。简要地，将从细胞培养基纯化的分泌蛋白装载至还原或非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶中。还将从EGFP构建体转染的细胞的细胞培养基纯化的增强绿色荧光蛋白(EGFP)装载于凝胶上并用作对照。在SDS-PAGE凝胶(NuPAGENovex4-12％Bis-Tris,Invitrogen)上分离蛋白后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。用生物素化山羊抗人PDGFR-β抗体(R&DSystems)探测膜，随后用连接至辣根过氧化物酶(R&DSystems)的链霉抗生物素蛋白标记并在成像前用化学发光试剂(ThermoScientificPierce)显影。PDGFR(D1-D5)9G-Fc、PDGFR(D1-D2)9G-Fc和PDGFR(D1-D3)9G-Fc蛋白的迁移率在还原和非还原条件下改变，而PDGFR(D1-D5)和PDGFR(D1-D4)单体蛋白的迁移率保持未变，指示PDGFR-β/Fc融合蛋白形成同源二聚体(图1B)。

使用无细胞的体积PDGF结合分析系统测定PDGFBB配体与PDGFR-β单体和二聚体蛋白间的相对结合亲和力(图2)。对于PDGFR-β单体和二聚体蛋白的产生，将293细胞用编码PDGFR(D1-D5)、PDGFR(D1-D4)、PDGFR(D1-D5)9G-Fc、PDGFR(D1-D2)9G-Fc或PDGFR(D1-D3)9G-Fc蛋白的质粒转染且转染后72小时收获细胞培养基。在结合亲和力分析前通过ELISA和蛋白免疫印迹分析确认分泌PDGFR-β单体和二聚体蛋白的存在。将所分泌蛋白连续稀释，与人PDGFBB配体(20pM最终浓度)混合并于室温在回转式振荡器平台上温育过夜。随后通过人PDGF特异性ELISA(HumanPDGF-BBDuoSet产品编号DY220,R&DSystems)测量未结合PDGFBB的量。使用Prism5.0d(GraphPadSoftware公司)分析结合亲和力的统计显著性且使用2因子ANOVA测试进行计算，随后为Bonferroni校正。结合亲和力分析显示单体PDGFR(D1-D4)蛋白相比含有所有5个ECD的单体PDGFR(D1-D5)蛋白以显著(***P<0.001)较高的亲和力结合PDGF(图2A)。然而，用作PDGF结合的阳性对照的二聚体全长PDGFR(D1-D5)9G-Fc蛋白相比单体PDGFR(D1-D4)和PDGFR(D1-D5)二者是显著(***P<0.001)更好的PDGF结合剂(图2A)。在三种生成的二聚体IgG1Fc偶联PDGFR-β构建体中，具有前三个ECD的构建体PDGFR(D1-D3)9G-Fc较全尺寸PDGFR(D1-D5)9G-Fc蛋白是显著(***P<0.001)更好的PDGF结合剂，而具有前两个ECD的构建体PDGFR(D1-D2)9G-Fc不显示PDGF-结合亲和力(图2B)。

实施例2：杂合体VEGFR1/PDGFR-β和PDGFR-β/VEGFR-1蛋白的生成

Flt-1受体(VEGFR-1)胞外域含有7个从蛋白的N末端至C末端编号为1至7的细胞外结构域(ECD)。为阻断PDGFBB和VEGF配体二者，生成包含PDGFR-β和VEGFR1的ECD的融合蛋白且其称作杂合蛋白(图3)。

