纳米探针的制备方法、基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法及应用

摘要

本发明提供一种纳米探针的制备方法、基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法及应用，所述纳米药物的制备方法为通过酰胺化反应，将天然产物单体与氨基化PEG连接成药物分子-PEG的聚合物，然后通过相转移的方法将该聚合物连接到量子点表面，进而形成具有靶向性的荧光纳米药物。本发明通过简单可行的方法将天然产物单体负载到纳米探针的表面，相比于常用的口服自微乳、固体脂质纳米粒等几种剂型，该微纳结构的纳米药物更有利于药物的释放，提高药物利用率，并且表面修饰之后，纳米探针的荧光特性没有影响。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种靶向纳米探针的制备方法、基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法及应用，以纳米探针GC-QDs为载体，负载天然产物单体之后制备成具有荧光性质的靶向纳米药物，可用于肝细胞性肝癌的诊断标记和治疗。

背景技术

肝细胞性肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是由病毒和化学致癌物等多因素的作用引起肝细胞生长失控而致癌变。HCC恶性程度极高，预后很差，早诊早治是提高HCC患者生存率的唯一途径。GPC-3的表达与肝细胞癌的形成关系密切，具癌胚性，可作为早期HCC的血清标志物和潜在的靶向治疗目标。通过建立高特异性和高灵敏度的GPC-3监测方法，可有望实现靶向HCC的准确诊断和及时治疗。

雷公藤红素是一种具有显著抗肿瘤活性的天然活性单体。由于雷公藤红素的毒副作用也相对较大，因此，对雷公藤红素的结构优化以及剂型的改造是得到具有高效低毒特性的抗肿瘤化合物的重要途径。关于雷公藤红素新剂型的研究，目前报道不多，主要包括口服自微乳以及固体脂质纳米粒等几种剂型，通过表面负载的方式制备纳米药物的研究不多。

量子点可以作为一种理想的荧光探针以及纳米载体材料，可用于疾病的诊断、治疗及药物研发等研究领域。但是常用量子点的细胞毒性较大，生物安全性和生物靶向性较差。通过结构改造和功能化修饰，可以显著改善量子点的诸多缺点，进而应用到生物医学的研究领域。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种纳米探针的制备方法、基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法及应用，制备的纳米药物更有利于药物的释放，提高药物利用率，并且表面修饰之后，纳米探针的荧光特性没有影响。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种纳米探针的制备方法，所述纳米探针以ZnS为壳层的核壳结构的荧光量子点为载体，通过表面修饰单抗GC-33制备得到，其制备步骤如下：

（1-1）制备以ZnS为壳层的核壳结构量子点；

（1-2）取2~10ml以ZnS为壳层的核壳结构量子点溶液超生分散，15000rpm转离心30~50min，加超纯水0.5ml，备用；

（1-3）取5~20mg的碳化二亚胺，1~10mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺加水1.0ml溶解；

（1-4）取上述溶液0.3~1.0ml加入以ZnS为壳层的核壳结构量子点溶液中，定容至1.0~5.0ml，37℃摇床反应1~2小时；

（1-5）15000rpm高速离心30~50分钟，弃上清，用pH8.5的PBS溶液250~1000μl重新溶解；

（1-6）加5~20μl的靶向GPC-3的单抗GC-33溶液，37℃的恒温下，摇床反应2~3小时，将单抗GC-33修饰到以ZnS为壳层的核壳结构量子点的表面；

（1-7）15000rpm离心30~50分钟，溶于pH7.2的PBS溶液中，分离提纯得到靶向肿瘤标志物GPC-3的荧光纳米探针。

其中，所述步骤（1-1）中的以ZnS为壳层的核壳结构量子点为ZnO/ZnS，具体制备步骤如下：

（2-1）将3~8g乙酸锌和0.3~1.5g乙酸钠加入到装有200mL乙醇的圆底烧瓶中；

（2-2）加热溶解后，迅速加入1.0mol/l的氧化钠乙醇溶液18~50mL，反应30~60分钟，冷却至室温；

（2-3）在溶液中以0.5~2.0滴/秒的滴速滴加过量乙酸乙酯至有沉淀产生，离心分离出沉淀物，用乙酸乙酯洗涤3~5次，然后把沉淀物重新分散在乙醇中，制得ZnO纳米颗粒；

