纳米金比色生物传感器快速检测热加工食品中丙烯酰胺的方法

摘要

本发明公开了一种纳米金比色生物传感器快速检测热加工食品中丙烯酰胺的方法，包括以下步骤：对待测的热加工食品进行提取丙烯酰胺的前处理，获得待测品的丙烯酰胺提取液；迈克尔加成反应；纳米金比色生物传感器检测体系的建立；将上述纳米金比色生物传感器待测品检测体系静置1min后，并加入96孔板，测定纳米金的紫外-可见吸收光谱；扫描的波长范围为400-750nm；以纳米金在520nm和650nm处的吸收峰之比(A520/650)作为信号输出，建立与丙烯酰胺浓度相关的响应曲线；从而确定线性范围和检测限。本发明针对热加工食品(薯片、曲奇等食品)中的致癌物丙烯酰胺进行检测。

说明书

技术领域

本发明属于食品快速检测领域，涉及对热加工食品中丙烯酰胺的检测，尤其是一种基于 迈克尔加成的纳米金比色生物传感器定量检测热加工食品中丙烯酰胺的检测方法。

背景技术

丙烯酰胺(Acrylamide，AA)是一种白色无味的晶状固体，分子量71.09，分子式为 CH₂CHCONH₂，沸点125℃，熔点84.8℃，易溶于水、乙醇、丙酮等极性溶剂。加热或紫外 照射易生成聚丙烯酰胺。

由于丙烯酰胺具有神经毒性、潜在的致畸性和致癌性，国际癌症机构(IARC)于1994年 将其列为“人类可能致癌物”，即2A类物质。动物实验表明，小鼠、兔、大鼠等的丙烯酰胺 经口半数致死量LD₅₀为100-150mg/kg。随后，欧洲委员会(EuropeanCommission)于2002年 将丙烯酰胺列为“2类致癌物”和“2类致畸物”。2010年，欧洲化学品管理局(EuropeanChemical Agency)也将丙烯酰胺列为“高度关注化学物”(asubstanceofveryhighconcern)。

2002年4月，瑞典国家食品管理局(NFA)和斯德哥尔摩大学的科学家经研究首次发现富 含淀粉的食物在经高温油炸或烧烤时能生成丙烯酰胺，且含量远远大于饮水中规定限量10 μg/kg(美国环保局，EPA)。2005年2月，食品添加剂联合委员会(JECAFA)第64次会议对 食品中的丙烯酰胺进行了第一次评估。通过对24个国家提供的食品中丙烯酰胺污染数据分析， 人的平均每天摄入量为1.0μg/kgbw，最高摄入量为4.0μg/kgbw；儿童摄入量是成人的2-3倍。 在所调查的食品中，丙烯酰胺含量较高的三类食品是土豆制品、咖啡及其类似制品和早餐谷 物类食品。根据丙烯酰胺平均摄入暴露边界(marginofexposure，MOE)和高摄入的暴露边 界，JECFA发出其可能造成人类健康损害的警告，并提出应尽快采取适当措施以降低食品中 丙烯酰胺的含量。

目前，检测丙烯酰胺的金标方法包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相 色谱-质谱联用(GC-MS)以及液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)。这些标准方法具有灵敏度 高、重复性好等优点，但检测成本高且需专业的操作，限制了其不能应用于现场、在线、实 时的检测。

随着技术的发展，一些快速的检测热加工食品中丙烯酰胺的方法被陆续提出：

(1)酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)

依靠抗原抗体特异性反应以及高效的酶催化反应，特异性好、灵敏度高。但是由于丙烯 酰胺是小分子物质，缺少强的抗原决定簇及免疫原性，需要与蛋白质偶联制备成完全抗原后， 才能进行免疫反应，增加了抗体筛选的成本及周期。

(2)电化学生物传感器(electrochemicalbiosensers)

丙烯酰胺可以和血红蛋白(Hb)N-末端缬氨酸的α-NH₂反应生成加成物，改变Hb构型， 增加了氧化还原中心到电极表面的空间位阻，从而改变固定在电极表面上Hb的电化学特性。 加入纳米材料增敏后，根据电流变化，检测丙烯酰胺含量。此方法检测线性范围广，检测限 低；但是该方法的缺点是所用工作电极不可重复利用。

(3)机器视觉法(computervision)

依据食品样品(如薯片)表面颜色与丙烯酰胺含量之间的关系，预测食品中丙烯酰胺的 含量。此方法简单易行，可实现在线检测，但是准确性较差，且受限制于食品样品的表面特 性。