使用由连接至人免疫球蛋白G1重链片段(IgG1Fc)的人VEGFR1的ECD2组成的之前生成的VEGF-结合蛋白sFLT01以生成编码VEGFR1/PDGFR-β或PDGFR-β/VEGFR1杂合蛋白的DNA构建体。关于sFLT01蛋白的说明，参见PechanP.,等GeneTher.(2009),16:10-16，其全文以提述并入本文。通过将含有VEGFR1信号肽(SP)和VEGFR1ECD2的sFLT01的片段经由9个丝氨酸残基(9Ser)组成的肽接头连接至PDGFR-βECD1-5的N末端来构建VEGFR1/PDGFR-β杂合体1(SEQIDNO:12)，该9个丝氨酸残基经由9个甘氨酸残基(9Gly)组成的肽接头进一步连接至IgG1Fc。通过将PDGFR-βECD1-5和PDGFR-βSP经由9Ser肽接头连接至VEGFR1ECD2的N末端构建PDGFR-β/VEGFR1杂合体2(SEQIDNO:13)，该9Ser肽接头经由9Gly肽接头进一步连接至IgG1Fc。VEGFR1/PDGFR-β杂合体3(SEQIDNO:14)和PDGFR-β/VEGFR1杂合体4(SEQIDNO:15)分别与杂合体1和2类似地组成，除使用PDGFR-βECD1-3替代PDGFR-βECD1-5外。对于VEGFR1/PDGFR-β杂合体1的构建，将编码融合至包含9个丝氨酸(9Ser)接头(SEQIDNO:35)的VEGFR1结构域D2的VEGFR1信号肽的372bpSpeI-XhoI片段Kozak-SP-D2-9Ser插入质粒pTOPO-PDGFR(D1-D5)的SpeI和XhoI位点以生成质粒pTOPO-(D2-9Ser)-PDGFR(D1-D5)。将质粒pTOPO-(D2-9Ser)-PDGFR(D1-D5)的SpeI-AgeI片段插入质粒pCMV-PDGFR-(D1-D5)-9Gly-Fc的SpeI-AgeI位点以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的VEGFR1/PDGFR-β杂合体1(SEQIDNO:21)的开放阅读框的pCMV-F(D2-9S)-P(D1-D5)-9G-Fc或pCMV-杂合体1。对于PDGFR-β/VEGFR1杂合体2的构建，将含有合成DNA(GenScript)(SEQIDNO:36)的678bpBstBI-BmgXI片段与质粒pCMV-sPDGFR(D1-D5)-9G-Fc的5626bpBstBI-BmgXI片段连接以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的PDGFR-β/VEGFR-1杂合体2(SEQIDNO:22)的开放阅读框的pCMV-P(D1-D5)-9S-F(D2)-9G-Fc或pCMV-杂合体2。对于VEGFR1/PDGFR-β杂合体3的构建，将含有合成DNA(GenScript)(SEQIDNO:37)的452bpBmgBI-PshAI片段与质粒pCMV-P(D1-D5)-9S-F(D2)-9G-Fc或pCMV-杂合体2的5334bpBmgBI-PshAI片段连接以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的VEGFR1/PDGFR-β杂合体3(SEQIDNO:23)的开放阅读框的pCMV-F(D2-9S)-P(D1-D3)-9G-Fc或pCMV-杂合体3。对于PDGFR-β/VEGFR1杂合体4的构建，将含有合成DNA(GenScript)(SEQIDNO:38)的758bpBmgBI-PshAI片段与质粒pCMV-P(D1-D5)-9S-F(D2)-9G-Fc或pCMV-杂合体2的5021bpBmgBI-PshAI片段连接，以生成具有在CMV启动子和SV40多腺苷酸化序列的控制下的PDGFR-β/VEGFR1杂合体4(SEQIDNO:24)的开放阅读框的pCMV-P(D1-D3)-9S-F(D2)-9G-Fc或pCMV-杂合体4。

通过蛋白免疫印迹分析确认杂合体1、杂合体2、杂合体3和杂合体4蛋白同源二聚体通过其各自构建体转染的细胞的产生。简要地，将细胞培养基的分泌蛋白装载至还原或非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶中。还将PDGFR(D1-D5)9G-Fc蛋白装载于凝胶上并用作对照。在SDS-PAGE凝胶(NuPAGENovex4-12％Bis-Tris,Invitrogen)上分离蛋白后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。用生物素化山羊抗人PDGFR-β抗体(R&DSystems)探测膜，随后用偶联至辣根过氧化物酶(R&DSystems)的链霉抗生物素蛋白标记并在成像前用化学发光试剂(ThermoScientificPierce)显影。与还原条件相比，在非还原条件下杂合体1、2、3和4的蛋白迁移率确认杂合蛋白二聚化(图4)。在还原条件下均含有5个PDGFR-βECD的PDGFR(D1-D5)9G-Fc和杂合体1和2显示两个PDGFR阳性带，这表明第五PDGFR-βECD区域中的这些蛋白可能蛋白水解裂解(图4，左图)。仅含有前三个PDGFR-βECD的杂合体3和4似乎不裂解，指示其不含杂合体1和2中观察到的蛋白水解裂解位点(图4，左图)。

