矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对1,3-二氯-2-丙醇的生殖毒性的干预作用

摘要

本发明公开了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1,3-二氯-2-丙醇引起的雄性生殖疾病的药物中的应用。本发明研究结果显示，C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞活性下降、细胞形态损伤及细胞凋亡率升高等具有显著的抑制作用，而且C3G通过促进StAR、3β-HSD等关键蛋白的表达干预1,3-DCP暴露的R2C细胞孕酮合成，同时，C3G还通过降低1,3-DCP暴露的R2C细胞内ROS，进一步抑制MMP等，干预1,3-DCP造成的R2C细胞凋亡及孕酮表达功能损伤。本发明的研究成果能够对人类预防及治疗1,3-二氯-2-丙醇引起的雄性生殖疾病提供重要依据，研究意义重大。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对1,3-二氯-2-丙醇暴露的R2C细胞生殖毒性的干预作用。

背景技术

近年来，食品中的污染物氯丙醇在全球范围内已经引起了越来越多的关注，自1999年在香港出口的酱油中调查出氯丙醇以后，对于这种化学污染物的调查研究更加引起人类的重视。氯丙醇广泛存在于食物中，尤其是酱汁和调味品如酱油和蚝油。目前已知氯丙醇可以产生于食品加工的各个环节中或存储过程中，其中在毒性水平方面，最重要的两种氯丙醇形式为1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）和3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）。粮农组织/世卫组织联合专家委员会在1993年宣布，因为它的致癌性，1,3-DCP不允许作为食品添加剂，在食品加工过程中应使其含量水平降低至最低。1,3-DCP被曝光为基因毒性致癌物。另外，1,3-DCP已经被英国委员会评估为食品中的致癌性化学物质，可能是生物体的诱变物质，氯丙醇对人类的危害作用已经引起广泛关注。

有研究报道表明，1,3-DCP毒性作用的主要靶点是生殖系统和肾脏，如果长期摄入将导致生物体体重降低、雄性不育和肾功能衰退等一系列的危害作用，甚至会造成生命危险。此外，还有研究者针对它在生殖系统方面的危害作用展开了探索研究。本发明人在前期研究实验中发现1,3-DCP可以造成R2C细胞凋亡及功能的下降，并探索了引起这些反应的具体机制。总而言之，1,3-DCP具有肝、肾脏毒性、生殖系统毒性和致癌性，对人体和环境的危害不容忽视。

因此，对1，3-DCP危害机制以及防控措施的相关研究，具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有1,3-DCP的危害机制研究和防控措施的不足，提供矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）的一种新应用，即C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞生殖毒性的干预作用，本发明研究表明，对于1,3-DCP所引起的R2C细胞形态损伤及凋亡现象，C3G能够起到明显的保护作用，同时，C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞孕酮分泌量具有显著的保护干预效果。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1,3-二氯-2-丙醇引起的生殖疾病的药物中的应用。优选地，所述生殖疾病是指雄性生殖疾病。

优选地，所述生殖疾病是指1,3-二氯-2-丙醇对生殖细胞的生殖毒性。

更进一步优选地，所述生殖细胞为雄性生殖细胞。更优选地，所述雄性生殖细胞R2C细胞。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1,3-二氯-2-丙醇所引起的生殖细胞损伤和/或生殖细胞凋亡药物中的应用。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备抑制1,3-二氯-2-丙醇所引起的生殖细胞孕酮分泌量减少的药物中的应用。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备抑制1,3-二氯-2-丙醇所引起的生殖细胞ROS升高、MMP损伤和/或cAMP水平降低的药物中的应用。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备上述药物中的应用均在本发明的保护范围之内。优选地，上述生殖细胞为R2C细胞。

