一种桐花鱼的分子鉴定方法

摘要

本发明涉及分子生物检测领域，公开了一种桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：鱼体DNA的提取、PCR扩增、酶切及电泳检测鉴定，通过上述四个步骤即可准确的鉴定测试鱼是否为桐花鱼。本发明操作简单，成本低廉，省时准确，对仪器设备要求低。且本方法取鱼鳞进行分子鉴定，最大程度上降低了对鱼体尤其是活体亲鱼的损伤，便于推广应用，能满足桐花鱼养殖业主、政府监管部门对桐花鱼亲鱼、上市桐花鱼产品的鉴定需求。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物检测领域，涉及一种桐花鱼的分子鉴定方法。

背景技术

桐花鱼是我国安徽省的名贵特产，为皖南山区“鱼肴四绝”之一，桐花鱼 口感细嫩、营养丰富，除了富含蛋白质外，还含有大量钙、磷、铁等微量元素， 受到广大消费者的喜爱。随着人民生活水平的提高，近年来桐花鱼的市场需求 量激增，价格持续走高，也激发了桐花鱼养殖业的快速发展。

桐花鱼属于鲤形目鲤科，是典型的溪水鱼类，个体较小，全体长一般不超 过20厘米，除雄鱼在繁殖季节短时间内具有典型的性状特征外，仅靠外形特征 很难将桐花鱼与其他常见的鲤科淡水鱼分开，例如很难与同等体型大小的鲤鱼、 青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼分开。

桐花鱼的鉴定存在下面两个难点：一方面，由于目前桐花鱼养殖实践中的 亲鱼，多来自对捕获桐花鱼的收购。因此养殖业主亟需一种能快速准确、并且 尽最大可能不伤害亲鱼的鉴定方法，用以区分桐花鱼的真伪，以规避产业链中 的后继损失。另一方面，在水产品市场上也存在一些不法商家用体型较小的其 他鱼种冒充桐花鱼出售的问题，严重损害了消费者的正当权益。

到目前为止，尚未见任何桐花鱼鉴定技术的报道，这严重制约了桐花鱼养 殖产业的发展和相关管理监督部门工作的开展。因此，急需一种桐花鱼快速、 准确的鉴定方法，为桐花鱼养殖产业健康可持续发展与相关部门监管提供技术 支撑。

发明内容

本发明针对目前缺乏桐花鱼鉴定技术存在的问题，提供了一种操作简单、 成本低廉、省时准确、最大程度上不损伤鱼体的桐花鱼的分子鉴定方法。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案如下：

桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：

A.鱼磷DNA的提取：在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞4-6片，置于1.5毫升 灭菌离心管中，加入30-50微升裂解液，将鳞片浸没于裂解液中，在65摄氏度 静置2小时，移至95摄氏度静置20分钟，取1-3微升上清用于PCR扩增；

B.PCR扩增：进行PCR扩增；PCR反应体系包括1-3微升含100纳克DNA 的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物， 1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，无菌水补足至30微升；

C.酶切：取10微升PCR产物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用无 菌水补足至20微升，置于37摄氏度3～5小时；XbaI(限制性内切酶)为识别 TCTAGA碱基序列的XbaI内切酶。

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loadingbuffer混合，在 2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析 电泳结果，根据电泳条带判定该鱼是否桐花鱼。

作为优选，步骤A中，步骤A中，裂解液包含10毫摩尔pH为8.2的Tris-HCl， 50毫摩尔KCL，体积百分比是0.3％的吐温20，体积百分比是0.3％的乙基苯基 聚乙二醇和体积百分比是1％的蛋白酶K。

作为优选，步骤A中，用尖头镊子在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞。

作为优选，步骤A中，将鳞片浸没于裂解液中，在65摄氏度恒温水浴槽中 静置2小时，移至95摄氏度恒温水浴槽静置20分钟，取1-3微升上清用于PCR 扩增。

作为优选，正向引物序列为5’-GAGACCTGTATGAATGGCTAA-3’，反向引 物序列为5’-ACTCAGATCACGTAGGACTT-3’，扩增产物为478bp。

