一类热稳定性提高的淀粉酶突变体及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一类热稳定性提高的淀粉酶突变体及其编码基因和应用。本发明从一种深海热泉来源的细菌α-淀粉酶AMY121出发，运用定点饱和突变技术获得热稳定性提高的淀粉酶突变体；所述的深海热泉细菌α-淀粉酶AMY121具有SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸残基序列，筛选得到的淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L的氨基酸序列分别如SEQ？ID？NO.2、SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4所示。以各自的最适作用温度，T

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一类热稳定性提高的淀粉酶突变体及其编码基因和 应用。

背景技术

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)可水解高分子淀粉为低分子寡糖，在生物能源、饲料、食品等工 业具有广泛的应用价值。天然淀粉的酶法利用工艺的第一步往往是在高温下将淀粉糊化，在 此过程中添加α-淀粉酶，因而市场对耐高温的α-淀粉酶需求旺盛。然而从自然环境中筛选获 得的野生型淀粉酶往往不能完全适应工业应用过程中苛刻的外部环境。发明人从深海热泉耐 热细菌Bacillussp.SCSIO15121中克隆到一条新的α-淀粉酶基因amy121(KJ577547)，重组 酶AMY121最适作用温度为75℃，但在不添加钙离子时75℃半衰期仅为7min，有必要提高 其热稳定性。

蛋白质工程技术(包括定向进化、理性设计、半理性设计)可改变生物催化剂的稳定性、 对映体选择性及底物特异性，使突变酶更能适应应用需求。半理性设计参考结构信息，确定 几个潜在热点氨基酸残基构建小而有效的突变体库，从中筛选到目标突变体。半理性设计结 合了理性设计和定向进化的优势，在蛋白质工程改造方面应用广泛。

发明内容

本发明针对现有技术中α-淀粉酶AMY121热稳定性差的不足，提供了一类热稳定性提高 的淀粉酶突变体及其编码基因和应用。

本发明的淀粉酶突变体，其特征在于，其为淀粉酶突变体Y187E、K205L或Y187E /K205L；

所述的淀粉酶突变体Y187E，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；

所述的淀粉酶突变体K205L，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；

所述的淀粉酶突变体Y187E/K205L，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

本发明的第二个目的是提供上述淀粉酶突变体的编码基因。

所述的编码基因，当为淀粉酶突变体Y187E时，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。

所述的编码基因，当为淀粉酶突变体K205L时，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。

所述的编码基因，当为淀粉酶突变体Y187E/K205L时，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。

含有上述淀粉酶突变体的编码基因的表达载体。

含有上述表达载体的重组菌。

本发明的第三个目的是提供上述淀粉酶突变体在水解淀粉中的应用。尤其是在高温条件 下水解淀粉中的应用。

本发明由深海热泉细菌Bacillussp.SCSIO15121α-淀粉酶amy121基因出发，鉴定了一个 与热稳定性相关的氨基酸残基，以其为中心，对周边残基的编码基因进行半理性设计而引入 突变，将突变的基因序列连接表达载体转化表达宿主菌，发酵培养并对表达的淀粉酶突变体 进行提取、筛选，从而得到热稳定性提高的淀粉酶突变体。

本发明制备得到的淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L与野生型淀粉酶 AMY121相比，最适作用温度(T_optimum)、75℃下的半衰期(t_1/2at75℃)、半失活温度(T₅₀¹⁵) 都获得提高，具有更优良的热稳定性。热稳定性提高的淀粉酶突变体扩展了深海热泉细菌淀 粉酶AMY121的应用范围，使其可应用于生物能源、食品、日化添加剂、饲料工业生产和生 活垃圾处理等领域。

附图说明

图1为温度对Lys209残基替换淀粉酶突变体活性的影响。

图2为Lys209残基替换淀粉酶突变体T₅₀¹⁵值的测定结果。

图3为淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L的最适作用温度。

图4为淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L的T₅₀¹⁵值的测定结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下述实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:ALaboratoryManual》(Sambrook,J.RussellDsvidW.,MolecularCloning:ALaboratory Manual,3^rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor)。所用引物均由上海生工生物工程技术服务有 限公司合成。

实施例1

在深海热泉耐热细菌Bacillussp.SCSIO15121中α-淀粉酶AMY121的第208位和第209 位氨基酸残基之间插入两个氨基酸后，其热稳定性显著下降。通过同源建模发现两个氨基酸 的插入使Lys209的构象发生明显变化。所述的α-淀粉酶AMY121的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，其编码基因—α-淀粉酶基因amy121的核苷酸序列已经存入Genbank中，其登录号为 KJ577547。

1与热稳定性相关的氨基酸残基Lys209的鉴定

1.1反向PCR介导的α-淀粉酶AMY121的第209位Lys定点突变

为了进一步研究与α-淀粉酶AMY121热稳定性相关的氨基酸残基Lys209，由深海热泉细 菌Bacillussp.SCSIO15121α-淀粉酶amy121基因(KJ577547)出发，设计α-淀粉酶AMY121 的209位Lys定点饱和突变的引物，利用反向PCR介导定点突变，其引物设计如下：

