一种用于微化学分析的小黄鱼仔稚鱼耳石矢状面切片的制作方法

摘要

本发明涉及一种用于微化学分析的小黄鱼仔稚鱼耳石矢状面切片的制作方法，包括：(1)摘取；(2)标记；(3)点胶；(4)包埋；(5)切磨；(6)抛光；(7)切割；(8)清洗；(9)烘干。本发明确保了耳石微化学分析的最大矢状面、提高耳石微化学分析的准确度，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于耳石处理领域，特别涉及一种用于微化学分析的小黄鱼仔稚鱼耳石矢状面切 片的制作方法。

背景技术

仔稚鱼期是鱼类早期生活史的重要阶段，与栖息环境有着密切关系，仔稚鱼的死亡动态 直接影响着渔业资源的补充。

传统的渔业资源调查方法和生物遥测法无法实施洄游性鱼类全生活史中栖息环境的连续 监测。耳石信息提供了鱼类生活史中所经历的环境变化。从耳石核心到外缘区的元素组成通 常按时间序列记录着鱼类从出生到被捕获时所经历的不同生境特征。近40多年来，耳石作为 生境“指纹”标签的独特属性在鱼类时空动态的研究领域得以迅速发展并广泛应用。

成鱼耳石微化学结果局限于对鱼类早期生活史的框架式地反映，而仔稚鱼的耳石微化学 与生长日龄相结合进行分析能精确地阐明鱼类早期生长关键阶段与栖息环境之间的对应关 系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于微化学分析的小黄鱼仔稚鱼耳石矢状面切片 的制作方法，该方法确保了耳石微化学分析的最大矢状面、提高耳石微化学分析的准确度。

本发明的一种用于微化学分析的小黄鱼仔稚鱼耳石矢状面切片的制作方法，包括：

(1)摘取：在解剖镜下用尖头镊子将仔稚鱼平衡囊内的矢耳石取出，然后放入盛有去离子水 的培养皿中进行清洗，室温下晾干，放入离心管中，并标上耳石编号；

(2)标记：在解剖镜下鉴别左耳石和右耳石后，分别置于离心管中，并在离心管上标记左或 右以示左、右耳石，统一取左耳石或右耳石进行后续操作；

(3)点胶：将A胶和B胶按体积比1:0.5～2涂在锡箔纸上，边加热边搅拌30～40秒；取已编 号的耳石包埋盒，沾取AB胶点在包埋盒盒底；将仔稚鱼耳石放置在AB胶上，并按压耳石 表面，记录耳石的编号与对应包埋盒的编号；

(4)包埋：按质量比6～8:1将树脂和固化剂搅拌混匀，往每个包埋盒注入混匀后的树脂3～4ml； 包埋后烘干，待硬化后取出树脂块；

(5)切磨：使用AB胶将耳石树脂块黏贴于标有耳石编号的玻璃片上；待凝固后，采用耳石 切磨机(Discoplan-TS，斯特尔公司)切除多余树脂，并使用金刚石磨盘对耳石进行粗磨，至 接近耳石核心暴露；再换用1200目水砂纸进行手工精磨，至耳石核心完全暴露；

(6)抛光：使用金刚石抛光液和MD抛光布手动抛光，确认耳石表面无刮痕为止；

(7)切割：采用耳石切磨机(Discoplan-TS，斯特尔公司)切割耳石玻璃片的多余部分，确 保耳石切片大小能放入微化学分析仪的样品台；

(8)清洗：将仔稚鱼耳石磨抛面朝上，使用去离子水冲洗，后置于超纯水中超声清洗；超声 清洗后，对耳石磨抛面顺序采用去离子水、超纯水分别进行冲洗；

(9)烘干：最后将清洗后的树脂块烘干，用于耳石微化学分析。

所述步骤(3)中的A胶和B胶为化学反应粘合剂。

所述步骤(4)中的树脂为环氧树脂，固化剂为IPTG。

所述步骤(4)和(9)中的烘干温度为38～40℃，烘干时间为12～15小时。

所述步骤(8)中的超纯水超声清洗时间为2～3分钟。

有益效果

(1)本发明解决了因仔稚鱼耳石轻和小而导致用树脂包埋时移动甚至倾斜，用点胶法将耳石 固定后再进行包埋能有效避免这种问题；

(2)采用切磨方法避免了耳石纯手工研磨过程导致耳石矢状面磨成斜面的问题，确保了耳石 微化学分析的最大矢状面；

(3)手工抛光的方法避免了因机器抛光时转速快而导致仔稚鱼薄且小的耳石磨片破碎的问 题；

(4)清洗的方法在保证耳石不丢失的同时，能有效去除耳石矢状面的杂质，避免微化学分析 时的干扰；

(5)上述一系列步骤，确保了仔稚鱼耳石微化学分析结果的可靠性。

附图说明

图1为5月7日的小黄鱼仔稚鱼的耳石Sr/Ca比值变化图；

图2为5月28日的小黄鱼仔稚鱼的耳石Sr/Ca比值变化图；

图3为6月23日的小黄鱼仔稚鱼的耳石Sr/Ca比值变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1)摘取：在解剖镜下用镊子将小黄鱼仔稚鱼平衡囊内的矢耳石取出，注意要轻镊轻放，以免 损坏耳石；将仔稚鱼的耳石取出后，放入盛超纯水的培养皿中进行清洗，去掉耳石表面有机 质，室温下晾干，放入离心管中作为分析材料待用，并标上耳石编号；