（2-4）向ZnO纳米颗粒的悬浮液中依次滴加0.2mol/l的乙酸锌3~10ml和等体积的0.2mol/l的硫代乙酰胺的乙醇溶液，滴速保持0.5~2.0滴/秒，滴加完成后加热；

（2-5）按照S-Zn-S-Zn逐层对其进行ZnS壳层包覆，形成ZnO/ZnS量子点，反应4~8小时后终止，再次使用乙酸乙醋沉淀出不同粒径的ZnO/ZnS核壳纳米颗粒，离心分离出ZnO/ZnS核壳结构量子点。

本发明还提供一种基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法，通过酰胺化反应，将天然产物单体与氨基化PEG连接成药物分子-PEG的聚合物，然后通过相转移的方法将该聚合物连接到量子点表面，进而形成具有靶向性的荧光纳米药物。

上述纳米药物的制备方法包括如下步骤：

（3-1）以ZnS为壳层的核壳结构量子点为载体，通过表面修饰单抗GC-33制备靶向肿瘤标志物GPC-3的荧光纳米探针GC-QDs1~10ml；

（3-2）取天然产物单体配置成1.0~10.0mg/ml的药物溶液，备用；

（3-3）取5~15mg的碳化二亚胺、1~5mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺加水1.0~5.0ml溶解；

（3-4）取步骤（3-3）所制溶液0.5ml，加入到0.3~1.0ml按步骤（3-2）配置的药物溶液中，定容至1.0ml，37℃摇床反应1~3小时；

（3-5）向上述混合溶液中以1~2滴/秒滴加2mg/ml的氨基化PEG溶液1~5ml，然后在37℃的恒温下反应2~4小时，搅拌速度200~1000转/min，制备成药物分子-PEG的聚合物，纯化后用PBS重新溶解，备用；

（3-6）将药物分子-PEG的聚合物溶液与步骤（3-1）配置的纳米探针GC-QDs溶液，按照等质量浓度混合，室温下搅拌反应3~6小时，将药物分子连接到纳米探针的表面；

（3-7）15000rpm离心30~50分钟，收集上清液，并将沉淀物重新溶于PBS中，制成靶向GPC-3的荧光纳米药物GC-QDs-Drug。

其中，所述步骤（3-1）中纳米探针GC-QDs的制备步骤参照前面所述。

本发明还提供一种上述的纳米药物的应用，包括纳米药物体外药物控制释放曲线的测定、纳米药物对体外培养的肝癌细胞HepG2生长抑制率的测定、纳米药物促进肝癌细胞HepG2凋亡的体外测试实验、纳米药物对肝癌细胞的标记。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

1.本发明通过简单可行的方法将天然产物单体负载到纳米探针的表面，相比于常用的口服自微乳、固体脂质纳米粒等几种剂型，该微纳结构的纳米药物更有利于药物的释放，提高药物利用率，并且表面修饰之后，纳米探针的荧光特性没有影响。

2.本发明所制备的荧光纳米药物具有较高的载药率（20.31±6.76%）和包封率（82.85±10.33%），且体外药物释放呈现pH敏感性，相比于pH7.4的环境，在pH6.0的酸性介质中，纳米药物具有更快的药物释放速度和药物释放率，这一特性减少了纳米药物在体循环中的药物释放量和毒副作用，同时有利于在肿瘤部位的被动靶向作用。

3.本发明所制备的靶向荧光纳米药物可对肝癌细胞进行荧光标记和成像，通过对癌细胞的标记、示踪和治疗的一体化动态监测，发展基于新型标志物GPC-3标记和成像指导下肝癌的准确治疗。

附图说明

图1是本发明的荧光纳米药物在不同pH值的介质中，对雷公藤红素分子的体外药物释放曲线；

图2是本发明中肝癌细胞经过纳米药物干预之后产生明显凋亡的DAPI染色结果；

图3是本发明的纳米探针及荧光纳米药物对肝癌细胞的体外荧光标记实验结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同，本发明所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特殊说明，本发明中所用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或课通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种纳米探针的制备方法，所述纳米探针以ZnS为壳层的核壳结构的荧光量子点为载体，通过表面修饰单抗GC-33制备得到，其制备步骤如下：

