一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明提供了一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒及检测方法。所述检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂；所述R1试剂的组分包括：10~50mmol/L的第一缓冲液、0.2%~2.5%w/v的促凝剂、0.1~2%w/v表面活性剂、0.01%~0.1%w/v的第一防腐剂；所述的R2试剂的组分包括：0.5%~2%w/v标记C-反应蛋白抗体交联酰胺基团纳米胶乳、0.2~2%w/v的稳定剂、10~50mmol/L的第二缓冲液、0.01~0.1%w/v的第二防腐剂。本发明提供的检测试剂盒及检测方法，具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性好的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫诊断领域，具体涉及一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

C-反应蛋白（C-reactiveprotein，简称为CRP）是由Tillet和Francis在1930首先发现，因其能与肺炎链球菌细胞壁的C多糖起沉淀反应而命名。CRP作为一种急性时相反应蛋白，是在白介素-6的介导下主要由肝脏产生，同时受白介素-1、肿瘤坏死因子α等的调节和刺激，在动脉粥样硬变处、肾脏、神经元及空泡巨噬细胞中也有CRP合成。在动物体内，也同样存在着CRP，如在狗、猪、兔、鲎、河蚌等中均发现过，狗的CRP是一种环状正五聚蛋白，分子量约为100kD，由5个亚单位组成，每个亚单位的分子量为20kD，其中的2个亚单位是糖基化的。CRP无论在人或动物体内均是急性时相反应蛋白中重要的蛋白之一，是一种敏感的炎症标志物，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高。正常动物血清CRP含量很低，但在感染、炎性、手术及肿瘤等情况下，几个小时迅速升高，在狗体内24~48小时可达高峰。病变消退后，CRP可迅速下降至正常。在我国，兽用抗生素在兽医临床和动物饲养方面应用广泛、不可或缺，为了达到既能促进生长又能防病治病的目的，大量的种类繁多的抗生素被应用与畜禽生产的许多环节。而CRP一般在病毒感染时不增高或增高不明显，在细菌感染后会迅速增高，所以可作为动物细菌和病毒感染的一个首选指标，防止抗生素滥用和减少食品带来的健康问题。

1977年Sternberg创建了速率散射比浊法，是以测定的溶液对光的散射程度来判断样品中抗原的含量。一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射，散射强度与抗原抗体免疫复合物的含量成正比。但免疫比浊法由于检测灵敏度达不到临床的要求，于是出现了胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现胶乳凝集。单个胶乳颗粒的大小在入射光波长之内，光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝集可阻碍光线透过，使透射光减少，其减少程度与胶乳凝集的程度成正比，亦与抗原成反比。但目前市面上暂未出现用于胶乳增强免疫比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提出了一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒及检测方法。具体，本发明的技术方案为：

一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；

所述R1试剂的组分包括：10~50mmol/L的第一缓冲液、0.2%~2.5%w/v的促凝剂、0.1~2%w/v表面活性剂、0.01%~0.1%w/v的第一防腐剂；

所述的R2试剂的组分包括：0.5%~2%w/v标记C-反应蛋白抗体交联酰胺基团纳米胶乳、0.2~2%w/v的稳定剂、10~50mmol/L的第二缓冲液、0.01~0.1%w/v的第二防腐剂。

一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：

S1、将校准品放置于本发明提供的检测试剂盒中，测量分析后得到浓度-吸光度差值校准曲线；

S2、取出校准品，放入待测品，根据步骤S1得到的浓度-吸光度差值校准曲线计算得到所述待测品中的C-反应蛋白的浓度。

本发明提供的基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒，首先填补了目前市面上用于胶乳增强免疫比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂的空白，弥补现在国内兽医临床检测的不足。其次，采用本发明提供的基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒及检测方法，结合均相免疫的透射比浊或散射比浊法进行试验，具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性好的优点。

附图说明

图1是实施例1中的浓度-吸光度差值校准曲线。

图2是实施例2中的浓度-吸光度差值校准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；

所述R1试剂的组分包括：10~50mmol/L的第一缓冲液、0.2%~2.5%w/v的促凝剂、0.1~2%w/v表面活性剂、0.01%~0.1%w/v的第一防腐剂；