本发明首先采用MTT法筛选1,3-DCP及C3G的作用浓度，并检测C3G对1,3-DCP的生殖毒性是否有抑制作用及起抑制作用的浓度梯度，通过MTT法筛选C3G的浓度范围区间，最终确定合适的浓度梯度；放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）检测R2C细胞孕酮的合成和分泌情况来探索C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞的功能损伤是否有抑制作用；化学发光法（chemiluminescence，CL）检测细胞内活性氧（reactieoxygenspecies，ROS）以及环腺苷酸（cyclicadenosinemonophosphate，cAMP）的水平；流式细胞仪（flowcytometry，FCM）检测细胞凋亡及线粒体膜电位（mitochondrialmembranepotential，MMP）变化情况；Westernblotting法检测StAR、3β-HSD等在孕酮合成中起调控作用的蛋白表达量。

实验结果：MTT结果表明，在初步确定的几个浓度中，其中2mmol/L的1,3-DCP能使细胞活性显著下降，在所选择的5、10、20、40μmol/L四个浓度中，当C3G浓度为10～40μmol/L时，表现出对1,3-DCP生殖毒性的干预作用，能够显著降低1,3-DCP对细胞活性的损伤。细胞形态及细胞凋亡率结果表明，对于1,3-DCP所引起的细胞形态损伤及凋亡现象，C3G能够起到明显的保护作用。孕酮结果表明，1,3-DCP暴露下的R2C细胞孕酮量在4、24h时与对照组相比均显著降低，而20、40μmol/L浓度的C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞孕酮分泌量具有显著保护干预效果。ROS、MMP及cAMP检测结果表明，C3G对于1,3-DCP引起的R2C细胞ROS变化、MMP损伤及cAMP水平变化均能起到一定的保护干预作用。Westernblotting结果，对R2C细胞孕酮合成途径中起关键作用的StAR、3β-HSD的蛋白表达水平进行检测，1,3-DCP组的StAR、3β-HSD水平均显著降低，而与1,3-DCP组相比，20μmol/LC3G干预后的StAR蛋白及20、40μmol/LC3G干预后的的3β-HSD蛋白的表达量均显著升高。

有上述实验结果我们得出以下结论：C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞中cAMP具有显著促进，同时通过降低R2C细胞中ROS水平来抑制细胞内MMP下降，而促进cAMP表达和抑制MMP的下降可以促进将胆固醇从线粒体膜外向膜内转运，并提高1,3-DCP暴露的R2C细胞孕酮合成通路中的关键调节蛋白StAR、3β-HSD的表达进而促进孕酮合成。C3G可能通过保护MMP对1,3-DCP暴露的R2C细胞凋亡具有显著的抑制作用。

总之，C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞活性下降、细胞凋亡及孕酮功能表达损伤等具有较好的营养干预保护作用。

本发明具有以下有益效果：

本发明的研究成果对于了解花色苷的功能及发挥生殖毒性干预功能的机制等方面有一定的意义。

花色苷不仅有保健功能，而且还对一些毒性物质对生物体的危害具有重要的预防治疗作用，对于花色苷对1,3-二氯-2-丙醇毒性的干扰作用及其作用机制的探索和研究，能够对人类预防及治疗1,3-二氯-2-丙醇引起的雄性生殖疾病提供重要依据，研究意义重大。

附图说明

图1为本研究的技术路线图。

图2为各浓度C3G及1,3-DCP作用后的细胞活性率。

图3为各浓度C3G及1,3-DCP作用下R2C细胞的细胞活性率。

图4为各浓度C3G及1,3-DCP对细胞形态的影响（400×）。

图5为各浓度C3G及1,3-DCP对细胞凋亡的影响。

图6为各浓度C3G及1,3-DCP作用下的细胞凋亡率。

图7为各浓度C3G及1,3-DCP刺激4h或24h后对R2C细胞孕酮合成的影响（纵坐标单位：ng/10⁶细胞）。

图8为各浓度C3G及1,3-DCP刺激不同时间后对ROS的影响。

图9为C3G及1,3-DCP对R2C细胞MMP的影响。

图10为C3G及1,3-DCP对R2C细胞MMP的影响作用分析。

图11为C3G与1,3-DCP作用24h后孕酮合成途径关键蛋白表达水平。

图12为各浓度C3G及1,3-DCP作用24h对cAMP水平的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本研究研究技术路线如附图1所示。本研究预选用抗氧化能力较强的花色苷（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，C3G）为目标物，研究C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞损伤的可能解毒途径和机制。