（101-1）制备以ZnS为壳层的核壳结构量子点；

其中，以ZnS为壳层的核壳结构量子点为ZnO/ZnS，其制备方法包括如下步骤：

（101-1-1）将3.5g乙酸锌和0.4g乙酸钠加入到装有200mL乙醇的圆底烧瓶中；

（101-1-2）加热溶解后，迅速加入1.0mol/l的氧化钠乙醇溶液19.5mL，反应30分钟，冷却至室温；

（101-1-3）在溶液中以1滴/秒的滴速滴加过量乙酸乙酯至有沉淀产生，离心分离出沉淀物，用乙酸乙酯洗涤3~5次，然后把沉淀物重新分散在乙醇中，制得ZnO纳米颗粒；

（101-1-4）向ZnO纳米颗粒的悬浮液中依次滴加0.2mol/l的乙酸锌3.5ml和等体积的0.2mol/l的硫代乙酰胺的乙醇溶液，滴速保持1滴/秒，滴加完成后加热；

（101-1-5）按照S-Zn-S-Zn逐层对其进行ZnS壳层包覆，形成ZnO/ZnS量子点，反应5小时后终止，再次使用乙酸乙醋沉淀出不同粒径的ZnO/ZnS核壳纳米颗粒，离心分离出ZnO/ZnS核壳结构量子点。

（101-2）取5.0ml的以ZnS为壳层的核壳结构量子点溶液超生分散，15000rpm转离心30min，加超纯水0.5ml，备用；

（101-3）取10mg的碳化二亚胺，2mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺加水1.0ml溶解；

（101-4）取上述溶液0.5ml加入以ZnS为壳层的核壳结构量子点溶液中，定容至1.0ml，37℃摇床反应1~2小时；

（101-5）15000rpm高速离心30分钟，弃上清，用pH8.5的PBS溶液250μl重新溶解；

（101-6）加5μl的靶向GPC-3的单抗GC-33溶液，37℃的恒温下，摇床反应2小时，将单抗GC-33修饰到以ZnS为壳层的核壳结构量子点的表面；

（101-7）15000rpm离心30分钟，溶于pH7.2的PBS溶液中，分离提纯得到靶向肿瘤标志物GPC-3的荧光纳米探针。

实施例2：

一种基于天然产物单体和纳米探针的纳米药物的制备方法，通过酰胺化反应，将天然产物单体与氨基化PEG连接成药物分子-PEG的聚合物，然后通过相转移的方法将该聚合物连接到量子点表面，进而形成具有靶向性的荧光纳米药物。

其中，本发明中的天然产物单体选用具备药效作用的天然活性单体，优选分子结构带羧基且为非活性基团的天然活性单体，本实施例中以雷公藤红素为药物分子为例，进一步描述纳米药物的制备方法。

具体步骤如下：

（102-1）按实施例1制备纳米探针GC-QDs；

（102-2）取雷公藤红素配置成2.0mg/ml的药物溶液，备用；

（102-3）取10mg的碳化二亚胺EDC、2mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺NHSS加水1.0ml溶解；

（102-4）取步骤（102-3）所制溶液0.5ml，加入到0.5ml按步骤（102-2）配置的药物溶液中，定容至1.0ml，37℃摇床反应1小时；

（102-5）向上述混合溶液中以2滴/秒滴加2mg/ml的氨基化PEG溶液1ml，然后在37℃的恒温下混合反应2小时，制备成药物分子-PEG的聚合物，纯化后用PBS重新溶解，备用；

（102-6）将药物分子-PEG的聚合物溶液与步骤（102-1）配置的纳米探针GC-QDs溶液按照等质量浓度混合，室温下搅拌反应4小时，将药物分子连接到纳米探针的表面；

（102-7）15000rpm离心30分钟，收集上清液，并将沉淀物重新溶于PBS中，制成靶向GPC-3的荧光纳米药物GC-QDs-Drug。

上述制备的纳米药物的应用，包括纳米药物体外药物控制释放曲线的测定、纳米药物对体外培养的肝癌细胞HepG2生长抑制率的测定、纳米药物促进肝癌细胞HepG2凋亡的体外测试实验、纳米药物对肝癌细胞的标记。

