一株产胶原蛋白酶的菌株及其水解铬革屑的应用

摘要

本发明提供一株产胶原蛋白酶的菌株，该菌株产生的发酵液可以在温和的条件下将铬革屑完全水解。本发明提供的产胶原蛋白酶的菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)，已于2015年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC？No.11218。本发明菌株的发酵液中胶原蛋白酶活力达到518.01U/mL，在37℃条件下发酵液24h内能够有效水解铬革屑，处理后水解液中游离铬含量为处理前铬屑中铬含量的30-40％，发酵液对铬离子的耐受度为0.8mg/mL，可用于工业含铬革屑废弃物的处理。

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物应用领域，具体涉及一株产胶原蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其水 解铬革屑的应用。

背景技术

制革工业每年要产生大量的固体废弃物，这些固体废弃物主要由生物质-皮胶原构成，是 原皮修边角料、灰皮片削皮屑等不含铬胶原和蓝皮削匀、修边等产生的含铬胶原废弃物。不 含铬废弃物中主要被用于生产动物蛋白纤维、畜禽蛋白质饲料、人造肠衣和多肽物质等。含 铬废弃物是胶原蛋白和Cr³⁺的复合物，不易被降解，既浪费资源，又会污染环境。传统的碱 水解或酸水解工艺，由于铬分离困难、操作成本高、二次污染、水解产物的质量和应用等方 面的原因，难于被广泛采用。以酶为基础的制革生物技术在清洁性、环境友好性方面独具特 色，这些技术在制革工业的广泛应用，是解决制革工业严重污染，促进制革工业持续发展的 重要途径；因此，铬屑的酶解及水解物的综合利用是有望解决铬屑污染，实现再生资源化的 有效途径。本发明从天津富盛皮革制品有限公司长期堆积废铬屑的土壤中，筛选到一株可以 水解含铬废弃物的菌株，为制革工业含铬废弃物的清洁、环保处理途径的开发奠定基础。

发明内容

本发明提供一株产胶原蛋白酶的菌株，该菌株产生的发酵液可以在温和的条件下将铬革 屑完全水解。

本发明提供的产胶原蛋白酶的菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2015年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保 藏编号为CGMCCNo.11218，分类命名：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株通过以下方法分离、 筛选得到：

(1)称取土样2g，用18mL生理盐水浸泡摇匀后，取1mL加入到装有50mL/250mL富集培养 基的三角瓶中，120～180r/min，33～37℃摇瓶培养1～2d；其中所述富集培养基：明胶10g/L， 葡萄糖5g/L，NaCl5g/L，pH7.2～7.5。；

(2)初筛：将步骤(1)制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱 中培养大约24h。观察菌落生长情况，选取具有透明圈的菌落，转接到初筛平板，编号记录。 挑选明胶水解圈与菌落直径较大的菌株进行复筛；其中所述初筛培养基：明胶50g/L，NaCl 0.1g/L，葡萄糖50g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，pH7.2～7.5；

(3)复筛：挑取步骤(2)中透明圈直径比菌落直径较大的菌落，接到50mL/250mL种子 培养基中，摇瓶培养8～12h，再按照2％～5％的接种量接种到50mL/250mL的复筛培养基中，150～ 200r/min，摇瓶培养24～48h。8000r/min，5min离心后取上清液，测定胶原蛋白酶活力；其 中所述种子培养基：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH自然；复筛培养基：葡萄糖 20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH₂PO₄·2H₂O0.5g/L，CaC1₂0.05g/L，K₂HPO₄·3H₂O2.5g/L，pH为7.0～7.5；

(4)8000r/min离心步骤(3)得到的发酵液5min，取上清进行胶原蛋白酶活力的测定， 筛选出一株胶原蛋白酶活力较高的菌株；

(5)16SrDNA基因序列测定和分析。

测序得到16SrDNA序列长度为1415bp，将该基因序列登陆Genbank，通过BLAST程序与 GenBank中核酸数据进行对比分析，BLAST结果表明其与芽孢杆菌属的多个解淀粉芽孢杆菌达 到99％以上的同源性。经BLAST同源序列比较后，随机抽取其中的若干个序列构建系统进化树， 结果见图4。