本实验采用睾丸间质瘤细胞R2C作为实验模型，以实验探索的1,3-DCP对R2C细胞活性抑制作用较明显的浓度（IC₅₀：2mmol/L）对细胞进行致毒造模，然后通过MTT法来筛选C3G的适宜浓度，采用荧光显微镜观察细胞形态及大小变化。进而通过研究R2C细胞孕酮合成能力、ROS、MMP和cAMP的水平变化等来探讨C3G对1,3-DCP毒性作用的干预作用及具体机制。最后通过Westernblotting法来检测孕酮合成过程中3β-HSD、StAR等的量。

另外，以下实施例中，所有检测所得结果都是用均数±标准差（x±s）进行表示，并用GraphpadPrism5软件对数据进行统计分析，*p＜0.05、**p＜0.01及***p＜0.001表示结果有统计学意义。

实施例1MTT法筛选1,3-DCP对R2C细胞作用浓度以及C3G干预浓度

1、MTT法筛选1,3-DCP对R2C细胞的作用浓度

（1）实验方法

1）细胞培养至对数期，用胰酶消化，1500r/min转速下离心5min，将沉淀稀释为4×10⁴个/mL，铺于96孔板，每个孔内约加200μL悬液；

2）24h后，在相应各组中分别加入不同浓度的1,3-DCP，各组浓度分别为1、2、4、6、8mmol/L，每组5个重复孔，每组重复3次，并设置无细胞的空白组；

3）24h后吸去液体，每孔加10μL5mg/mL的MTT试剂，放于37℃培养箱；

4）MTT作用4h后，去除孔内液体，换成200μL的DMSO试剂，将96孔板置于摇床摇匀10min，酶标仪在570nm波长下检测各组的吸光值；

5）通过Graphpad软件分析各浓度的1,3-DCP对R2C细胞活性的影响（用于分析的各孔吸光值均应减去相应空白组的吸光值），并通过分析比较来确定后续的造模实验中所采用的1,3-DCP浓度。

（2）结果显示，在1～8mmol/L的范围内选择1、2、4、6、8mmol/L几个浓度的1,3-DCP作用于处于生长对数期的各组R2C细胞，作用24h后检测细胞活性结果表明，当1,3-DCP浓度从1mmol/L升高到8mmol/L时，与对照组相比细胞活性随1,3-DCP浓度增大而降低，且2mmol/L的1,3-DCP使细胞活性率下降48.7%。因此在后续的C3G干预作用研究实验中，采用2mmol/L浓度的1,3-DCP作用于R2C细胞对其进行造模。

2、MTT法筛选C3G干预浓度

（1）实验方法

1）细胞培养及接种细胞培养至对数期，消化、离心后，将沉淀稀释为4×10⁴个/mL，铺于96孔板，每个孔内约加200μL悬液；

2）96孔板接种细胞24h，于第一个板的相应组内加经F12培养液稀释的C3G溶液，除对照组外，使每组每孔C3G终浓度分别为1、5、10、20、50、100μmol/L；在第二个96孔板中加入用F12培养液稀释的C3G溶液及1,3-DCP溶液，除对照组外，使每组每孔C3G终浓度分别为1、5、10、20、50、100μmol/L，且每组每孔的1,3-DCP浓度为2mmol/L；重复孔及空白组的设置同步骤（1）2）；

