一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法

摘要

本发明公开了一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，属于提取纯化分离领域。本发明方法是以介孔/大孔二氧化钛(TiO2)为吸附材料富集卵黄高磷蛋白磷酸肽，此法得到的卵黄高磷蛋白磷酸肽的N/P为4.5。介孔/大孔TiO2不仅可以利用金属氧化物TiO2对磷酸基团的特异性亲和作用，而且介孔-大孔结构的高比表面积和良好的孔道结构提供了更多的活性结合位点。当富集条件为：pH为2.5-4，初始多肽浓度为12-20mg/mL，吸附时间为5-20min，此时得到的PPPs的纯度为4.3-4.8，对应的吸附量为42-53mg/mL。本发明的方法不仅操作简单，而且快速有效，有利于在工业化生产中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，属于提取纯化分离领域。

背景技术

蛋黄蛋白粉是蛋黄卵磷脂工业化生产的副产物，越来越来的学者对其进行了综合研究并 取得了一些进展。卵黄高磷蛋白(Phosvitin，PV)是脱脂蛋黄蛋白粉中的主要含磷蛋白，一 级结构中含有217个氨基酸残基，其中124个是丝氨酸残基，约占总氨基酸残基含量的56％。 已有众多研究表明，卵黄高磷蛋白可与Ca²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Co²⁺，Sr²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺等结合。 由于卵黄高磷蛋白与金属离子结合牢固，不易被水解，使得其生物学效价较低，不利于营养 吸收。现已证实，能与钙形成可溶性络合物的主要功能团是磷酸酰丝氨酸，所以将磷酸酰丝 氨酸残基含量高的卵黄高磷蛋白进行水解，其水解产物卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin  Phosphopeptides，PPPs)可作为很好的钙吸收促进剂，不仅能增加钙在小肠内的吸收及其在 体内的蓄积，而且卵黄高磷蛋白磷酸肽诱导的钙代谢无需维生素D的参与，且能促进铁、锌 等离子的吸收。

目前关于卵黄高磷蛋白磷酸肽研究仅限于实验室水平。常规的PPPs制备方法是先从蛋黄 粉中提取出卵黄高磷蛋白PV，然后对PV进行处理，纯化得到PPPs。也有报道，是先对蛋黄 粉进行脱脂，然后对脱脂后的蛋黄粉进行处理得到粗多肽，再纯化得到PPPs。采用的纯化方 法为乙醇钙沉淀法、膜分离法和离子交换树脂等方法。乙醇钙沉淀法虽然方法简单，但是有 机试剂用量大，对环境有一定的污染；膜分离法膜污染情况严重，需要进行清洗维护；离子 交换树脂法需要使用前和再生时进行处理，操作复杂。也有报道是磁纳米颗粒富集法进行纯 化的，但是磁纳米颗粒不仅稳定性差(重复使用三次时已不能发生吸附)，而且洗脱过程中使 用的咪唑溶剂不符合食品领域的应用。

发明内容

为了克服目前卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)，纯化过程中存在 的上述问题，本发明一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，直接以利用蛋黄卵磷脂生产的副产 物为原料，省去脱脂步骤，然后进行脱磷、酶解，制备粗多肽。本发明采用介孔/大孔TiO₂(macro-mesoporous titanium dioxide，MMTD)为富集材料，直接将PPPs特异性吸附出来， 然后根据TiO₂的性质进行洗脱(碱性条件下PPPs与TiO₂发生离子排斥反应)，操作简便、 节省时间，不仅提高了吸附效率，也大大减少了生产成本。

本发明提供了一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，所述方法是先将蛋黄蛋白粉进行部分 脱磷处理，然后使用胰蛋白酶对部分脱磷后的蛋黄蛋白粉进行酶解，得到粗多肽，再采用介 孔/大孔TiO₂材料对粗多肽进行吸附，洗脱，即得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。