(6)经Biolog微生物自动分析系统，并且结合16SrDNA基因序列分析，鉴定本发明的菌 株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

本发明菌株的发酵液中胶原蛋白酶活力达到518.01U/mL，在37℃条件下发酵液24h内能 够有效水解铬革屑，处理后水解液中游离铬含量为处理前铬屑中铬含量的30-40％，发酵液对 铬离子的耐受度为0.8mg/mL，可用于工业含铬革屑废弃物的处理。

本发明的解淀粉芽孢菌株具有营养要求简单、生长迅速、安全无毒等优点。研究表明， 利用解淀粉芽孢杆菌发酵产生的酶液可以将铬革屑水解的特点，将其应用铬革屑的水解处理， 在环境保护和资源重复利用方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：本发明菌株菌落形态图；

图2：本发明菌株个体形态图；

图3：本发明菌株发酵液水解铬革屑前后效果对比图，其中，3a为发酵水解前，3b为发酵 水解24h后；

图4：本发明菌株系统进化树；

图5：铬离子含量标准曲线；

图6：胶原蛋白酶铬离子耐受曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本 领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实 质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发 明的保护范围。

本发明所用培养基如下：

富集培养基：明胶10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L，pH7.2～7.5；

初筛培养基：明胶50g/L，NaCl0.1g/L，葡萄糖50g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L， pH7.2～7.5；

种子培养基：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH自然；

复筛培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH₂PO₄·2H₂O0.5g/L，CaC1₂。

实施例1：菌株的筛选、分离、鉴定

(1)菌株的筛选和分离：

本发明筛选菌株所用土样采集自天津富盛皮革制品有限公司长期堆积废皮屑的土壤中。

①富集培养：称取土样2g，用生理盐水18mL浸泡摇匀后，取1mL加入到装有50mL/250mL 富集培养基的三角瓶中，150～200r/min，33～37℃摇瓶培养1～2d。

②初筛：将步骤①制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱中约24h。 观察菌落生长情况，选取具有透明圈的菌落，转接到初筛平板，编号记录，挑选明胶水解圈 与菌落直径较大的菌株进行复筛。

③复筛：挑取步骤②中透明圈直径比菌落直径较大的菌落，接到50mL/250mL种子培养基 中，摇瓶培养8～12h，在按照2％～5％的接种量接种到50mL/250mL的复筛培养基中，150～ 200r/min，摇瓶培养24～48h；8000r/min，离心5min后取上清液，保存备用。

④胶原蛋白酶活力的测定：

取稀释到一定倍数的步骤③中上清液0.3mL，1mg/mLI型胶原0.9mL，0.1mol/LpH7.5 Tris-HCl(含50mMCaCl₂)0.6mL于10mL离心管中，37℃反应30min，然后加入1.8mL30％的三 氯乙酸终止反应，以先加终止液的相同反应物为对照，反应物8000r/min离心5min,取上清1mL, 加入1mLpH5.4乙酸-乙酸钠缓冲液和1mL茚三酮显色溶液，充分混合后，盖上试管口，在100℃ 水浴中加热20min，沸水浴后，冷水中冷却10min,加入9mL60％乙醇稀释，充分混匀后，在570nm 处测定OD值。酶活力定义为：在37℃，pH7.5条件下，每分钟每毫升发酵液水解胶原产生相当 于1μg甘氨酸的酶量为1个酶活力单位。

按照上述方法测定上清液中胶原蛋白酶酶活力，挑选出酶活力最高的菌株，其酶活力达 到518.01U/mL。

⑤菌种保存：将筛选得到的菌株不断的纯化，直到平板上长出的单菌落形态、大小基本 一致；再挑取上述平板上的单菌落，密集划线于固体LB培养基上，经过12h培养，挑取一定量 的培养物，溶于等体积混合的液体LB培养基和30％的甘油中，振荡混匀后，在-80℃保存，备 用。