所述的R2试剂的组分包括：0.5%~2%w/v标记C-反应蛋白抗体交联酰胺基团纳米胶乳、0.2~2%w/v的稳定剂、10~50mmol/L的第二缓冲液、0.01~0.1%w/v的第二防腐剂。

如前所述，本发明提供的基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒，首先填补了目前市面上用于胶乳增强免疫比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂的空白，弥补现在国内兽医临床检测的不足。其次，采用本发明提供的基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测试剂盒及检测方法，结合均相免疫的透射比浊或散射比浊法进行试验，具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性好的优点。

本发明中，所述R2试剂中的标记C-反应蛋白抗体交联酰胺基团纳米胶乳可以通过如下方法制备得到，具体地，包括如下步骤：将含有酰胺基团的胶乳加入活化缓冲液中，再加入活化交联剂进行活化，然后加入C-反应蛋白多克隆抗体进行交联，最后加入胶乳封闭液，封闭残留活化位点。

其中，所述活化缓冲液为1~10mmol/L、pH=4~6的2-吗啉乙磺酸缓冲液。所述，所述活化交联剂中含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰胺，且所述活化交联剂中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.01~0.1%w/v，所述N羟基琥珀酰胺的浓度为0.01~0.1%w/v。所述胶乳封闭液中含有0.2~2%w/v的第二稳定剂、10~50mmol/L的第三缓冲液、0.01~0.1%w/v的第三防腐剂，但不局限于此。

作为本发明的一种优选实施方式，按照上述步骤制备所述标记C-反应蛋白抗体交联酰胺基团纳米胶乳时，所述的活化时间为1~2小时；所述的交联反应时间为2~4小时，但不局限于此。

需要说明地是，在加入活化交联剂进行活化完成后，在加入C-反应蛋白多克隆抗体进行交联的步骤之前，优选地，还需先通过离心分离的步骤去掉体系中残留的活化交联剂。

另外，所述活化和交联的步骤均优选在37℃下进行。

本发明中，各原料中所采用的缓冲液可采用本领域常见的各种缓冲液，其可以相同，也可以不同。具体地，所述第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种；且所述第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液的pH值各自独立地为6.5~8.0。

所述R1试剂中，所述促凝剂为不同聚合度的聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种。所述表面活性剂为阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂中的一种或多种。所述表面活性剂的亲水亲油平衡值（简称为HLB值）大于8.0。

本发明中，各原料体系中所采用的防腐剂可以相同，也可以不同。具体地，所述第一防腐剂、第二防腐剂和第三防腐剂各自独立地为叠氮钠、硫柳汞、Proclin-300中的一种或多种。

本发明中，各原料体系中所采用的稳定剂可以相同，也可以不同。具体地，所述第一稳定剂、第二稳定剂各自独立为蛋白质、糖或无机盐中的一种或多种。所述稳定剂中，所述蛋白质为BSA、NBS、Tripton、Casein或明胶中的一种或多种。所述稳定剂中，所述糖为蔗糖、海藻糖或甘露糖中的一种或多种。所述稳定剂中，所述无机盐为氯化钠、氯化钾的一种或两种。

作为本发明的一种优选实施方式，所述R2试剂中的C-反应蛋白抗体交联酰胺基团纳米胶乳的颗粒直径在40~300nm之间。

作为本发明的另一种优选实施方式，所述C-反应蛋白抗体交联酰胺基团纳米胶乳中所述纳米胶乳通过表面的酰胺基与C-反应蛋白抗体的氨基或羧基共价结合。在此种优选情况下，酰胺基团纳米胶乳与抗体的结合是通过其表面的酰胺基与抗体的氨基或羧基共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不但提高了抗体的结合率，还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域，提高反应的灵敏度。

本发明还提供了一种基于酰胺基团纳米胶乳增强比浊法动物C-反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：