K209W-F5′-TATAAGTTTCAAGGATGGGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209P-F5′-TATAAGTTTCAAGGACCGGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209I-F5′-TATAAGTTTCAAGGAATTGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209V-F5′-TATAAGTTTCAAGGAGTGGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209F-F5′-TATAAGTTTCAAGGATTTGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209L-F5′-TATAAGTTTCAAGGACTGGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209E-F5′-TATAAGTTTCAAGGAGAAGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209S-F5′-TATAAGTTTCAAGGAAGCGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209M-F5′-TATAAGTTTCAAGGAATGGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209Y-F5′-TATAAGTTTCAAGGATATGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209N-F5′-TATAAGTTTCAAGGAAATGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209D-F5′-TATAAGTTTCAAGGAGATGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209Q-F5′-TATAAGTTTCAAGGACAGGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209G-F5′-TATAAGTTTCAAGGAGGCGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209H-F5′-TATAAGTTTCAAGGAGATGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209A-F5′-TATAAGTTTCAAGGAGCGGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209R-F5′-TATAAGTTTCAAGGACGTGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209T-F5′-TATAAGTTTCAAGGAACCGCATGGGATTGGGAA-3′，

K209C-F5′-TATAAGTTTCAAGGACGCGCATGGGATTGGGAA-3′；

以上为正向引物。209位的Lys定点饱和突变的反向引物可以共用，引物如下：

K209-allR5′-TCCTTGAAACTTATAGATGCGGTTCAGCT-3′。

以实验室前期构建的淀粉酶AMY121表达载体pET28a-amy121(将α-淀粉酶amy121基 因插入表达载体pET28a的酶切位点NcoI和XhoI之间)为模板，利用上述正反向引物进行反 向PCR反应，PCR扩增使用的DNA聚合酶为北京全式金生物技术有限公司的FastPfumix； 反应程序为：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃3min，共30个循环；72℃10min。 反应结束后，用DpnⅠ消化甲基化模板，纯化PCR产物后与大肠杆菌表达载pET28a连接， 然后转化至大肠杆菌XL1-Blue中，将转化后的大肠杆菌涂布于50μg/ml卡那霉素的LB抗性 平板上，37℃培养12小时。用灭菌PBS缓冲液将不少于1000个克隆的转化子重悬并收集菌 体，提取质粒后转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，于50μg/ml卡那霉素的LB抗性平板上，37℃ 培养12小时，平板上生长的菌落即为α-淀粉酶AMY121的Lys209残基替换的突变酶转化子。 1.2α-淀粉酶AMY121的Lys209残基替换突变酶的纯化和分析

1.2.1突变酶的分离纯化

将上述突变酶转化子接种于含50μg/ml卡那霉素LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培 养24小时，从培养后的菌液中吸取1mL菌液，加入到100mL新鲜LB液体培养基(含50ug/mL 卡纳霉素)的250mL三角瓶中；37℃，200rpm摇床中剧烈振荡培养2～3h，检测OD值，当 OD600达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，在28℃，180rpm摇床中继续振荡培 养约12h。将诱导好的菌液于4℃，6000rpm条件下离心10min，收集菌体；将收集的菌体 用50mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液重悬，用超声波进行细胞破碎。超声波工作条件为：功 率30％，工作5s暂停5s，破碎时间为30min；在4℃，12000rpm下离心10min，收集上清 溶液，即为粗酶液可用于镍柱纯化。纯化过程：5mL蒸馏水冲洗镍柱→5mLBinding缓冲液 (5mmol/L咪唑，50mMpH8.5的Tris-HCl缓冲液)平衡→加入过滤好的粗酶液→20mL Bindingbuffer(5mmol/L咪唑，50mMpH8.5的Tris-HCl缓冲液)冲洗层析柱→100～200mL Washingbuffer(20mmol/L咪唑，50mMpH8.5的Tris-HCl缓冲液)冲洗层析柱→10mLElution buffer(500mmol/L咪唑，50mMpH8.5Tris-HCl缓冲液)洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE 检测纯化效果，由此得到纯化的突变酶液。

1.2.2半失活温度T₅₀¹⁵的测定

将稀释的突变酶液(以依照相同方法得到的纯化的野生型淀粉酶AMY121酶液为对照) 100μL放置于1.5mL的EP管中，置于水浴锅中，精确控温加热15min，然后在4℃冷却20 min，室温平衡15min。经过热处理的酶液通过离心去除沉淀，吸取上清液用DNS法测定残 余活性，未经过热处理的酶液活性定义为100％。利用残余活性对温度作图，如图1所示；并 利用GraphPadPrism5软件中的Sigmoidalboltzmannfit进行拟合，拟合拐点即为T₅₀¹⁵，如图 2所示。

结果表明，将209位Lys突变成其他19个氨基酸后，发现19个突变体的热稳定性都较 野生酶差。确定Lys209参与AMY121蛋白质结构的稳定，与淀粉酶的热稳定性相关。