所述蛋黄蛋白粉，在本发明的一种实施方式中，是蛋黄卵磷脂生产中的副产物。

所述吸附、洗脱，在本发明的一种实施方式中，是将粗多肽配制成浓度为6mg/mL-22 mg/mL的溶液，按每30mL粗多肽溶液加入1g介孔/大孔TiO₂材料，在pH 1.0-6.0下震荡吸 附5-60min，然后过滤，洗涤滤渣以去除表面吸附的杂质，然后用碱性溶液将滤渣表面富集 的卵黄高磷蛋白磷酸肽进行洗脱。

所述粗多肽溶液，在本发明的一种实施方式中，粗多肽浓度为12mg/mL-20mg/mL。

所述pH，在本发明的一种实施方式中，pH 2.5-4。

所述吸附，在本发明的一种实施方式中，吸附时间为5-30min，优选5-20min。

所述吸附，在本发明的一种实施方式中，是在15-25℃，150-220rpm进行。

所述洗脱，在本发明的一种实施方式中，是使用0.05-0.20moL/L的NaOH溶液。

所述吸附、洗脱，在本发明的一种实施方式中，条件是：pH为3.0，粗多肽浓度为17mg/mL， 吸附时间为20min。

所述部分脱磷处理，在本发明的一种实施方式中，是采用碱法脱磷。

所述部分脱磷处理，在本发明的一种实施方式中，是将蛋黄蛋白粉置于碱性溶液中，搅 拌处理，然后超滤除去磷酸根离子。在本发明的一种实施方式中，脱磷率为48-64％。

所述部分脱磷处理，在本发明的一种实施方式中，具体是：将蛋黄蛋白粉置于0.1-0.2mol/L 的NaOH溶液中，37℃条件下搅拌3h进行碱法脱磷处理，将处理后的溶液进行超滤除去磷 酸根离子(超滤膜为3000K，回流口压力为5～10psi，进口压力为20～30psi)。

所述酶解，在本发明的一种实施方式中，是将经脱磷处理的蛋黄蛋白粉(脱磷率为 48-64％)和水加入酶解反应器中，搅拌均匀，在37-50℃，pH 7.0-9.0条件下，加入胰蛋白酶 进行酶解；酶解结束后进行灭酶处理，得到含有PPPs的蛋黄蛋白水解多肽，即粗多肽；所述 底物蛋黄蛋白粉的浓度为0.5-2.0％，酶：底物＝1:20-1:200。在本发明的一种实施方式，水解 度为12％以上。

所述酶解，在本发明的一种实施方式中，时间为0.4-4h。优选50-100min。

所述酶解，在本发明的一种实施方式中，是在50℃、pH 8的条件下进行，底物蛋黄蛋白 粉的浓度为1％(m/v)，酶与底物质量比为5：100。灭酶处理后，先调节pH至中性，再冷冻 干燥得粗多肽。

所述介孔/大孔TiO₂，在本发明的一种实施方式中，是采用溶胶凝胶法得到的。

所述介孔/大孔TiO₂，在本发明的一种实施方式中，是按照以下步骤制备得到的：柠檬酸 溶于乙醇中，搅拌，然后加入氨水溶液，继续搅拌，之后将钛酸四正丁酯在搅拌状态下，逐 滴加入上述溶液，搅拌，然后静置；然后依次用水和无水乙醇对沉淀进行清洗，将洗涤后的 材料干燥，最后将上述材料置于马弗炉中进行煅烧；其中每0.3g的柠檬酸，加入18mL质量 浓度为25％-28％的氨水和5mL钛酸四正丁酯。

所述介孔/大孔TiO₂，在本发明的一种实施方式中，是按照以下步骤制备得到的：每0.3g 的柠檬酸溶于乙醇中，搅拌30min，然后加入质量浓度为25％-28％氨水溶液18mL，继续搅 拌10min，之后将5mL钛酸四正丁酯在搅拌状态下，逐滴加入上述溶液，继续搅拌1h，然后 静置；然后依次用水和无水乙醇对沉淀进行清洗，将洗涤后的材料干燥，最后将上述材料置 于550℃煅烧4h。