S1、将校准品放置于本发明提供的检测试剂盒中，测量分析后得到浓度-吸光度差值校准曲线；

S2、取出校准品，放入待测品，根据步骤S1得到的浓度-吸光度差值校准曲线计算得到所述待测品中的C-反应蛋白的浓度。

采用本发明提供的检测试剂盒，本领域技术人员可以自行配制校准品，然后根据本发明提供的检测方法，得到浓度-吸光度差值校准曲线。然后，再取出校准品，而放入待测品，即可根据测量结果和前述浓度-吸光度差值校准曲线，从而得到所述待测品中的-反应蛋白的浓度。

其中校准品的配制方法没有特殊要求，对于校准品的具体数量和浓度设置可采用本领域常规设计。

作为本发明的一种优选实施方式，具体地，本发明中，所述校准品包括若干支不同浓度的C-反应蛋白基质，所述C-反应蛋白基质中优选含有天然C-反应蛋白和稀释液。所述稀释液中含有10mmol/L的第四缓冲液、叠氮钠0.01~0.1%w/v、牛血清白蛋白0.5~3%w/v。其中，所述第四缓冲液为磷酸盐缓冲液。

更进一步地，所述校准品可包括6支不同浓度的C-反应蛋白基质。6支不同浓度的C-反应蛋白基质中的天然C-反应蛋白的浓度可以自行设定。作为本发明的一种优选实施方式，所述6支C-反应蛋白基质中的天然C-反应蛋白的浓度可以依次为0mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、200mg/L。作为本发明的另一种优选实施方式，所述6支C-反应蛋白基质中的天然C-反应蛋白的浓度可以依次为0mg/L、30mg/L、60mg/L、90mg/L、150mg/L、200mg/L，但不局限于此。

本发明中，步骤S1中测量分析后得到浓度-吸光度差值校准曲线中的吸光度采用透射比浊或散射比浊蛋白分析仪测量得到。

本发明中，所述待测品可以为各种动物血清或血浆，包括但不局限于各种猪、狗的血清或血浆。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一、检测试剂盒的制备：

1、取1ml的表面带有酰胺基团的聚苯乙烯胶乳颗粒（颗粒直径80nm）用10mM的pH=5.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至100ml，终浓度为1%。

2、再加入0.1%w/v1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.1%w/v的N羟基琥珀酰胺进行活化胶乳，37℃水浴1小时。

3、离心，去上清液（含残留活化交联剂），再加入2mg的CRP多克隆抗体进行交联反应，37℃水浴4小时。

4、最后，加入含有2%w/v蛋白质BSA、0.1%w/v叠氮钠和pH=7.0的10mmol/L磷酸盐缓冲液的1ml胶乳封闭液，封闭胶乳表面残留活化位点，得到R2试剂。

5、取pH=7.0的10ml的10mmol/L磷酸盐缓冲液加入1%w/v的PEG20000、1%w/v吐温-20、0.1%w/v叠氮钠，混匀制得R1试剂。

6、将天然CRP溶于10mmol/L的磷酸盐缓冲液，0.03%w/v叠氮钠、2%w/v牛血清白蛋白，按不同稀释倍数，CRP浓度分别为：0mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、200mg/L，得到CRP校准品。

二、试剂盒在蛋白分析仪上的应用

1、将R1试剂和R2试剂放入试剂盒中的相应位置，然后分别上述CRP校准品0mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、200mg/L，采用透射比浊蛋白分析仪进行检测，每个浓度检测5次。

检测步骤为：将10ul的校准品加入到装有400ul反应缓冲液（R1）和搅拌子的比色杯中，将比色杯放入检测口，仪器自动检测到比色杯，再加入80ulCRP抗体胶乳结合物（R2）加入到比色杯中。仪器自动搅拌混匀10s，测定吸光度OD1，反应1min后，测定吸光度OD2，仪器自动计算吸光度的差值：△OD=OD2-OD1。检测5次的结果分别如表1所示。