(4)荧光法(Fluorescentmethod)

依据化学反应，改变荧光物质的荧光强度，建立荧光强度与丙烯酰胺含量之间的线性关 系，定量测定热加工食品中丙烯酰胺的含量。此方法成本低，时间短，但是仍需荧光仪检测 信号，不利于现场、在线检测。

纳米金比色生物传感器由于其简单、成本低、灵敏度高、响应快、可视化的信号输出等 优点而广泛应用于核酸、蛋白质、小分子、金属离子等的快速检测。当纳米金的直径与入射 光波长相当时，入射光电磁场诱导价带电子发生极化，从而产生对入射光能量的共振吸收， 即表面等离子体共振(SPR)吸收。纳米金共振吸收峰的位置与颗粒的大小、形貌及颗粒的 聚集状态密切相关。纳米金的特征SPR峰在510-550nm处，且随着粒子尺寸的增加或粒子间 距离的减小，吸收峰的位置发生红移。当颗粒间距小于纳米金的直径时，纳米金发生团聚， 颜色由红变蓝。纳米金的摩尔吸光系数为10⁸-10¹⁰L/molcm，可实现高灵敏检测。

巯-烯迈克尔加成反应已广泛应用于有机合成、功能化聚合等领域。在巯-烯加成反应中， 亲核试剂(如伯胺、磷烷)可促进巯基进攻缺电子的烯键，减少反应时间且副产物少。因此， 对于含有缺电子基团的丙烯酰胺，可采用巯-烯迈克尔加成反应对其进行识别；并利用巯基化 合物在纳米金比色法中的广泛应用，将纳米金的颜色变化作为信号输出。

本发明所涉及的术语解释如下：

纳米金：英文名为goldnanoparticles(AuNPs)，亦称胶体金(colloidalgold)，即金的微小 颗粒，直径一般在1-100nm。通过还原氯金酸可制备不同尺寸、粒径均一、性能稳定、具有 良好生物亲和性的纳米金。

迈克尔加成反应：也称为1，4-加成、共轭加成，是亲核试剂对α,β-不饱和羰基化合物 发生的β位碳原子发生的加成反应。

标准加入法(Standardadditionmethod)：亦称标准增量法或直线外推法，是仪器分析中常 用的一种用于检测复杂基质中未知样品含量的方法。通常的操作是在数个等分的试样中分别 加入成比例的标准试样并稀释到一定体积，绘制信号-浓度的标准曲线，该曲线与x轴交点的 绝对值即为待测物的浓度。该方法可最大程度的减小检测体系中基质的干扰。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种纳米金比色生物传感器快速检测热加工食品中丙烯 酰胺的方法，该方法操作简单、成本低、灵敏度高，检测限可达到μg/kg级。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种纳米金比色生物传感器快速检测热加工食品中 丙烯酰胺的方法(基于巯烯迈克尔加成的纳米金比色生物传感器定量检测热加工食品中丙烯 酰胺的方法)，包括以下步骤：

1)、对待测的热加工食品进行提取丙烯酰胺的前处理，获得待测品的丙烯酰胺提取液；

2)、迈克尔加成反应，包括以下步骤：

①、以浓度为2mmolL^-1的磷酸氢二钠缓冲液(pH＝9.0)作为迈克尔加成反应的缓冲液；

②、将谷胱甘肽溶于上述缓冲液中，控制谷胱甘肽的浓度为80μmolL^-1，得谷胱甘肽溶 液；

③、将丙烯酰胺按照梯度浓度溶于上述2mmolL^-1的磷酸氢二钠缓冲液(pH＝9.0)中， 得梯度浓度的丙烯酰胺的磷酸氢二钠缓冲液；

将待测品的丙烯酰胺提取液均匀的分成5体积份，每份中加入1％体积比的梯度浓度的丙 烯酰胺的磷酸氢二钠缓冲液，得待测品梯度反应体系(5种)；备注说明：该待测品梯度反应 体系(5种)中，丙烯酰胺的浓度例如分别为0、2、4、6、8μmolL^-1；

④、将待测品梯度反应体系分别进行如下处理：

先将谷胱甘肽溶液(80μmolL^-1)与待测品梯度反应体系按照1:1的体积比混合，然后加 入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)水溶液混合均匀后作为待测品反应液，所述待测品反应 液中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的终浓度为2μmolL^-1；所述待测品反应液于室温反应 2.5h，得反应后待测品混合溶液；TCEP的作用是作为亲核试剂催化反应；