（一）纳米药物体外药物控制释放曲线的测定，步骤如下：

（103-1）将制备的荧光纳米药物溶解于5mL的PBS缓冲溶液中，并转移至透析袋中；

（103-2）将透析袋置于盛有95mL、pH7.4缓冲溶液中，在37℃恒温水浴中100rpm匀速搅拌缓冲液；

（103-3）分别于0、2、4、6、8、10、12、16、20、24h定时取样0.2mL，同时补进同体积的相应缓冲溶液；

（103-4）所得到的不同时间点的样品用高效液相法检测雷公藤红素的浓度；色谱条件为：色谱柱：DikmaTechnologiesC18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇：10mL/L醋酸溶液（87：13）；检测波长：425nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量:20μL；

（103-5）计算不同时间点时纳米药物GC-QDs-Drug释放的雷公藤红素的量，再计算累积释放量并绘制体外释放曲线；以累积释放量和时间拟合方程，设CSL-CdTe中雷公藤红素CSL的质量为Mdrug，释放缓冲溶液PBS的体积为V₀（即100mL），PBS的置换体积为V_s（即0.2mL），第i时刻取出的样品中药物浓度为C_i，用下面的公式计算雷公藤红素的累积释放量：

。

（103-6）相同步骤下测量缓冲液pH6.0的媒介环境中，纳米药物对药物分子的药物释放曲线；

（103-7）附图1是在pH6.0和pH7.4条件下药物累积释放百分率随时间变化曲线。

由曲线可知：所制备的纳米药物中药物分子的释放在开始阶段时具有较快的释放速率，之后释放速度趋于平缓。并且药物分子的释放率与所处的pH环境具有相关性，呈现明显的pH敏感性。结果显示，在pH7.4的释放介质中，经过一个较快的药物释放阶段之后，释放速度逐渐趋于缓慢，24小时内累积释放率为30.9%。而在pH6.0的酸性环境中，前8h之内药物分子均具有较快的药物释放速度和药物释放率，8h的药物释放率为56.4%，24小时内累积释放率达到86.5%。

（二）纳米药物对体外培养的肝癌细胞HepG2生长抑制率的测定，步骤如下：

（104-1）胰蛋白酶消化处于对数生长期的肝癌细胞HepG2，制成密度为1×10⁵个/mL单细胞悬液，接种于96孔板中；

（104-2）细胞处于37℃，含有5%CO₂的湿润培养箱中继续培养24h后更换新鲜培养液，用浓度分别为0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL的雷公藤红素溶液干预肝癌细胞，作为阴性对照组；以相当于雷公藤红素浓度的纳米药物GC-QDs-Drug干预肝癌细胞HepG2并作为阳性组；并设立空白对照组；

（104-3）细胞在培养箱中继续分别培养24h、48h和72h，每个浓度点设三个复孔；

（104-4）培养时间终止后每孔加入5mg/mL的噻唑蓝（MTT）溶液20μL继续培养4h；

（104-5）吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，终止反应；

（104-6）将96孔板移入平板震荡器，避光水平震荡10min，使MTT还原产物完全溶解，然后用酶联免疫检测仪于492nm波长处测定每孔吸光度OD值，并以空白对照孔的OD值调零，结果以每组3复孔的均数±标准误差表示，实验至少重复3次；

细胞生长抑制率用下式计算：

细胞生长抑制率（%）=[1-(OD实验值/OD对照值)]×100%。

（104-7）各药物组对体外培养的肝癌细胞HepG2增殖影响的MTT检测的结果如表1所示。单纯雷公藤红素干预细胞时，对肝癌细胞HepG2具有一定的细胞毒性，且细胞毒性呈现剂量依赖性和时间依赖性。向细胞中加入纳米药物GC-QDs-Drug时，相对于对照试验，细胞的抑制率均明显增加，干预培养24h，48h以及72h之后，其IC₅₀值分别减小到2.90μg/mL、0.90μg/mL和0.34μg/mL，明显小于对照组实验的IC₅₀结果14.20μg/mL，3.91μg/mL和1.47μg/mL。