所述溶解柠檬酸的乙醇，在本发明的一种实施方式中，为40mL 95％无水乙醇。

所述煅烧，在本发明的一种实施方式中，煅烧条件为550℃，4h。

本发明还要求保护按照上述方法得到的卵黄高磷蛋白磷酸肽，以及其在食品方面的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集方法操作简单、分离纯化周期较短，适合 工业化应用；从吸附、清洗到洗脱整个过程在1～3小时内完成；而常规乙醇沉淀法时间为 2-3个小时，膜分离法时间为4个小时，且步骤繁多，膜容易污染；(2)本发明方法所得卵黄 高磷蛋白磷酸肽产品的N/P为4.3-5.0，与目前报道方法得到的磷酸肽相比，纯度较高；(3) 本发明方法还对现有的脱磷方法和酶解方法进行了改进，直接对蛋黄蛋白粉进行碱法脱磷， 脱磷率可达64％，酶解的水解度为15.67％；同时采用具有规则的孔道结构与较大的比表面积 的介孔/大孔TiO₂富集PPPs，吸附效率高，吸附量可达42-53mg/g(PPPs/MMTD)，远远高于 已有报道。

附图说明

图1：介孔/大孔TiO₂材料的扫描电镜。

具体实施方式

脱磷率：

根据GB/T 5009.87—2003，通过分光光度计法对脱磷前后的EYP进行磷含量的测定。通 过下述公式进行脱磷率的计算：

$p=\frac{C_{P1}-C_{P2}}{C_{P1}}\times 100\%---\left(1\right)$

p：EYP的脱磷率(％)

C_p1：脱磷前EYP中磷的含量(mg/g)

C_p2：脱磷后EYP中磷的含量(mg/g)

水解度(DH)：

根据反应过程中记录所消耗的NaOH溶液的体积，按下述公式进行计算：

$DH=V_{NaOH}·\frac{1}{\alpha }·\frac{C_{NaOH}}{MP}·\frac{1}{h_{tot}}---\left(2\right)$

DH：脱磷EYP的水解度(％)

V_NaOH：滴定过程中消耗的NaOH的体积(mL)

C_NaOH：反应使用的NaOH的摩尔浓度(moL/L)

MP：底物中蛋白质的总量(g)

α：氨基酸解离度(50℃，pH＝8.0时，1/α＝1.13)

h_tot：每克蛋白质中肽键的克当量(8.38)

N/P：

计算方法如以下公式：

$r=\frac{C_N}{C_P}\times \frac{31}{14}---\left(3\right)$

r：待测样品中N和P的摩尔比

C_N：待测样品中N的含量(mg/g)

C_P：待测样品中P的含量(mg/g)

31：P的相对分子质量

14：N的相对分子质量

实施例1：蛋黄蛋白粉部分脱磷方法

将蛋黄蛋白粉置于0.05-0.2mol/L的不同浓度的NaOH溶液中，37℃条件下搅拌3h进行 碱法脱磷处理，将处理后的溶液进行超滤除去磷酸根离子(超滤膜为3000K，回流口压力为 5～10psi，进口压力为20～30psi)，比较了不同浓度的NaOH溶液处理下蛋黄蛋白粉的脱磷率。

结果显示0.05mol/LNaOH，脱磷率为27％；0.1mol/LNaOH，脱磷率为46％；0.15mol/L 时，脱磷率为53％；0.2mol/L时，脱磷率为64％。

实施例2：部分脱磷的蛋黄蛋白粉的酶解

对部分脱磷处理的蛋黄蛋白粉进行酶解，结果发现脱磷率低，导致水解度低。但是如果 脱磷过度，得到的PPPs持钙功能降低。所以选用脱磷率在46％-64％的脱磷后的蛋黄蛋白粉 进行酶解。