3)、纳米金比色生物传感器检测体系的建立，包括以下步骤：

①、配制浓度为2mmolL^-1的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝3.37)；

②、将纳米金溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，得纳米金溶液，备用；所述纳米金溶液 中纳米金的17nmolL^-1，平均粒径为12.83nm；

备注说明：可采用将现有的纳米金(溶液状)离心(12000rpm,15min)，弃上清液，从 容获得所需的纳米金；

③、在90μL纳米金溶液中加入10μL反应后待测品混合溶液，混合均匀；得纳米金比色 生物传感器待测品检测体系；

4)、将上述纳米金比色生物传感器待测品检测体系静置1min后(观察纳米金颜色变化)， 并加入96孔板，测定纳米金的紫外-可见吸收光谱；扫描的波长范围为400-750nm；

备注说明：可通过肉眼看出纳米金颜色变化，但不能定量；可通过检测上述梯度反应后 待测品溶液(有5个样品)得到的信号(A_520/650)，构建标准加入法来测得食品样品中实际丙 烯酰胺的含量；

5)、以纳米金在520nm和650nm处的吸收峰之比(A_520/650)作为信号输出，建立与 丙烯酰胺浓度相关的响应曲线(从而确定线性范围和检测限)。

作为本发明的纳米金比色生物传感器快速检测热加工食品中丙烯酰胺的方法的改进： 所述步骤5)，经线性回归得线性方程为y＝0.16x+0.63(r²＝0.92)，y代表A_520/650(即纳米 金在520nm和650nm处吸收峰之比)，x代表向待测品种加入的丙烯酰胺标准溶液浓度(即 上述提到0、2、4、6、8μmolL^-1)；

令y＝0，x的绝对值即为步骤1)所得的待测品(例如薯片)的丙烯酰胺提取液中的丙 烯酰胺的含量，经过相应换算，得到待测品(例如薯片)中丙烯酰胺的含量。

即，在本发明中，

先将谷胱甘肽溶液与丙烯酰胺标准溶液按照1:1的体积比混合，然后加入三(2-羰基乙基) 磷盐酸盐(TCEP)溶液混合均匀后作为标准反应液；所述标准反应液中三(2-羰基乙基)磷盐 酸盐(TCEP)的终浓度为2μmolL^-1，

所述标准反应液于室温反应2.5h，得反应后标准混合溶液；

TCEP的作用是作为亲核试剂催化反应；

所述丙烯酰胺标准溶液中，丙烯酰胺的浓度为0、1、2、5、8、10、20、50、80μmolL^-1。

本发明针对热加工食品中的致癌物丙烯酰胺进行检测。检测范围：本发明主要应用于薯 片、曲奇等食品。

本发明的方法属于一种快速、可视化、定量检测热加工食品中丙烯酰胺含量的检测方 法。

本发明根据纳米金光学特性及丙烯酰胺与巯基化合物易发生巯-烯迈克尔加成反应的原 理，设计本发明所述的检测方法。由于巯基活性基团的存在，谷胱甘肽的解毒作用成为人体 代谢丙烯酰胺的主要途径。备注说明：谷胱甘肽中含有-SH(即巯基基团)，谷胱甘肽和丙烯 酰胺反应就是谷胱甘肽的巯基和丙烯酰胺的碳碳双键反应。在碱性条件下，谷胱甘肽的巯基 可与丙烯酰胺的双键发生迈克尔加成反应，形成C-S键。同时，当pH＝3左右时，谷胱甘肽 带弱的正电荷，当其吸附于纳米金表面时，降低了纳米金表面的电负性，使纳米金发生团聚， 颜色由红色变成蓝紫色。而谷胱甘肽与丙烯酰胺反应后，巯基被消耗，无法吸附于纳米金表 面，使得纳米金依旧保持分散状态并呈现红色。因此，可依据纳米金的颜色变化可视化地判 断丙烯酰胺的浓度(备注说明：随着丙烯酰胺浓度的增加，纳米金颜色由蓝紫色变为红色)。 同时，也可测定纳米金的紫外-可见吸收光谱，将其在520nm和650nm吸收峰之比(A_520/650) 作为信号输出，定量检测丙烯酰胺的含量。该方法具有简单、易操作、可视化等优点，有望 应用于丙烯酰胺的现场快速检测。