实施例3：HUVEC增殖由PDGFR-β/VEGFR1杂合蛋白的抑制

测试杂合PDGFR-β/VEGFR1蛋白抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的VEGF-和/或PDGFR-β诱导的增殖的能力。对于杂合蛋白的产生，将293细胞用编码杂合体1、杂合体2、杂合体3或杂合体4的构建体转染且转染后72小时收获含有分泌杂合蛋白的细胞培养基。在VEGF配体存在下将收获细胞培养物施加至HUVEC。将HUVEC(HUVEC-CambrexBioScienceWalkersville公司)以2,000个细胞/孔的密度接种于补充有5％胎牛血清(Invitrogen)的培养基199(Invitrogen)的96孔板中并沉降过夜。温育后，将培养基更换为补充有5％胎牛血清(Invitrogen)的培养基199(Invitrogen)，该培养基含有相等体积(5μl)的从三个独立性受体或对照转染生成的收获细胞培养物以及最终浓度为10ng/ml的单独重组hVEGF-165配体(R&DSystems目录编号293-VE)或，与最终浓度为20ng/ml的PDGF-BB配体(R&DSystems目录编号220-BB)组合，最终体积为100μl/孔。阴性对照由相等体积(5μl)的经EGFP构建体转染的细胞的收获细胞培养物组成，以100μL最终体积/孔。阳性对照包括相等体积(5μl)的在VEGF配体或VEGF和PDGFBB配体存在下经EGFP构建体转染的细胞的收获细胞培养物，100μL最终体积/孔。将细胞于37℃在5％CO₂中温育三至四天。以20μl/孔添加CellTiter96AQ_ueousOneSolutionReagent(Promega目录编号G3580)且4小时后取490nm的吸光率。在VEGF依赖性HUVEC增殖分析中，杂合体2、杂合体3和杂合体4显著阻断HUVEC增殖，其中杂合体2和4与sFLT01具有类似效能(图5A)。与杂合体2、3和4相比，杂合体1不阻断VEGF诱导的HUVEC增殖且与无VEGFR1ECD的PDGFR(D1-D5)9G-Fc蛋白具有类似水平的抗增殖活性(图5A)。杂合体1中的二聚化IgG1-Fc序列的蛋白水解切除可能消除了其VEGF结合能力，这是因在不存在ECD时，二聚化是VEGFR1D2介导的VEGF结合的限制因素(PechanP.,等GeneTher.(2009),16:10-16)。然而在杂合体2中，蛋白水解裂解将分子分成仍能够结合VEGF的含有PDGFR-βECD和sFLT01的单元(图5A)。还在HUVEC竞争性增殖分析中测试所收获杂合PDGFR-β/VEGFR1蛋白。在该分析中，在如上文所述VEGF配体和PDGFBB配体二者存在下将所收获细胞培养物施加至HUVEC。该分析的结果与先前分析类似，杂合体2和杂合体4显著阻断HUVEC增殖，其中杂合体2和4具有与sFLT01类似的效能(图5B)。在两种配体存在下，杂合体1也不阻断HUVEC增殖。与最后分析相反，在两种配体存在下杂合体3具有较弱抗增殖效能，且与无VEGFR1ECD的PDGFR(D1-D5)9G-Fc蛋白的活性相当(图5B)。使用Prism5.0d(GraphPadSoftware公司)分析两个HUVEC增殖分析的统计显著性且使用单因素ANOVA检验进行计算，随后进行Tukey检验。

实施例4：PDGFR-β/VEGFR1杂合蛋白的结合亲和力

使用无细胞的体积PDGF或VEGF结合分析系统测定VEGF和PDGFBB两种配体与PDGFR-β/VEGFR1杂合蛋白间的相对结合亲和力(图6)。对于杂合PDGFR-β/VEGFR1蛋白的产生，将293细胞用编码杂合体1、杂合体2、杂合体3或杂合体4的质粒转染。还用编码PDGFR(D1-D5)9G-Fc或sFLT01蛋白的质粒转染细胞用作结合对照。转染后72小时收获细胞培养基且在结合亲和力分析前通过ELISA和蛋白免疫印迹分析确认分泌蛋白的存在。将分泌蛋白连续稀释，与人VEGFR1配体(20pM最终浓度)或人PDGFBB配体(80pm最终浓度)混合并于室温在回转式振荡器平台上温育过夜。随后通过人VEGF特异性ELISA(HumanVEGFQuantikineELISA试剂盒目录编号DVE00,R&DSystems)或人PDGF特异性ELISA(HumanPDGF-BBDuoSet,R&DSystems)测量未结合PDGFBB的量。VEGF结合分析中所有四个杂合体的比较显示杂合体1是最弱的VEGF结合剂(图6A)。从一个分析中三个单独转染收获的条件培养基中的杂合体3、杂合体4和sFLT01的VEGF结合比较显示杂合体4类似于sFLT01结合VEGF且是相比杂合体3较强的VEGF结合剂(图6A)。PDGF结合分析中所有四个杂合体的比较证实杂合体1还是最弱的PDGF结合剂，而杂合体4证实在所有四个杂合体中结合最佳(图6B)。