酶解过程如下：将脱磷蛋黄蛋白粉和去离子水加入酶解反应器中(底物浓度为1％)，50℃ 水浴循环加热，待溶液搅拌均匀后，调节pH至8.0，将一定量的胰蛋白酶加入上述溶液(酶： 底物＝5：100)，反应过程中用0.1mol/L的NaOH溶液进行滴定，维持pH为8.0，反应时间4 h。酶解结束后将上述反应溶液置于90℃条件下，10min处理进行灭酶处理，冷却后将酶解 液pH调至7.0。最后将酶解液进行冷冻干燥得到含有PPPs的蛋黄蛋白水解多肽(简称粗多 肽)。采用脱磷率在64％的蛋黄蛋白粉的酶解的水解度为15.67％。而且在1h内就可以得到 14％以上的水解度。

实施例3：介孔/大孔TiO₂材料的制备

以钛酸四正丁酯为钛源，采用溶胶-凝胶法方便快速的合成介孔/大孔TiO₂材料。

具体实验方法如下：首先称取0.3g的柠檬酸，将其溶于40mL 95％无水乙醇中，磁力搅 拌30min后加入18mL的氨水溶液，继续搅拌10min，之后取5mL的钛酸四正丁酯，在搅 拌状态下，逐滴加入上述溶液，待磁力搅拌1h后，置于室温下静止12h。然后依次用蒸馏 水和无水乙醇对沉淀进行清洗，将洗涤后的材料置于60℃的干燥箱中干燥14h。最后将上述 材料置于程序控温的马弗炉中进行煅烧，煅烧条件为550℃，4h。

得到的介孔/大孔TiO₂材料的扫描电镜图如图1所示，大孔有序排列(其中大孔孔径为 0.7-2.3μm，孔壁为1-2.5μm)，且孔壁是由颗粒堆积的介孔组成。此结构的材料不仅比表面积 大，活性位点多，而且粒径大，可直接过滤分离，节省离心所带来的成本消耗。

同时，本发明发现，当加入钛酸四正丁酯时，以及钛酸四正丁酯加入前后，如不进行搅 拌，得到的材料无法形成大孔结构，对PPPs的富集量远远低于本发明的介孔/大孔TiO₂材料。

实施例4：卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集

先将蛋黄蛋白粉(购自广州白云山汉方现代药业有限公司)进行部分脱磷处理(脱磷率 为48-64％)，然后使用胰蛋白酶(E.C.3.4.21.4，酶活为3×10⁶IU/g)对部分脱磷后的蛋黄蛋 白粉进行酶解(水解度为15.67％)，得到粗多肽，将粗多肽制备成12mg/mL的溶液，取30mL， 加入1g介孔/大孔TiO₂材料，在pH 2.5下震荡(15℃、150rpm)吸附30min，然后过滤，洗涤 滤渣以去除表面吸附的杂质，然后用0.05moL/L的NaOH溶液将滤渣表面富集的卵黄高磷蛋 白磷酸肽进行洗脱，收集洗脱液，即得到PPPs。

本方法得到的PPPs的N/P为4.6，吸附量为50mg/g(PPPs/MMTD)。同时发现，当吸附 的pH低于2或者大于4.5时，得到的PPPs的N/P高于6；吸附时间延长到60min，吸附量也 不会明显增加。

实施例5：卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集

先将蛋黄蛋白粉进行部分脱磷处理，然后使用胰蛋白酶对部分脱磷后的蛋黄蛋白粉进行 酶解(水解度为12％以上)，得到粗多肽，将粗多肽配制成20mg/mL的溶液，取30mL，加 入1g介孔/大孔TiO₂材料，在pH 4、20℃、180rpm下吸附20min，然后过滤，用去离子水 洗涤滤渣以去除表面吸附的杂质，然后用0.05-0.20moL/L的NaOH溶液将滤渣表面富集的卵 黄高磷蛋白磷酸肽进行洗脱，收集洗脱液，即得到PPPs。洗脱后的MMTD经0.1moL/L的 NaOH溶液再生处理后干燥保藏，可以进行循环使用。得到的PPPs的N/P为4.3，吸附量为 53mg/g(PPPs/MMTD)。同时，当粗多肽溶液的浓度继续增大时，吸附量并没有明显变化。

