一种黄胸鼠PCR鉴定引物及鉴定方法

摘要

本发明提供了一种黄胸鼠PCR鉴定引物及鉴定方法，以便能够在单从形态上难以判断鼠种的情况下，进行简单而且准确的黄胸鼠鉴定。所述黄胸鼠PCR引物，其上游引物的核苷酸序列为：“5’-CCTCGCACCAACTCCTGAA-3’”，其下游引物的核苷酸序列为：“5’-TGGCTACCTAAACCTAAAGCAACT-3’”。使用该黄胸鼠PCR鉴定引物鉴定黄胸鼠的方法，包括1)待鉴定物的DNA样品采集和总DNA的提取；2)以步骤1)中提取到的总DNA为模板，利用上述引物组合进行PCR扩增；3)反应结束后，以PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果在503bp出现的特异性扩增条带做为黄胸鼠的阳性判定结果。此方法结果稳定、操作简单、高效而且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对黄胸鼠的PCR鉴定引物及使用该引物鉴 定黄胸鼠的方法。

背景技术

鼠类是鼠疫、流行性出血热、钩端螺旋体病等多种病原体的储存宿主，对人类的生产、 生活和健康构成严重的威胁。某些病原体对宿主有一定的专一性，不同种鼠种对流行病学具 有不同意义。城市内的老鼠则以黄胸鼠、褐家鼠和小家鼠等家栖鼠为主^【1】。其中，黄胸鼠是 目前大多数城市里的优势鼠种，它活跃于各饮食饭店、宾馆食堂、食品加工厂及居民小区， 是卫生城市、文明城市创建除四害中主要祸首。此外，黄胸鼠抗药性强，容易对抗凝血灭鼠 剂的产生抗药性^【2】，因此对黄胸鼠的治理变得越来越困难。因此，能够快速鉴定黄胸鼠，可 以有的放失的采取措施，进行有效的防治，以达到事半功倍的灭鼠效果。

目前，鼠种的鉴定依然仅限于传统的形态学方法。这种方法不仅费时费力，而且在某些 方面具有很大的局限性，如：黄胸鼠，褐家鼠及其幼鼠时期形态非常接近，仅靠形态学个体 常无法给出确切的结论。

利用PCR的基因扩增法已被广泛利用于各个领域。PCR法是以极微量的DNA为摸板，短时 间内将目的DNA区域扩增至数十万倍的方法，因其精度高而广泛被利用于医学和微生物领域。 VKORC1(维生素环氧化物还原酶复合体亚单位1)是一个与维生素K相关的基因^【3】，虽然人 类VKORC1基因多态性研究报道比较多^【4】，而对鼠类VKORC1基因的研究国内外鲜有报道^【5、6】。 而且鼠类VKOCR1基因序列比较保守，在鼠分类上具有重要的参考价值。

参考文献：

[1]章士军，王智泉，陈郁，等.南通市区鼠夹法和鼠笼法捕鼠情况的分析[J].中华卫生 杀虫药械，2013，19(2)：152-154.

[2]王智泉，章士军，陈郁，等.南通市黄胸鼠对杀鼠灵的抗药性研究[J].中华卫生杀虫 药械，2014，20(3):223-225.

[3]王智泉，李海波，章士军，等.南通市家栖鼠VKORC1基因与其抗药性的相关研究[J]. 中华卫生杀虫药械，2014,20(1):23-25.

[4]贺宝霞，石磊，赵树进.CYP2C9和VKORC1基因多态性与warfarin个体化用药研究进展 [J].广东医学.2008,29(4)684-686.

[5]TanakaK.D.,KawaiY.K.,IkenakaY.,etal.“AnovelmutationinVKORC1andits effectonenzymaticactivityinJapanesewarfarin-resistantrats[J].J.Vet.Med. Sci.,2013,5(2):135-139.

[6]RostS.,PelzH.J.,MenzelS.,etal.“NovelmutationsintheVKORC1geneofwild ratsandmice–aresponseto50yearsofselectionpressurebywarfarin”.BMC Genetics,2009,10:4.

发明内容

本发明提供了一种黄胸鼠PCR鉴定引物及鉴定方法，以达到能够针对难以从形态上进行 判断的鼠类进行简单而且准确的黄胸鼠鉴定的目的。该方法稳定、高效而且成本低。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明提供了一种黄胸鼠PCR鉴定引物，其特征在于，其核苷酸序列分别为：

上游引物为：5’-CCTCGCACCAACTCCTGAA-3’；

下游引物为：5’-TGGCTACCTAAACCTAAAGCAACT-3’。

本发明还提供了一种使用上述黄胸鼠PCR鉴定引物鉴定黄胸鼠的方法，包括以下步骤：

1)提取待鉴定物的总DNA；

2)以步骤1)中提取到的总DNA为模板，利用上述黄胸鼠PCR鉴定引物组合进行PCR扩增；

3)使用琼脂糖凝胶电泳检测步骤2)中产生的PCR产物，以鉴定黄胸鼠。上述PCR产物的琼 脂糖凝胶电泳结果在503bp出现特异性扩增条带，则为黄胸鼠的阳性判定结果。