表1：

根据上述IC₅₀值的结果比较可以看出，该靶向纳米药物GC-QDs-Drug明显增强了雷公藤红素分子对肝癌细胞HepG2的毒性，提高了药物分子的药效。

（三）纳米药物促进肝癌细胞HepG2凋亡的体外测试实验，包括如下步骤：

（105-1）胰蛋白酶消化处于对数生长期的肝癌细胞HepG2，制成密度为1×105/mL单细胞悬液，接种于96孔板中；

（105-2）细胞处于37℃，含有5%CO₂的湿润培养箱中继续培养24h后更换新鲜培养液，分别用1μg/mL的雷公藤红素和纳米药物GC-QDs-Drug与肝癌细胞HepG2共孵育；

（105-3）孵育24h之后，弃去培养基，pH7.4的PBS冲洗2~3次之后，甲醇固定10min；

（105-4）弃去甲醇，晾干后，加DAPI工作液洗染色10min；

（105-5）弃去染色液，用pH值7.4的PBS溶液冲洗背景2~3次，再用蒸馏水冲洗，晾干后观察，荧光显微镜以340/380nm紫外光激发，观察、拍照；

（105-6）图2为各药物组促进肝癌HepG2凋亡的染色结果

由图可知：未经药物干预的空白组（A组）的细胞被染色之后，细胞内的荧光呈现均匀的分布。当细胞经过1.0μg/mL雷公藤红素（B组）干预之后，可以观察到细胞核内双链DNA的荧光强度明显增强，呈新月形，并有少量凋亡小体的出现。当细胞经过相同条件的纳米药物GC-QDs-Drug（C组）干预之后，可以观察到，细胞核中染色质浓集、大量凋亡小体的出现等。结果证明，纳米复合药物显著增强了药物分子的细胞毒性，促进了肝癌细胞的大量凋亡。

（四）激光共聚焦荧光显微镜研究荧光纳米药物GC-QDs-Drug对肝癌细胞HepG2的标记，步骤如下：

（106-1）胰蛋白酶消化处于对数生长期的肝癌细胞HepG2，制成密度为1×105/mL单细胞悬液，接种于35mm的薄层玻底（0.13~0.16mmthick，20mm×20mm）培养皿中；

（106-2）培养24h之后更换新鲜培养液，细胞分别用1μg/mL的雷公藤红素、5μg/mL的纳米探针GC-QDs和5μg/mL的纳米药物GC-QDs-Drug进行共孵育；

（106-3）孵育6h后弃掉培养基，用pH值7.4的PBS溶液轻轻洗涤细胞2次，最后将细胞置于PBS缓冲液环境中；

（106-4）将培养皿直接置于激光共聚焦荧光显微镜下观察，拍照。激光共聚焦荧光显微镜系统通过旋转圆盘激光系统（RevolutionXD，AndorTechnology，NorthernIreland）与Ti-E导致荧光显微镜（Nikon，Japan）组装而成；共聚焦图像通过电子倍增CCD（EMCCD）iXonDV885（Andor）以1004×1002pixels获得，扫描尺寸是177.3×177.5μm。通过声光可调滤光器（AOTF）调制405nm固态荧光激发量子点，使用585/40的发射光栅（Semrock，USA），60x油镜（Apo，NA.=1.49，Nikon）观察细胞。所得的图像经过iQv.1.10软件处理（Andor），结果见图3。

（106-5）将肝癌细胞纳米探针GC-QDs或者纳米复合药物GC-QDs-Drug共同孵育之后6小时之后，对肝癌细胞标记、成像的激光共聚焦实验结果如图3所示，通过共聚焦显微镜可以清楚地观察到不同肝癌细胞，对细胞进行荧光标记。与单纯纳米探针GC-QDs标记（B组）的结果相比，雷公藤红素分子负载在纳米探针表面构成的纳米药物GC-QDs-Drug并没有影响到纳米探针的荧光性质（C组），同时该试验条件下雷公藤红素干预组（A组）是不发荧光的，因此，新型的荧光纳米药物能够作为一种多模式的靶向荧光探针应用到肝癌细胞的标记、成像中，通过对肿瘤标志物GPC-3的标记、示踪，有望实现对肝癌发生、发展的准确治疗。

本发明通过简单可行的方法将天然产物单体负载到纳米探针的表面，相比于常用的口服自微乳、固体脂质纳米粒等几种剂型，该微纳结构的纳米药物更有利于药物的释放，提高药物利用率，并且表面修饰之后，纳米探针的荧光特性没有影响。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。