(2)菌株的鉴定：

菌落个体形态特征：菌落生长初期呈白色、半透明、光滑湿润菌落、微隆起、圆形齐整； 随着时间的延长，菌落变干、出现褶皱、颜色变为浅黄色。

革兰氏染色镜检：菌株呈革兰氏阳性、杆短小、有芽孢，芽孢中生、不膨胀，属于典型 的芽孢杆菌属形态特征。

16SrDNA基因序列测定和分析：测序得到16SrDNA序列长度为1415bp，将该基因序列登陆 Genbank，通过BlAST程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，BLAST结果表明其与芽孢杆菌 属的多个解淀粉芽孢杆菌具有达到99％以上的同源性。经BLAST同源序列比较后，随机抽取其 中的若干个序列构建系统进化树，结果见图4。

(3)菌株的保藏：

通过以上分离、筛选与菌株鉴定结果，确认该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为CGMCCNo.11218。

实施例2：菌株在铬革屑水解中的应用

(1)制备种子液：挑取单菌落，接种于50mL/250mLLB液体培养基中，37℃，180r/min 培养，10～12h后停止培养,制得种子液。

(2)制备发酵液：按照2％的接种量，将种子液接种到复筛培养基中，37℃、180r/min培 养24h，培养结束后，在4℃条件下，8000r/min离心5min，收集上清液，4℃保存备用。

(3)铬革屑的水解：取5g铬革屑，将其剪成小块，置于试管中，分别加入30mL复筛培养 基(空白)和30mL步骤(2)中制备的发酵液，置于37℃水浴摇床中振荡培养。当培养到24h 后，铬革屑全部水解而空白组中铬革屑没有被水解，结果见图3。

实施例3：水解产物中氨基酸浓度的测定以及游离铬含量的测定

(1)水解产物中氨基酸浓度的测定：

取稀释到一定倍数的上清液1mL，加入1mLpH5.4乙酸-乙酸钠缓冲液和1mL茚三酮显色溶 液，充分混合后，盖上试管口，在100℃水浴中加热20min，沸水浴后，冷水中冷却10min,加 入9mL60％乙醇稀释，充分混匀后，在570nm处测定OD值。根据吸光值和甘氨酸标准曲线，来 计算氨基酸的浓度。按照上述方法测得水解产物中氨基酸的浓度是45.6μmol/mL。

(2)水解产物中游离铬离子含量的测定：

①铬离子标准曲线：

先配制1mg/mL铬离子溶液，再将其分别稀释成1、2、5、6、8、10μg/mL，使用TAS-990 原子吸收分光光度计测定不同铬离子含量的吸光度值，得到铬离子标准曲线，结果见图5。

②铬革屑水解产物中游离铬离子含量：

铬革屑中铬离子主要是与胶原蛋白交联结合，且不易水洗出来，酶解铬革屑后，部分铬 离子被释放出来，因此，酶解液中的游离铬浓度亦可从侧面反应出铬革屑的水解程度。将实 施例2中获得的铬革屑水解液稀释100倍，使用TAS-990原子吸收分光光度计测定酶解液中游离 铬的浓度，测得的吸光值为0.049，代入到标准曲线中，计算得到水解液中游离铬含量为 1.3mg/mL。

制革行业中根据皮质、部位和用途不同，所用的铬鞣剂量也不同，本发明所用的铬屑是 沙发革，其中铬含量为铬屑2-4％。本发明铬革屑水解产物中游离铬含量为处理前铬革屑中的 铬含量的30-40％，可能是由于水解液呈弱碱性，酶解出来的Cr³⁺和OH^-反应，形成Cr(OH)₃沉淀 导致。

实施例4：胶原蛋白酶铬离子耐受性

首先配制200mg/mLCr³⁺母液，分别取一定量的Cr³⁺溶液，加到菌株CGMCCNo.11218发酵液 中，使其终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/mL，颠倒混匀，24h后测 定胶原蛋白酶酶活力，结果如表1所示。

表1：胶原蛋白酶铬离子耐受性

从表1可以看出，当Cr³⁺浓度为分别0.8和1.0mg/mL时，胶原蛋白酶剩余酶活力分别为66.1％ 和18.4％，说明该菌株产生的胶原蛋白酶活力能耐受铬离子浓度为0.8mg/mL。