本发明提供的技术方案达到了如下的有益效果：1)使用比较保守的鼠类VDORC1基因序 列设计了PCR引物，其PCR扩增产物特异于黄胸鼠鼠种，可以将黄胸鼠与其他鼠种区别开来； 2)使用该引物的PCR鉴定方法可以针对难以从形态上进行判断的鼠类进行黄胸鼠鉴定；3) 该实验方法所需样本量少，标本采集容易实现，且方法操作简单，结果稳定而准确，而且成 本低。

附图说明

图1是不同鼠种PCR琼脂糖凝胶电泳结果特异性结果。

图2是分子标记物DL2000的片段分子量对照表。

图中，1、2.黄胸鼠；3、4.褐家鼠；5、6.大白鼠；7.白腹巨鼠；8.黑线姬鼠；9.DL2000

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一 步的介绍。

一、根据VKORC1基因序列，通过trnL序列设计，设计了黄胸鼠PCR鉴别引物，其核苷酸序 列为：

上游引物为：5’-CCTCGCACCAACTCCTGAA-3’；

下游引物为：5’-TGGCTACCTAAACCTAAAGCAACT-3’。

二、鼠尾DNA提取方法(柱式离心管法，捷瑞基因组提取试剂盒)

1、在液氮中将0.5～1cm的鼠尾部末端组织研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中。

2、然后加入400μl裂解液和10μl的ProteinaseK(蛋白酶).

3、震荡混匀1分钟，然后置于55℃水浴1～3小时，在此期间可以适当取出混匀，有助于充 分裂解。

4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。

5、在经过预处理好的样品中，加入600ul提取液，用力摇匀，然后12,000rpm离心5分钟。 溶液将分层，上层为水相层，下层为有机溶剂层，两层溶液中间可能会有部分沉淀层，DNA 在上层水相中。

6、用灭菌的枪头将上层水相溶液仔细吸出到离心柱中，尽量避免吸到中间层的沉淀。

7、8,000rpm离心1分钟，取下离心柱，倒掉收集管中废液。

8、将离心柱放回收集管中，加入500μlWashSolution(清洗液)，8,000rpm，室温离心1 分钟。

9、重复步骤8一次。

10、取下离心柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12,000rpm，室温离心1分钟， 以除去残留WashSolution(清洗液)。

11、将离心柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱中央加入50～100μlElutionBuffer(洗 脱缓冲液)，室温或55℃放置2分钟。然后12,000rpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即 为基因组DNA。根据用途，样品可于4℃或-20℃保存。

三、PCR扩增体系及PCR扩增程序

1、PCR扩增体系

以总DNA为模板，进行PCR扩增，25μL的反应体系中含有：2xTaqPCRMaterMix12.5μL， 10μMForwardPrimer1μL，10μMReversePrimer1μL，DNA样品1μL，Water(nuclease-free) 9.5μL。

2、PCR扩增反应条件

PCR扩增的反应条件为：预变性95℃、5min，再经95℃变性15sec，55℃复性15sec，72℃延伸 30sec，35循环，最后72℃延伸5min。反应结束后，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳得到鉴定 结果。

四、电泳程序

1、1.0％琼脂糖凝胶制备：

称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml1×TBE缓冲液，微波炉加热至完全溶化，冷却至 60℃左右，加适量溴化乙锭贮存液，轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，不要出现 气泡，静置冷却30min以上，放入电泳槽中即可上样，电泳缓冲液与制备凝胶的缓冲液浓度 相同。

2、点样，电泳

在电泳样品中加入1/10体积的10×Loadingbuffer，混匀后加样。电泳时用5-7V/cm的电 压，电泳30min。电泳后取出凝胶，在紫外灯下观察并照相(见图1)。

实施例

利用本发明提供的黄胸鼠鉴定引物及其鉴定方法对黄胸鼠、褐家鼠、大白鼠、白腹巨鼠 和黑线姬鼠的DNA标本按照上述具体实验方法进行了黄胸鼠鉴定，结果如下：

在图1和图2根据目的片段大小进行鼠种的判定的电泳结果分析中，从黄胸鼠中提取的DNA (见图1中标记1和2)经PCR扩增后，在1.0％琼脂糖凝胶电泳胶板503bp处出现特异性条 带，而从其他鼠类，如：褐家鼠(见图1中标记3和4)、大白鼠(见图1中标记5和6)、白 腹巨鼠(见图1中标记7)黑线姬鼠(见图1中标记8)，提取的DNA经PCR扩增后，在1.0％ 琼脂糖凝胶电泳胶板593bp处出现特异性条带。这说明黄胸鼠与褐家鼠、大白鼠、白腹巨鼠、 黑线姬鼠的VKORC1基因的第二外显子基因片段大小存在差异，且该差异特异于黄胸鼠。

基于日益更新的多样化的检测PCR产物的手段和方法，本实施例所举之鉴定方法仅为其 中之一。本发明提供的鉴定引物以及由此获得的可以将黄胸鼠与其他鼠种相区别的基因片段， 亦适合应用于其他与之相关的黄胸鼠鉴定中。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应 该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护 范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表：

<110>南通市疾病预防控制中心

<120>一种黄胸鼠PCR鉴定引物及鉴定方法

<160>1

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>503

<212>DNA

<213>Rattusflavipectus

<400>1

cctcgcaccaactcctgaaaagttattgatggcctgtgattccttcgcacccccatcctg60

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