2α-淀粉酶AMY121突变体库的建立、筛选及鉴定

2.1饱和突变体文库的构建

以实验室前期构建的淀粉酶AMY121大肠杆菌重组表达质粒pET28a-AMY121作为模 板，选择AMY121的209位周边半径范围内的第187位酪氨酸(Tyr187)、第205位赖 氨酸(Lys205)、第206位苯丙氨酸(Phe206)和第231位天冬氨酸(Asp231)相对应的核苷 酸出利用NNN代替原有密码子，设计简并引物，构建对应4个位点的随机饱和突变文库， 引物设计如下：

Y187-F5′-TTCAAATGGCATTGGNNNCATTTTGACGGAACC-3′，

Y187-R5′-CCAATGCCATTTGAAATCGCTGTATGTG-3′；

K205-F5′-CTGAACCGCATCTATNNNTTTCAAGGAAAGGCA-3′，

K205-R5′-TAGATGCGGTTCAGCTTTCGGGACTC-3′；

F206-F5′-AACCGCATCTATAAGNNNCAAGGAAAGGCATGG-3′，

F206-R5′-CTTATAGATGCGGTTCAGCTTTCGGGA-3′；

D231-F5′-ATGTATGCCGACATCNNNTATGATCATCCTGAT-3′，

D231-R5′-GATGTCGGCATACATCAAGTAATCATAGTT-3′。

以AMY121表达载体pET28a-AMY121为模板，分别利用上述正反向引物对进行反向 PCR扩增，构建4个定点饱和突变扩增产物；PCR扩增使用的DNA聚合酶为北京全式金生 物技术有限公司的FastPfumix，反应程序为：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃3 min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，用DpnⅠ消化甲基化模板，纯化PCR产物后 与大肠杆菌表达载体pET28a连接，然后转化至大肠杆菌XL1-Blue中，将转化后的大肠杆菌 涂布于50μg/ml卡那霉素的LB抗性平板上，37℃培养12小时。用灭菌PBS缓冲液将不少 于1000个克隆的转化子重悬并收集菌体，提取质粒后转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，于50 μg/ml卡那霉素的LB抗性平板上，37℃培养12小时，平板上生长的菌落即为针对Lys209相 邻四个氨基酸的饱和突变体文库。

2.2从突变体文库中筛选热稳定性突变体

将本实施例2.1中产生的菌落接种于含0.1mMIPTG和50μg/ml卡那霉素LB液体培养 基的96孔板中，28℃，100r/min摇床培养24小时。加入细胞裂解液，37℃温浴10分钟即 得粗酶液。粗酶液于90℃温浴10分钟后测定每孔的残余活力。从四个突变体库中筛选比野 生酶残余活力高的突变体，扩大体系发酵，纯化突变酶，并测定其T₅₀¹⁵，75℃下的半衰期， 最适作用温度；突变酶的分离纯化方法和半失活温度T₅₀¹⁵的测定方法参照本实施例1.2.1和 1.2.2。确认热稳定性改善后对突变子进行测序，经测序确认得到两个热稳定性提高的突变体， 分别为淀粉酶突变体Y187E和K205L；其中，淀粉酶突变体Y187E的氨基酸序列如SEQID NO.2所示(其是α-淀粉酶AMY121的第187位由络氨酸Tyr突变为谷氨酸Glu)，其编码基 因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；淀粉酶突变体K205L的氨基酸序列如SEQIDNO.3 所示(其是α-淀粉酶AMY121的第205位由赖氨酸Lys突变为亮氨酸Leu)，其编码基因的 核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。采用同上所述方法，构建联合突变体Y187E/K205L，其氨 基酸序列如SEQIDNO.4所示(其是α-淀粉酶AMY121的第187位由络氨酸Tyr突变为谷 氨酸Glu，第205位由赖氨酸Lys突变为亮氨酸Leu)，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 7所示。

与野生型淀粉酶AMY121相比，本发明的淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L 具有更优良的热稳定性(图3、图4)，主要体现在其最适作用温度(T_optimum)、75℃下的半衰 期(t_1/2at75℃)、半失活温度(T₅₀¹⁵)都获得提高，如表1所示。

表1淀粉酶突变体热稳定性检测结果

表中结果说明，与野生型淀粉酶AMY121相比，淀粉酶突变体Y187E、K205L和 Y187E/K205L的最适作用温度提高到了80℃，提高了5℃；淀粉酶突变体K205L和 Y187E/K205L的75℃下的半衰期由野生型淀粉酶AMY121的7.04分钟分别延长到了31.08 和26.16分钟，半失活温度提高到了79℃以上。由此表明，本发明的淀粉酶突变体Y187E、 K205L和Y187E/K205L的热稳定性大大提高，扩展了深海热泉细菌淀粉酶AMY121的应用 范围，经改良后的淀粉酶突变体可用于工业应用，如生物能源、食品、日化添加剂、饲料工 业生产和生活垃圾处理等领域。