3）各浓度C3G及1,3-DCP作用24h以后，去除液体，换成10μL的MTT试剂，放在37℃；

4）MTT作用4h后去除孔内的液体，换成200μL的DMSO试剂，将孔板放在脱色摇床上摇匀10min左右，然后检测各组吸光值；

5）通过Graphpad软件分析C3G对R2C细胞活性的作用及对1,3-DCP的抑制情况（用于分析的各孔吸光值均应减去相应空白组的吸光值），通过分析比较选择合适的C3G浓度梯度（5、10、20、40μmol/L）用于后续实验。

（2）结果如附图2所示。MTT结果表明，1,3-DCP作用后使细胞活性显著下降，对细胞活性的抑制率接近50%；1～100μmol/L浓度的C3G对1,3-DCP所引起的细胞活性下降均起到了干预保护作用，使细胞活性上升。其中，10、20μmol/L浓度的C3G对1,3-DCP的干预作用显著，结果有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01）。

实施例2MTT法测定C3G在细胞活性方面对1,3-DCP的抑制作用

1、实验方法

（1）细胞培养及接种细胞培养至对数期，用胰酶消化，1500r/min转速下离心5min，将沉淀稀释为4×10⁴个/mL，铺于96孔板，每个孔内约加200μL悬液。

（2）96孔板接种细胞24h后，在其中一个96孔板的相应组中分别加入用F12培养液稀释的C3G溶液（除对照组外），使每组每孔C3G终浓度分别为5、10、20、40μmol/L。另一个96孔板中加入F12培养液稀释的C3G溶液和1,3-DCP溶液，除对照组外，使其它组C3G分别为5、10、20、40μmol/L，每组每孔的1,3-DCP浓度为2mmol/L。复孔及空白组的设置同实施例1中步骤1（2）。

（3）各浓度C3G及1,3-DCP刺激R2C细胞24h后，吸去上清，换成10μL5mg/mL的MTT试剂，放在37℃。

（4）MTT作用4h，各孔换成200μLDMSO，置于脱色摇床上摇匀10min，酶标仪测定吸光值。

（5）通过Graphpad软件分析各浓度组C3G对1,3-DCP的干预作用程度（用于分析的各孔吸光值均应减去相应空白组的吸光值）。

2、采用根据上述实验所确定的浓度分别为5、10、20、40μmol/L的C3G作用于处于生长对数期的各组R2C细胞，待其作用24h，测定细胞活性。并采用浓度为5、10、20、40μmol/L的C3G及2mmol/L的1,3-DCP作用于R2C细胞24h，采用MTT法测定细胞活性。MTT检测结果如附图3所示，当C3G浓度为20、40μmol/L时，能显著抑制1,3-DCP所引起的R2C细胞活性下降，且结果有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01）。

实施例3荧光显微镜检测C3G对1,3-DCP造成R2C细胞形态变化的干预作用

1、实验方法

（1）将对数期细胞处理重悬后，并稀释细胞，6孔板内每孔接种1mL（约2万细胞）。

（2）24h后，加F12稀释的C3G溶液及1,3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40μmol/L，每组每孔的1,3-DCP浓度为2mmol/L。

（3）各浓度C3G及1,3-DCP刺激24h，用荧光显微镜查看细胞形态并拍照。

2、荧光显微镜观察细胞形态如附图4所示。结果表明，与对照组细胞相比，在2mmol/L的1,3-DCP作用下，R2C细胞形状明显变小且细胞数目减少，细胞由不规则的多边形变成椭圆状，细胞变亮且周围的丝状物质增多，表明细胞的贴壁能力减弱。在加入不同浓度的C3G进行干预后，对于1,3-DCP所造成的细胞形态、数目及贴壁能力等各方面影响产生了不同程度的抑制作用，尤其是当C3G浓度为20、40μmol/L时，C3G作用效果更显著。

实施例4流式细胞术检测C3G对1,3-DCP诱导的细胞凋亡的抑制作用

1、实验方法

（1）将对数期细胞处理重悬后，并稀释细胞，6孔板内每孔接种1mL（约2万细胞）；

（2）24h后，加F12稀释的C3G溶液及1,3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40μmol/L，每组每孔的1,3-DCP浓度为2mmol/L；