使用从用编码杂合体3、杂合体4、PDGFR(D1-D3)9G-Fc或sFLT01蛋白的构建体转染的293细胞收获的条件培养基实施竞争性VEGF和PDGF无细胞的结合分析。转染后72小时收获细胞培养基且在结合亲和力分析前通过ELISA和蛋白免疫印迹分析确认分泌蛋白的存在。将所分泌蛋白连续稀释，与人PDGFBB配体(20pM最终浓度)和人VEGFR1配体(20pm最终浓度)二者混合并于室温在回转式振荡器平台上温育过夜。随后通过人VEGF特异性ELISA(HumanVEGFQuantikineELISA试剂盒目录编号DVE00,R&DSystems)或人PDGF特异性ELISA(HumanPDGF-BBDuoSet,R&DSystems)测量未结合的PDGF-BB和VEGF配体的量。杂合体3和杂合体4与PDGFBB结合对照(PDGFR(D1-D3)9G-Fc)和VEGF结合对照(sFLT01)的比较显示杂合体3和杂合体4二者结合至PDGFBB(图7A)和VEGF(图7B)配体，其中杂合体4证实对两种配体具有更高结合亲和力。使用来自表达杂合体3、杂合体4、PDGFR(D1-D5)9G-Fc或PDGFR(D1-D3)9G-Fc的细胞的细胞培养基的PDGF结合比较证实杂合体4与最佳PDGF结合剂PDGFR(D1-D3)9G-Fc具有类似亲和力(图7A)，而PDGFR(D1-D5)9G-Fc是比所有杂合体1至4(图6B)或PDGFR(D1-D3)9G-Fc(图2B)显著更弱的PDGF结合剂。

实施例5：小鼠中激光诱导的CNV通过杂合PDGFR-β/VEGFR1蛋白的抑制

由于非病原性质、最小毒性和免疫原性、腺相关病毒(AAV)载体转导未分裂细胞的能力和其对治疗蛋白的寿命表达的潜能是用于眼内基因递送的有吸引力的工具(Ali等1996；Ali等1997；Ali等,1998；Lai等2005)。

对于杂合体4的腺相关病毒介导的递送，由鸡β-肌动蛋白启动子-CMV内含子/增强子替代CMV启动子且将包含启动子和编码杂合体4的片段的表达盒插入前病毒质粒载体pAAVSP70的RsrII和MluI位点。参见Ziegler等MolTher.,2004；9:231–240。质粒sp70.BR/杂合体4中的所得AAV基因组的总大小是4.6kb。重组载体AAV2.杂合体4通过使用辅助质粒p5rep-D-CMVcap和pHelper(Stratagene,LaJolla,CA,USA)由293细胞的三重转染产生，且根据制造商的方案使用碘克沙醇分级梯度和HiTrapHeparin柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)在A¨KTAFPLC系统(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ)上进行纯化。参见Vincentatal.,JVirol.,1997；71:1897–1905。AAV2.杂合体4病毒制剂具有2.2E12drp(DNase抗性颗粒)/ml的效价。使用实时TaqManPCR分析(ABIPrism7700；AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)测定病毒效价。如美国专利第7,928,072号中先前所述使用编码VEGFR1D2-9Gly-CH3蛋白(SEQIDNO:39)的核酸(SEQIDNO:40)构建AAV2.sFLT02。在小鼠脉络膜新生血管形成(CNV)激光模型中通过玻璃体内递送施用AAV2.杂合体4、AAV2.sFLT02或AAV2.PDGFR(PDGFR＝PDGFR(D1-D3)9G-Fc)以评定杂合体4在CNV的抑制中的体内效力。简要地，在第0研究天利用向左眼(OS)中单一玻璃体内注射1E9drpAAV2.杂合体4、AAV2.sFLT02或AAV2.PDGFR处理正常成年C57BL/6小鼠的眼，而右眼(OD)未经处理。在第28研究天在双眼中使用激光(每只眼放置3个烧伤，200mW功率，50μm斑点，100ms)诱导CNV。对小鼠灌注5mg/mL2.0x10⁶分子量FITC-葡聚糖并在第42研究天安乐死。采集眼，固定于10％中性缓冲福尔马林中且随后制备脉络膜铺片以检查新生血管形成的程度。比较处理的(OS)眼与对侧(OD)眼中无CNV的烧伤的数目。体内效力的分析证实AAV2.杂合体4的单一玻璃体内注射较AAV2.sFLT02在抑制视网膜新生血管形成中更有效(图8)。此外，在鼠类激光诱导的CNV模型中，AAV2.PDGFR不抑制视网膜新生血管形成(图8)。

序列

PDGFR细胞外区D1-D3氨基酸序列

LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGY(SEQIDNO:1)