实施例6：卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集

先将蛋黄蛋白粉进行部分脱磷处理，然后使用胰蛋白酶对部分脱磷后的蛋黄蛋白粉进行 酶解(水解度为14-17％)，得到粗多肽，将粗多肽配制成16mg/mL的溶液，取30mL，加入 1g介孔/大孔TiO₂材料，在pH 3.4下震荡吸附5min，然后过滤，用去离子水洗涤滤渣以去除 表面吸附的杂质，然后用0.20moL/L的NaOH溶液将滤渣表面富集的卵黄高磷蛋白磷酸肽进 行洗脱，收集洗脱液，即得到PPPs。得到的PPPs的N/P为4.5，吸附量为42mg/g(PPPs/MMTD)。 同时还发现，若吸附时间低于5min，得到的吸附量显著降低。

实施例7：卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集

采用以下方法富集PPPs：

(1)部分脱磷处理：先将蛋黄蛋白粉置于0.2mol/L的NaOH溶液中，37℃搅拌3h，然 后用3000K超滤膜超滤除去磷酸根离子(脱磷率为64％)；

(2)酶解：将上一步处理好的蛋黄蛋白粉和水加入酶解反应器中，搅拌均匀，在50℃， pH 8条件下，加入胰蛋白酶进行酶解4h，其中底物蛋黄蛋白粉的浓度为1％，酶：底物＝5:100 (水解度为16％)；酶解结束后进行灭酶处理，调节pH至中性，冷冻干燥得到含有PPPs的 蛋黄蛋白水解多肽，即粗多肽；

(3)介孔/大孔TiO₂材料制备：每0.3g的柠檬酸溶于40mL 95％乙醇中，搅拌30min 后加入18mL的氨水溶液，继续搅拌10min，之后取5mL的钛酸四正丁酯，在搅拌状态下， 逐滴加入上述溶液，待磁力搅拌1h后，置于室温下静置12h；然后依次用水和无水乙醇对 沉淀进行清洗，将洗涤后的材料干燥，最后将干燥后的材料置于马弗炉中进行煅烧，煅烧条 件为550℃，4h；

(4)吸附、洗脱：将制备好的粗多肽配制成17mg/mL的pH 3的溶液，然后按每30mL， 加入1g MMTD，于20℃，180rpm进行PPPs的吸附，吸附5-20min后过滤，用水洗涤滤渣， 经洗涤的MMTD-PPPs用0.05moL/L的NaOH溶液进行洗脱，收集洗脱液，即得到PPPs。

得到的PPPs的N/P为4.8，吸附量为45mg/g(PPPs/MMTD)。

实施例8：卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集

先将蛋黄蛋白粉进行部分脱磷处理，然后使用胰蛋白酶对部分脱磷后的蛋黄蛋白粉进行 酶解(水解度为14-17％)，得到粗多肽，将粗多肽配制成10mg/mL的溶液，取30mL，加入 1g介孔/大孔TiO₂材料，在pH 2.8下震荡吸附10min，然后过滤，用去离子水洗涤滤渣以去 除表面吸附的杂质，然后用0.10moL/L的NaOH溶液将滤渣表面富集的卵黄高磷蛋白磷酸肽 进行洗脱，收集洗脱液，即得到PPPs。得到的PPPs的N/P为5.4，吸附量为40mg/g (PPPs/MMTD)。N/P大于实施例1-4，可能是因为：在初始多肽浓度较低时，介孔-大孔TiO₂表面的活性位点未被充分利用，非磷酸肽等物质发生非特异性吸附，导致其N/P较大，纯度 较低。同时还发现，当粗多肽浓度为6mg/mL时，N/P为6.2，纯度降低明显。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。