（3）24h后收集细胞，PBS重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清；

（4）加200μLBindingBuffering，混匀，加5μLAnnexinV-FITC，室温孵育10min（需避光）；

（5）孵育完毕后，1000r/min离心5min，弃上清；

（6）加200μLBindingBuffering重悬细胞，加5μLPI后，直接上机检测。

2、结果如附图5和6所示，1,3-DCP刺激细胞24h后，细胞凋亡率显著升高，而加入不同浓度C3G干预后细胞凋亡比率明显降低，且当C3G浓度为10、20、40μmol/L时，对1,3-DCP的干预作用显著，统计结果具有统计学意义（**P＜0.01，***P＜0.001）。上述结果说明C3G能够降低1,3-DCP引起的凋亡现象，且干预效果与其剂量相关。

实施例5RIA法检测C3G对1,3-DCP造成R2C细胞孕酮合成影响的干预作用

1、细胞上清收集

（1）将培养至对数期的R2C细胞接种于6孔板内，每孔接种1mL（约2万细胞）；

（2）细胞培养24h后，分别换上含终浓度为2mmol/L浓度的1,3-DCP及5、10、20、40μmol/LC3G的培养液。

（3）加药刺激4h或者24h收集细胞上清，在400×g转速下离5min，将上清液装到1mLEp管，保存于-20℃；

（4）根据试剂盒说明书上的具体说明，检测事先所收集的各组细胞上清中的孕酮量：

1）孕酮标准品配制：用超纯水溶解标准品，使溶解后S0～S6的浓度依次为：0，0.2，1，3，10，30，100ng/mL；

2）质控样品配制：将各质控品分别加到已加0.5mL水的管内，并待15min后用；

3）加标准品、质控品、待测品各50μL到5mL干净管中，随后在每管加入100μL¹²⁵I（碘125）；

4）将兔抗孕酮抗体在上述每个管均加100μL，4℃过夜；

5）将驴抗兔免疫分离剂在各管均加0.5mL，轻轻晃匀，静放15min，在3500rpm/min转速下，离心15min；

6）去除除沉淀外的上层液体，用γ计数仪检测；

7）得出数据后，对各组孕酮含量结果进行统计分析。

2、检测结果如附图7所示，1,3-DCP刺激细胞4h后，细胞孕酮分泌量降低，此时各组的孕酮合成量变化不大，C3G对1,3-DCP作用的干预效果不明显。24h结果与4h结果相比，1,3-DCP使细胞孕酮分泌量显著降低，而C3G对1,3-DCP作用的干预作用也显著增强。其中，20、40μmol/L浓度的C3G使孕酮分泌量显著升高（*P＜0.05）。

实施例6荧光酶标仪测定C3G对1,3-DCP引起的ROS变化的影响作用

1、实验方法

（1）DCFH-DA溶液的配制：按照1:1000的比例将DCFH-DA用F12培养液进行稀释，使终浓度为10μmol/L；

（2）加药处理：24h后，加F12稀释的C3G溶液及1,3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40μmol/L，每组每孔的1,3-DCP浓度为2mmol/L；

（3）加药后立即或24h后，吸出上清液，加入1mLDCFH-DA稀释液（检测细胞内ROS水平连续变化情况时，加药后立即进行下一步操作，且每隔10min检测一次ROS水平）；

（4）37℃放置20min，然后用F12培养液洗3次，以充分除掉未被吸收利用的剩余DCFH-DA；

（5）消化、离心、重悬细胞后，将细胞接种到96孔板，各个孔均加200μL，设置4个复孔。荧光酶标仪检测最终ROS水平（激发波长：488nm，发射波长：525nm）。