采用本发明的方法检测热加工食品中的致癌物丙烯酰胺，具有如下优点：

1、原理新颖，区别于传统的检测方法，此发明首次采用比色生物传感器对丙烯酰胺进行 检测，可直接通过肉眼观察结果；即，通过步骤3)的1min后观察纳米金颜色变化，就能实 现可直接通过肉眼观察结果。

2、检测时间短，从加样到检测出信号，只需2.5h；

3、检测成本低，与标准的液相色谱-质谱联用技术相比，单样检测成本大大降低；

4、该方法可用于现场快速检测，为检测热加工食品中丙烯酰胺的现场检测人员提供初步 的测定结果。

综上所述，本发明通过“1min后观察纳米金颜色变化”能得知初步测定结果；通过后续 的“纳米金在520nm和650nm处的吸收峰之比(A_520/650)与浓度所对应的响应曲线中，”能 得知“待测对象”中丙烯酰胺的具体含量。即，肉眼观察为半定量测定；响应曲线为定量测 定。

附图说明

图1是基于迈克尔加成的纳米金比色生物传感器检测丙烯酰胺的原理示意图；

图1(a)代表谷胱甘肽与丙烯酰胺迈克尔加成反应方程式；

图1(b)代表纳米金比色生物传感器检测丙烯酰胺的原理。

图2是亲核试剂催化的巯-烯迈克尔加成反应验证图。

图3是纳米金比色生物传感器检测丙烯酰胺的标准曲线图。

图4(a)代表薯片中提取丙烯酰胺的前处理步骤。

图4(b)代表标准加入法检测薯片样品中丙烯酰胺的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1、以市售薯片为例说明本发明，按下述操作过程进行分析检测。

1.薯片样品前处理

薯片经粉碎机充分粉碎成粉末状，于-20℃储存备用。称取1±0.1g薯片粉末于50mL离 心管中，加入10mL0.3％(体积％)甲酸溶液，涡旋混匀1min后，在10000rpm、4℃条件 下离心10min，弃去上层白色油脂层，取上清液。利用离心所得的残渣重复上述提取步骤， 混合两次上清液(共计约20ml)。

备注说明：离心后，自然形成3层，分别是位于最上层的白色油脂层、位于中间层的上 清液、位于底部的残渣；

采用固相萃取小柱将样品进行纯化。OasisHLB固相萃取小柱先分别用3mL甲醇和3mL 超纯水活化、平衡后，加入3mL提取的样品溶液(即，合并后的上清液)，再用6mL超纯 水洗脱(流速为25μL/秒)，并收集洗脱液。将洗脱液用氮吹仪(约40℃)浓缩至0.5mL， 以备检测。

2.亲核试剂催化的迈克尔加成反应

配制浓度为2mmolL^-1的磷酸氢二钠缓冲液(pH＝9.0)作为迈克尔加成反应的缓冲液。

称取还原型谷胱甘肽溶于上述2mmolL^-1的磷酸氢二钠缓冲液(pH＝9.0)中，配制成浓 度为80μmolL^-1的谷胱甘肽溶液溶液，现配现用。

将丙烯酰胺溶于上述2mmolL^-1的磷酸氢二钠缓冲液(pH＝9.0)中，得不同浓度的丙烯 酰胺标准溶液(0，1，2，5，8，10，20，50，80μmolL^-1)。

对上述不同浓度的丙烯酰胺标准溶液(0，1，2，5，8，10，20，50，80μmolL^-1)分别 进行如下处理：

取200μL谷胱甘肽溶液与200μL丙烯酰胺标准溶液混合，并加入亲核催化剂三(2-羰基 乙基)磷盐酸盐(TCEP)水溶液(浓度为80μmolL^-1)混合均匀后作为标准反应液，从而使 标准反应液中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的终浓度为2μmolL^-1；室温反应2.5h；得 反应后标准混合溶液，备用。

3.标准加入法检测薯片中丙烯酰胺含量

将0.5mL的待测样等分成5份，分别按照1％(v/v)的比例向其中加入不同浓度的丙烯 酰胺的磷酸氢二钠缓冲液；得待测品梯度反应体系，该待测品梯度反应体系中，丙烯酰胺的 浓度分别为0、2、4、6、8μmolL^-1；用于检测。

将上述待测液与等体积的80μmolL^-1谷胱甘肽溶液混合，并加入终浓度为2μmolL^-1的 三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶液作为亲核试剂催化该反应。混合均匀后，室温反应2.5 h。