作为优选，步骤B中，PCR反应程序为95℃变性5分钟；95℃变性30秒， 55℃变性30秒，72℃变性45秒，30个循环；72℃延伸10分钟，扩展完成。

作为优选，步骤C中，置于37摄氏度恒温水浴槽3～5小时。

作为优选，步骤D中，若电泳结果出现大小分别为169bp和308bp的两条 电泳条带，则判定该DNA样品来自桐花鱼。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明公开的桐花鱼的分子鉴定 方法，步骤包括鱼体DNA的提取、PCR扩增、酶切及电泳检测鉴定，通过上述 四个步骤即可准确的鉴定测试鱼是否为桐花鱼。本发明操作简单，成本低廉， 省时准确，对仪器设备要求低。且本方法取鱼鳞进行分子鉴定，最大程度上降 低了对鱼体尤其是活体亲鱼的损伤，便于推广应用，能满足桐花鱼养殖业主、 政府监管部门对桐花鱼亲鱼、上市桐花鱼产品的鉴定需求。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的内容不仅限于实 施例中所涉及的内容。

实施例1

桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：

A.鱼磷DNA的提取：在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞4片，置于1.5毫升灭 菌离心管中，加入30微升裂解液，将鳞片浸没于裂解液中，在65摄氏度静置2 小时，移至95摄氏度静置20分钟，取1微升上清用于PCR扩增；

B.PCR扩增：进行PCR扩增；PCR反应体系包括1微升含100纳克DNA 的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物， 1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，无菌水补足至30微升；

C.酶切：取10微升PCR产物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用无 菌水补足至20微升，置于37摄氏度3小时；

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loadingbuffer混合，在 2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析 电泳结果，若电泳结果出现大小分别为169bp和308bp的两条电泳条带，则判 定该DNA样品来自桐花鱼。

实施例2

桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：

A.鱼磷DNA的提取：在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞6片，置于1.5毫升灭 菌离心管中，加入50微升裂解液，将鳞片浸没于裂解液中，在65摄氏度静置2 小时，移至95摄氏度静置20分钟，取3微升上清用于PCR扩增；

B.PCR扩增：进行PCR扩增；PCR反应体系包括3微升含100纳克DNA 的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物， 1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，无菌水补足至30微升；

C.酶切：取10微升PCR产物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用无 菌水补足至20微升，置于37摄氏度5小时；

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loadingbuffer混合，在 2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析 电泳结果，根据电泳条带判定该鱼是否桐花鱼。

实施例3

桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：

A.鱼磷DNA的提取：用尖头镊子在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞5片，置 于1.5毫升灭菌离心管中，加入35微升裂解液，将鳞片浸没于裂解液中，在65 摄氏度恒温水浴槽中静置2小时，移至95摄氏度恒温水浴槽静置20分钟，取 1-3微升上清用于PCR扩增；

B.PCR扩增：进行PCR扩增；PCR反应体系包括2微升含100纳克DNA 的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物， 1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，无菌水补足至30微升；

C.酶切：取10微升PCR产物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用无 菌水补足至20微升，置于37摄氏度4小时；

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loadingbuffer混合，在 2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析 电泳结果，若电泳结果出现大小分别为169bp和308bp的两条电泳条带，则判 定该DNA样品来自桐花鱼。

其中，步骤A中，裂解液包含10毫摩尔pH为8.2的Tris-HCl，50毫摩尔 KCL，体积百分比是0.3％的吐温20，体积百分比是0.3％的乙基苯基聚乙二醇和 体积百分比是1％的蛋白酶K。

实施例4

桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：

A.鱼磷DNA的提取：在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞5片，置于1.5毫升灭 菌离心管中，加入32微升裂解液，将鳞片浸没于裂解液中，在65摄氏度静置2 小时，移至95摄氏度静置20分钟，取1.5微升上清用于PCR扩增；

B.PCR扩增：进行PCR扩增；PCR反应体系包括1.5微升含100纳克DNA 的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物， 1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，无菌水补足至30微升；PCR反应程序为 95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃变性30秒，72℃变性45秒，30个循环； 72℃延伸10分钟，扩展完成。

C.酶切：取10微升PCR产物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用无 菌水补足至20微升，置于37摄氏度恒温水浴槽3.5小时；