2、荧光酶标仪检测ROS水平结果如附图8所示。

加入各浓度C3G及1,3-DCP之后，立即检测ROS水平。结果表明，1,3-DCP组的ROS水平稍有上升，而加入各浓度C3G干预后，各组的ROS水平迅速下降，且和1,3-DCP组比，结果有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。加药4h后检测ROS结果表明，随着时间延长，1,3-DCP使ROS水平降低程度增大，各浓度C3G及1,3-DCP组的ROS水平与立即检测时相比升高，但仍然显著低于对应的1,3-DCP组，结果具有统计学意义（*P＜0.05）。采用1,3-DCP单独作用于R2C细胞及1,3-DCP与20μmol/L的C3G共同作用于R2C细胞对细胞内的ROS水平进行时间连续性检测结果表明，在2h内随着时间的延长，1,3-DCP使细胞内ROS水平逐渐升高，而在C3G的干预作用下，R0S水平与1,3-DCP单独作用时相比显著降低。

实施例7FCM检测C3G对1,3-DCP造成R2C细胞MMP变化的影响

1、实验方法

（1）细胞培养、接种将对数期细胞接种于6孔板内，每孔接种1mL（约2万细胞）；

（2）加药24h后，加F12稀释的C3G溶液及1,3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40μmol/L，每组每孔的1,3-DCP浓度2mmol/L；

（为3）加药刺激4h后，400×g转速5min，取1×10⁶细胞，重悬于0.5mL培养基中；

（4）JC-1工作液，按照说明书方法，配一定体积的工作液，完成后剧烈震荡至充分溶解；

（5）在每管中加0.5mL的JC-1染色工作液，混合完全后在37℃静置20min；

（6）配制染色缓冲液（1×），将染色缓冲液（5×）按照1:4的比例与超纯水混合，放在冰盒中；

（7）结束后，4℃、600×g转速离心5min，去掉上层液体；

（8）以400μL的缓冲液（1×）吹打均匀细胞沉淀，用流式细胞仪测定各组的MMP。

2、利用流式细胞仪检测R2C细胞线粒体膜电位损伤情况。各浓度C3G及2mmol/L的1,3-DCP作用于细胞4h的MMP损伤检测结果如附图9和10所示，1,3-DCP作用后的MMP损伤比率显著升高，与1,3-DCP组相比，各浓度C3G干预作用下的细胞MMP损伤比率均降低。其中，当C3G浓度为10、20、40μmol/L时结果有显著性差异。

实施例8Westernblotting测定C3G对1,3-DCP引起的R2C细胞孕酮合成关键调节基因StAR、3β-HSD蛋白表达变化的影响

1、细胞总蛋白的提取

（1）R2C细胞培养、接种将对数期细胞接种于6孔板内，每孔接种1mL（约2万细胞）；

（2）加药培养24h，加F12稀释的C3G溶液及1,3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40μmol/L，每组每孔的1,3-DCP浓度为2mmol/L；

（3）24h后，400×g离心5分钟后，弃去上层液体；

（4）在每组中先加入30～40μL的裂解液（RIPA及PMSF以100：1的比例混合），振荡裂解15s后，在冰上冷却45s，如此循环重复裂解2h，直至细胞充分裂解；

（5）2h后，4℃，10,000×g离心15min，然后将上清液转移至1.5mLEP管中，保存于-80℃冰箱。

2、蛋白浓度测定

（1）配制BCA工作液，按照说明书将A、B混匀，震荡；

（2）取7个0.2mL的PCR管编号1～7，2～7号管中均加入5μL的超纯水；

（3）取2mg/mL标准品10μL加到管1内，然后再取出5μL到管2内，按照以上方法进行依次类推，配制2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL的稀释溶液；