取10μL上述反应后的混合溶液加入90μL溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的纳米金溶液 中，混合均匀。静置1min后，加入96孔板，测定纳米金紫外-可见吸收光谱。波长的扫描范 围为400-750nm。

备注说明：配制浓度为2mmolL^-1的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝3.37)；离心(12000 rpm,15min)纳米金(溶液状)，弃上清液后，将纳米金复溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中， 得纳米金溶液，备用；所述纳米金溶液中纳米金的17nmolL^-1，平均粒径为12.83nm。

以纳米金在520nm和650nm处的吸收峰之比(A_520/650)作为信号输出，建立与丙烯酰 胺浓度相关的标准范围，确定线性范围和检测限。

绘制A_520/650与所添加丙烯酰胺标准品浓度的响应曲线，经线性回归得线性方程为y＝ 0.16x+0.63(r²＝0.92)，y代表A_520/650(即纳米金在520nm和650nm处吸收峰之比)，x代 表向待测品种加入的丙烯酰胺标准溶液浓度(即上述提到0、2、4、6、8μmolL^-1)；令y＝0， x的绝对值即为薯片样品中丙烯酰胺的含量。计算所得，丙烯酰胺含量为3.93μmolL^-1，即 0.9315mgkg^-1。

备注说明：换算公式为：3.93μmolL^-1÷6×20×71.09gmol^-1＝931.3μgg^-1。

另，上述线性方程是通过纳米金比色生物传感器待测品检测体系获得的。而标准检测体 系即检测丙烯酰胺的标准溶液(0、1、2、5、8、10、20、50、80μmolL^-1)，检测的是纯的 丙烯酰胺溶液。构建此检测体系的目的是考察比色法检测丙烯酰胺的线性范围，确定该方法 的检测限和线性范围能够适用于食品中丙烯酰胺的检测。

验证实验：将实施例1所述的薯片样品，按照目前公认的检测精度高的UPLC-MS/MS(液 质联用)法进行检测，所得浓度为853.5±45.0μgg^-1。

对比例1、将实施例1中纳米金比色生物传感器检测体系的建立所用的“2mmolL^-1的柠 檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝3.37)；”改成“2mmolL^-1的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝ 5.0)”，其余等同于实施例1。

所得结果为：当pH>4.0，谷胱甘肽无法团聚纳米金，因此比色生物传感器构建失败， 无法进行后续的操作。

对比例2、将实施例1中迈克尔加成反应中的“2mmolL^-1的磷酸氢二钠缓冲液(pH＝9.0)” 改成“2mmolL^-1的磷酸氢二钠缓冲液(pH＝6.0)”

其余等同于实施例1。

所得结果为：酸性环境既不利于谷胱甘肽的巯基进攻丙烯酰胺的不饱和双键，也不利于 TCEP的催化，巯-烯迈克尔加成反应效率低。因此，缓冲液pH值需大于8.5。在2.5h内， 反应不完全。

对比例3-1、将实施例1中的“所述待测品反应液中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的 终浓度”由“2μmolL^-1”改成“20μmolL^-1”，其余等同于实施例1。

所得结果为：过量的TCEP还原谷胱甘肽的巯基，导致巯-烯迈克尔加成反应无法进行。

对比例3-2、将实施例1中的“所述待测品反应液中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的 终浓度”由“2μmolL^-1”改成“0.4μmolL^-1”，其余等同于实施例1。

所得结果为：过低的TCEP催化效果有限，巯-烯迈克尔加成反应效率低。

对比例4-1、将实施例1中“纳米金与反应后的混合液体积比”由“9:1”改成7:3；其余 等同于实施例1。

所得结果为：纳米金体系pH升高，导致谷胱甘肽无法团聚纳米金，比色法生物传感器 构建失败。

对比例4-2、将实施例1中“纳米金与反应后的混合液体积比”由“9:1”改成11:1；其 余等同于实施例1。

所得结果为：所加入纳米金体系中的谷胱甘肽含量降低，导致纳米金团聚不完全，降低 检测体系灵敏度。

对比例5、将实施例1中纳米金比色生物传感器检测体系的建立所用的“2mmolL^-1的柠 檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝3.37)；”改成“20mmolL^-1的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝ 3.37)，其余等同于实施例1。

所得结果为：缓冲液盐离子浓度太高，导致纳米金团聚，即不加如谷胱甘肽时也团聚， 无法构建比色生物传感器。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。