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loadingbuffer混合，在 2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析 电泳结果，若电泳结果出现大小分别为169bp和308bp的两条电泳条带，则判 定该DNA样品来自桐花鱼。

其中，步骤A中，裂解液包含10毫摩尔pH为8.2的Tris-HCl，50毫摩尔 KCL，体积百分比是0.3％的吐温20，体积百分比是0.3％的乙基苯基聚乙二醇和 体积百分比是1％的蛋白酶K。

步骤B中，正向引物序列为5’-GAGACCTGTATGAATGGCTAA-3’，反向引 物序列为5’-ACTCAGATCACGTAGGACTT-3’，扩增产物为478bp。

实施例5

桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：

A.鱼磷DNA的提取：用尖头镊子在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞6片，置 于1.5毫升灭菌离心管中，加入48微升裂解液，将鳞片浸没于裂解液中，在65 摄氏度恒温水浴槽中静置2小时，移至95摄氏度恒温水浴槽静置20分钟，取 2.9微升上清用于PCR扩增；

B.PCR扩增：进行PCR扩增；PCR反应体系包括2.8微升含100纳克DNA 的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物， 1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，无菌水补足至30微升；PCR反应程序为 95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃变性30秒，72℃变性45秒，30个循环； 72℃延伸10分钟，扩展完成。

C.酶切：取10微升PCR产物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用无 菌水补足至20微升，置于37摄氏恒温水浴槽度4.5小时；

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loadingbuffer混合，在 2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析 电泳结果，若电泳结果出现大小分别为169bp和308bp的两条电泳条带，则判 定该DNA样品来自桐花鱼。

其中，步骤A中，裂解液包含10毫摩尔pH为8.2的Tris-HCl，50毫摩尔 KCL，体积百分比是0.3％的吐温20，体积百分比是0.3％的乙基苯基聚乙二醇和 体积百分比是1％的蛋白酶K。

步骤B中，正向引物序列为5’-GAGACCTGTATGAATGGCTAA-3’,反向引 物序列为5’-ACTCAGATCACGTAGGACTT-3’，扩增产物为478bp。

实施例6

桐花鱼的分子鉴定方法，包括以下步骤：

A.鱼磷DNA的提取：用尖头镊子于鱼体腹鳍上侧取桐花鱼及体型大小与 桐花鱼近似(体长11.5-16.7厘米)的鲤鱼、青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼鱼鳞各 四片，分别置于标记好的1.5毫升灭菌离心管中，然后均加入40微升裂解液， 使鳞片样品没于裂解液之中，于65摄氏度恒温水浴槽中静置2小时，然后移至 95摄氏度恒温水浴槽静置20分钟。

B.PCR扩增：分别以上述含有不同鱼DNA的裂解液2微升为模板进行PCR。 PCR反应体系包括2微升含100纳克DNA的DNA模板，3微升10×buffer， 2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0.3微升Taq聚合 酶，无菌水补足至30微升(正向引物序列为 5’-GAGACCTGTATGAATGGCTAA-3’,反向引物序列为 5’-ACTCAGATCACGTAGGACTT-3’，扩增产物为478bp)；PCR反应程序为95℃ 预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸45秒，循环次数为 30次；最后72℃延伸10分钟。

C.酶切：取上述不同鱼样品的PCR产物各10微升，分别加入2微升 10×buffer，2微升XbaI，用无菌水补足至20微升，然后置于37摄氏度恒温水 浴槽5小时。

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loadingbuffer混合，于 2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析 电泳结果，所得结果如表1所示，桐花鱼的电泳谱带出现大小分别为169bp和 308bp的两条电泳条带。鲤鱼、青鱼、鲢鱼、草鱼、鳙鱼电泳结果仅出现一条 约478bp的条带。

表1桐花鱼与鲤鱼、青鱼、鲢鱼、草鱼、鳙鱼的电泳与鉴定结果

总结：若电泳结果出现大小分别为169bp和308bp的两条电泳条带，则判 定该DNA样品来自桐花鱼。若电泳结果仅出现一条约478bp的条带，鉴定为非 桐花鱼，判定该DNA样品来自其他常见淡水杂鱼(如鲤鱼、青鱼、鲢鱼、草鱼、 鳙鱼)。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作 的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。