表1

校准品中CRP浓度0mg/L20mg/L40mg/L80mg/L120mg/L200mg/L△OD10.00620.07140.25120.65781.00261.8122△OD20.00640.07180.2520.65761.00291.8125△OD30.00650.07090.25210.65661.0031.8118△OD40.00680.0710.25090.65591.00351.813△OD50.00670.07130.25080.6571.00381.8124平均值0.006520.071280.25140.656981.003161.81238

2、将上表1中各校准品的△OD的平均值作纵坐标，相应的浓度作横坐标，制作浓度-吸光度差值校准曲线，如图1所示。

3、然后，将试剂盒中的校准品取出，然后放入待测品1小狗血浆，测定得到其吸光度差值△OD（待测品1）=0.0698，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品1中C-反应蛋白的浓度为16.02mg/L。

4、然后，将试剂盒中的校准品取出，然后放入待测品2小猪血浆，测定得到其吸光度差值△OD（待测品2）=0.231，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品2中C-反应蛋白的浓度为33.35mg/L。

实施例2

一、检测试剂盒的制备：

1、取1ml的表面带有酰胺基团的聚苯乙烯胶乳颗粒（颗粒直径200nm）用5mM的pH=6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至200ml，终浓度为0.5%。

2、再加入0.05%w/v1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.05%w/v的N羟基琥珀酰胺进行活化胶乳，37℃水浴1小时。

3、离心，去上清液（含残留活化交联剂），再加入2mg的CRP多克隆抗体进行交联反应，37℃水浴3小时。

4、最后，加入含有1%w/v海藻糖、0.05%w/vProclin-300和pH=8.0的20mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液的1ml胶乳封闭液，封闭胶乳表面残留活化位点，得到R2试剂。

5、取pH=8.0的10ml的20mmol/L磷酸盐缓冲液加入2%w/v的PVP3000、2%w/v吐温-20、0.05%w/vProclin-300，混匀制得R1试剂。

6、将天然CRP溶于10mmol/L的磷酸盐缓冲液，0.05%w/v叠氮钠、1%w/v牛血清白蛋白，按不同稀释倍数，CRP浓度分别为：0mg/L、30mg/L、60mg/L、90mg/L、150mg/L、200mg/L，得到CRP校准品。

二、试剂盒在蛋白分析仪上的应用

1、将R1试剂和R2试剂放入试剂盒中的相应位置，然后分别上述CRP校准品0mg/L、30mg/L、60mg/L、90mg/L、150mg/L、200mg/L，采用散射比浊蛋白分析仪进行检测，每个浓度检测5次。

检测步骤为：将10ul的校准品加入到装有400ul反应缓冲液（R1）和搅拌子的比色杯中，将比色杯放入检测口，仪器自动检测到比色杯，再加入80ulCRP抗体胶乳结合物（R2）加入到比色杯中。仪器自动搅拌混匀10s，测定吸光度OD1，反应1min后，测定吸光度OD2，仪器自动计算吸光度的差值：△OD=OD2-OD1。检测5次的结果分别如表2所示。

表2

校准品中CRP浓度0mg/L30mg/L60mg/L90mg/L150mg/L200mg/L△OD10.00630.13240.45120.76731.50562.022△OD20.00630.13180.45170.76761.50592.0325△OD30.00640.13190.45230.76921.50482.0318△OD40.00590.1310.4560.76591.5042.023△OD50.00640.07130.4530.7671.5052.0124平均值0.006260.13170.45280.76741.50512.0243

2、将上表2中各校准品的△OD的平均值作纵坐标，相应的浓度作横坐标，制作浓度-吸光度差值校准曲线，如图2所示。

3、然后，将试剂盒中的校准品取出，然后放入实例1待测品1小狗血浆，测定得到其吸光度差值△OD（待测品1）=0.0459，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品1中C-反应蛋白的浓度为15.6mg/L。

4、然后，将试剂盒中的校准品取出，然后放入实例1待测品2小猪血浆，测定得到其吸光度差值△OD（待测品2）=0.2409，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品2中C-反应蛋白的浓度为34mg/L。

以上实施例仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，所作出的若干改进，也应视为本发明的保护范围。