PDGFR细胞外区D1-D4氨基酸序列

LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLE(SEQIDNO:2)

PDGFR细胞外区D1-D5氨基酸序列

LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFK(SEQIDNO:3)

VEGFR1细胞外区D2氨基酸序列

RPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT(SEQIDNO:4)

VEGFR1细胞外区D1-D3氨基酸序列

PELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSKESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDK(SEQIDNO:5)

IgG1Fc区氨基酸序列

PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:6)

具有分泌肽(加下划线)的PDGFR(D1-D5)氨基酸序列

MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFK(SEQIDNO:7)

具有分泌肽(加下划线)的PDGFR(D1-D4)氨基酸序列

MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLE(SEQIDNO:8)

具有分泌肽(加下划线)的PDGFR(D1-D5)9G-Fc氨基酸序列

MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:9)

具有分泌肽(加下划线)的PDGFR(D1-D3)9G-Fc氨基酸序列

MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:10)

具有分泌肽(加下划线)的PDGFR(D1-D2)9G-Fc氨基酸序列

MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:11)

杂合体1氨基酸序列

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTSSSSSSSSSQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:12)

杂合体2氨基酸序列

MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFSSSSSSSSSRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:13)

杂合体3氨基酸序列

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTSSSSSSSSSQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:14)

杂合体4氨基酸序列

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTSSSSSSSSSQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:14)

PDGFR(D1-D5)开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCTGAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCCACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAAATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACACTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATGAGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCGTGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAAAAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTTAA(SEQIDNO:16)

PDGFR(D1-D4)开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCTGAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCCACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAAATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACACTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATGAGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGTAG(SEQIDNO:17)

PDGFR(D1-D5)9G-Fc开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCTGAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCCACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAAATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACACTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATGAGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCGTGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAAAAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:18)

PDGFR(D1-D3)9G-Fc开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:19)

PDGFR(D1-D2)9G-Fc开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:20)

杂合体1开放阅读框

ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCTCGAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCCAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCTGAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCCACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAAATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACACTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATGAGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCGTGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAAAAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:21)

杂合体2开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCTGAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCCACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAAATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACACTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATGAGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCGTGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAAAAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGCCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:22)

杂合体3开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCTGAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCCACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAAATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACACTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATGAGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCGTGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAAAAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGCCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:22)

杂合体4开放阅读框

ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGCTGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTTGAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:24)

PDGFRBPR6SpeIF核酸引物

GACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG(SEQIDNO:25)

PDGFRBPR7AgeIR核酸引物

ACCGGTGGATGACACCTGGAGTCTG(SEQIDNO:26)

PDGFRB-PR1-AccF核酸引物

CTATGTCTACAGACTCCAGGTGTC(SEQIDNO:27)

D5-PR9-AgeI-RevR核酸引物

ACCGGTAAAGGGCAAGGAGTGTGGC(SEQIDNO:28)

PDGF02F核酸引物

CCTCCACCGGTGTAGCCGCTCTCAACCACGGT(SEQIDNO:29)

PDGF03R核酸引物

CCCGGGACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG(SEQIDNO:30)

D5-SV40F核酸引物

CCGGTTAGGGA(SEQIDNO:31)

D5-SV40B-2核酸引物

GGCCTCCCTAA(SEQIDNO:32)

D4-SV40F核酸引物

TGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGTAGC(SEQIDNO:33)

D4-SV40B核酸引物

GGCCGCTACTCCAGCACTCGGACAGGGACATTGATCTGTAGCTGGAAGGAGAGCTGGACC(SEQIDNO:34)

Kozak-SP-D2-9Ser合成核酸片段

ACTAGTGGCGGCCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCTCGAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCCAGATCT(SEQIDNO:35)

D2-2220-2908合成核酸片段

CCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG(SEQIDNO:36)

D3-Fc合成核酸片段

GACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG(SEQIDNO:37)

D3-F(D2)合成核酸片段

GACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG(SEQIDNO:38)

sFLT02(D2-9Gly-CH3)氨基酸序列

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:39)

sFLT02(D2-9Gly-CH3)开放阅读框

ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQIDNO:40)

突变ITR核酸序列

CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG(SEQIDNO:41)

无分泌肽的杂合体1氨基酸序列

RPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTSSSSSSSSSQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:42)

无分泌肽的杂合体2氨基酸序列

LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFSSSSSSSSSRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:43)

无分泌肽的杂合体3氨基酸序列

RPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTSSSSSSSSSQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:44)

无分泌肽的杂合体4氨基酸序列

LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYSSSSSSSSSRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:45)