（4）在96孔板内每孔加2μL各个不同浓度的标准品及样品（每组样品加3个复孔）；

（5）所有孔加200μL上述工作液，37℃静置半小时；

（6）酶标仪测定，依照标准曲线算出各孔浓度，将样品保存于-80℃冰箱。

3、蛋白样品处理

（1）根据所要测定的蛋白样品的浓度计算出每20μg蛋白所需体积，并按照比例将各组蛋白样品与5×loadingbuffer（最终稀释成1×）混合；

（2）将样品在90～100℃水中煮10min；

（3）于>8000g转速下离心10min。

4、上述处理后的蛋白样品用于SDS蛋白电泳、转膜、封闭后，进行免疫杂交。免疫杂交的方法如下：

（1）将特定的一抗用一抗稀释液稀释至一定的浓度（稀释比例为1：1500），在4℃条件下，摇床上孵育一夜；

（2）吸出一抗稀释液，把盒放于摇床，用TBST洗脱一抗，洗五次，7min/次；

（3）用脱脂牛奶将二抗稀释至一定浓度（稀释比为1：2500～1：5000），孵育1h；

（4）吸出二抗液，并将盒放于摇床上，TBST洗脱二抗，一次洗10min，共洗5次；

（5）进行显影，显影结束后，将胶片取出放在室温下自然晾干，最后用扫描仪对其进行扫描处理。用ImageJ软件分析所得出的结果。

5、Westernblotting结果表明，经过1,3-DCP刺激24h后，R2C细胞内与孕酮合成相关的蛋白(StAR、3β-HSD)表达量与对照组均显著减少，而各浓度的C3G及1,3-DCP组与1,3-DCP组相比较，StAR蛋白表达量增加，3β-HSD的量同样明显增加，且在C3G为20及40μmol/L时，结果具有统计学意义（如图11所示）。

实施例9CL检测C3G及1，3-DCP对R2C的cAMP水平影响

1、试剂准备：

（1）4.0μMcAMP溶液的制备：将250μL的诱导缓冲液与1.0μL的1mMcAMP混合；

（2）将Kinase-Glo缓冲液倒入棕色瓶子中混合，保存在-20℃冰箱；

2、细胞的诱导

（1）将细胞进行消化、重悬，调整其浓度，按照1×10⁴/孔的浓度铺于96孔板进行培养；

（2）24h后，各组的孔中分别换上浓度为2mmol/L的1,3-DCP及5、10、20、40μmol/LC3G的细胞培养液；

（3）加药刺激24h后，在每孔中加入20μL的1×inductionbuffer。

3、制作cAMP标准曲线

（1）在96孔板上对A2～A12列的进行分组，每组3个复孔，分组后在各组的孔中均加入100μL的诱导缓冲液；

（2）在A1组的各个孔中加入200μL的浓度为4.0μmmol/LcAMP溶液；

（3）从A1～11组，进行一系列的cAMP溶液的两倍稀释（注：A12组的各孔中不加cAMP溶液）；

（4）将各个浓度梯度cAMP标准液依次转移20μL到预留的各孔内，制作cAMP标准曲线。

4、cAMP-Glo检测步骤

（1）所有孔中加20μLcAMP-Glo裂解液，静放15min；

（2）cAMP检测液的制备：将2.5μL的ProteinKinaseA液加入到1.0mL的cAMP-Glo反应液中，充分混匀（现配现用）；

（3）在各组所有孔内均加40μL的cAMP-Glo检测液，孵育20min；

（4）在所有的孔中加入80μL的Kinase-Glo试剂，摇动平板1min混匀，置于室温10min；

（5）荧光酶标仪测结果，用Graphpad软件统计分析所得结果。

5、CL检测试剂盒检测cAMP水平结果如附图12所示，在各浓度（5、10、20、40μmol/L）C3G及2mmol/L1,3-DCP刺激细胞4h后，各组细胞cAMP水平变化不明显。24h结果表明,1,3-DCP组的细胞cAMP水平明显下降，而C3G（20μmol/L）对1,3-DCP引起的上述变化起到了显著的抑制作用，结果具有统计学意义（p＜0.05）。