2)标记：在解剖镜下鉴别左耳石和右耳石后，分别置于离心管中，并在离心管上标记耳石的 编号，在离心管盖上标记左(L)或右(R)以示左、右耳石。统一取左耳石进行后续操作；

3)点胶：将A胶和B胶挤出少量，按体积比1：1的比例在锡箔纸上，在酒精灯上进行加热， 边加热边搅拌30秒；取已编号的耳石包埋圆盒，用牙签沾取混合的AB胶点在包埋盒盒底； 迅速将仔稚鱼耳石放置在AB胶上，并用镊子按压耳石表面，保证耳石矢状面水平；待冷却 凝固45分钟；记录耳石的编号与对应包埋盒的编号；其中，使用的A胶和B胶，化学名称 为化学反应粘合剂(日本株式会社)；

4)包埋：按质量比7:1将环氧树脂和固化剂混合，往每个包埋盒注入调配好的树脂3ml，树 脂需要覆盖仔稚鱼耳石；包埋后在38℃烘箱中烘12小时；待硬化后取出树脂块，并在树脂 块上用解剖针刻好各耳石的编号；其中，使用的树脂和固化剂，化学名称分别是环氧树脂和 IPTG(斯特尔公司，哥本哈根，丹麦)；

5)切磨：使用AB胶将耳石树脂块黏贴于标有耳石编号的玻璃片上，并确保树脂块能覆盖耳 石编号；待凝固后，采用耳石切磨机(Discoplan-TS，斯特尔公司)切除多余树脂，并使用金 刚石磨盘对耳石进行粗磨，至接近耳石核心暴露；再换用1200目水砂纸手工精磨，期间随时 在正置金相显微镜下用透、反射光观察表面状况，至耳石核心完全暴露；

6)抛光：使用金刚石抛光液和MD抛光布手动抛光研磨面；在正置金相显微镜下用反射光确 认耳石表面无刮痕为止；

7)清洗：将仔稚鱼耳石磨抛面朝上，使用去离子水冲洗6遍，后置于超纯水中超声清洗2～3 分钟；超声清洗后，对耳石磨抛面顺序采用去离子水、超纯水分别进行8遍冲洗；为防止将 仔稚鱼耳石冲掉，水瓶的细口喷头避免对准耳石面；

8)烘干：最后将清洗后的树脂块置于在38℃烘箱中，12小时后可用于耳石微化学分析。

9)镀碳膜：将仔稚鱼耳石样品置于真空镀膜机(JEE-420，日本电子株式会社)中蒸镀碳膜， 电流设置为35A，镀膜时间为25秒。

10)耳石微化学分析：利用电子探针微区分析仪(英文缩写EPMA，JXA-8100型，日本电子 株式会社)从核心顺最长轴向边缘进行连续打点测点，点间间隔为5μm，EPMA加速电压和 电子束电流分别为15kV，2.0×10^-8A，束斑直径为5μm，每点驻留时间为15s。取用碳酸钙 (CaCO₃)和钛酸锶(SrTiO₃)为标准样品。所获各点用Sr含量和Ca含量的比值来表示，统 一用Sr含量：Ca含量×10³的比值表示(简称Sr/Ca比值)。

以约1月的间隔进行取样(5月7日、5月28日、6月23日)，不同个体大小的仔稚鱼 耳石微化学对比：

(1)同一生长阶段比对。在3个时间段的幼鱼从耳石核心至15～35μm处，均表现出高 Sr/Ca值(表1)，经单因素方差分析检验，3个时间段的小黄鱼耳石核心附近的高Sr/Ca值间 无显著差异(P﹥0.05)。

(2)Sr/Ca比值变化趋势比对。5月7日、5月28日和6月23日的小黄鱼耳石Sr/Ca比 值变化趋势一致，且在相同生长阶段的耳石Sr/Ca比值变化基本重叠(见图1-3)：5月7日的 个体从核心至20μm处平均Sr/Ca为9.11±0.80；5月28日的个体从核心至30μm间平均Sr/Ca 为9.48±1.11；6月23日的个体从核心至20μm间平均Sr/Ca为8.90±0.76；此后至约400μm 间，表现为Sr/Ca比值下降至6：三个时间段的幼鱼Sr/Ca依次为5.87±0.84、6.15±0.50、 5.62±0.57。

由此可见按实施例公开的方法，仔稚鱼耳石微化学分析结果准确可靠。

表1不同个体大小的小黄鱼仔稚鱼耳石核心区高Sr值