大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因的敲除突变体菌株及应用

摘要

本发明公开了大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因的敲除突变体菌株及应用，属于大丽轮枝菌突变体的构建及应用领域。本发明首先构建硫胺素转运蛋白基因的基因敲除质粒，将其转化农杆菌并进行大丽轮枝菌的遗传转化，最终筛选获得一株大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因的敲除突变体菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10906。本发明所构建的硫胺素转运蛋白基因敲除突变体菌株在形态学特征、致病力和逆境胁迫适应性等缺陷显著，尤其对活性氧压力的敏感性极显著，为研究大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白的功能、大丽轮枝菌致病机制以及活性氧信号传导的代谢机理提供了一个重要的研究工具。

说明书

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌的突变体菌株，尤其涉及大丽轮枝菌的硫胺素 转运蛋白基因敲除突变体菌株，本发明还涉及所述大丽轮枝菌硫胺素转运 蛋白基因敲除突变体菌株的构建方法及其在研究大丽轮枝菌的致病机理 中的应用，属于大丽轮枝菌突变体菌株的构建及应用领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种土传维管束真菌病害，侵染 范围非常广泛，能侵染包括木本植物、草本植物和藤本植物在内的两百多 种经济作物，给中国乃至世界造成极大的经济损失(HillocksI,1992)。 而且其后期产生的微菌核可以在极其恶劣的环境下存活数年甚至更长的 时间(Klosterman et al，2011)，用药剂难于防治，成为作物生产发展的 瓶颈，严重危害各国的农业生产(Fradin et al,2006)。鉴于其严重的危害性， 探究大丽轮枝菌致病机理和寄主与病原菌之间的相互作用机制一直是研 究的热点(Luo et al,2014)，如何提高寄主植物体对大丽轮枝菌的抗病性 是亟待需要解决的问题。

迄今为止，有关大丽轮枝菌致病机理仍停尚留在初步探索阶段。Chu  jun等人分析比较在缺氮的环境条件下，大丽轮枝菌入侵程中分泌蛋白主 要参与寄主植物细胞壁降解、活性氧应答，还包括一些效应因子、新陈代 谢蛋白因子等，或许这些分泌蛋白参与了大丽轮枝菌的渗透侵染寄主植物 的根部，达到入侵的目的(Hogenhout et al,2009；Chu et al,2014)。然而大 丽轮枝菌定殖在寄主植物体内，如何适应寄主体内的细胞内环境和如何吸 收寄主细胞内营养成分至今还没报道。因此探索大丽轮枝致病机制过程中 入侵繁殖机制显得更加重要，寻找到参与吸收过程中关键的蛋白因子，能 够为采用“反向遗传学”这一技术手段培育抗病的新材料品种奠定重要的 基础。

硫胺素转运蛋白(Thiamine transporter)是一个质膜蛋白，属于还原 型的叶酸转运蛋白家族，包含膜嵌入底物结合蛋白、两个ATP结合蛋白 和一个转运蛋白亚基(Lagarde et al,2004)。主要将外界低浓度的硫胺素转 运到生物体内，供机体进行新陈代谢(Dutta et al,1999；Larkin et al, 2012)。

目前有关大丽轮枝菌的硫胺素转运蛋白的研究未见任何报道。构建一 株大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因的敲除突变体菌株，对于研究大丽轮枝 菌硫胺素转运蛋白的功能，乃至阐明大丽轮枝菌的致病机理，均有非常重 要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一株大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白 基因的敲除突变体菌株，该突变体菌株在形态学特征、致病力和逆境胁迫 适应性等缺陷显著，尤其是对活性氧压力的敏感性极显著，可作为研究工 具材料应用于研究大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白的功能、大丽轮枝菌的致病 机理及其活性氧信号传导的代谢机理；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述大丽轮枝菌硫胺素转 运蛋白基因敲除突变体菌株的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先构建硫胺素转运蛋白基因(Thit)的基因敲除质粒，通过 同源重组的方法获得5株大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体菌 株，其形态学特征、逆境胁迫适应性等都出现显著缺陷，尤其所获得的 VdΔthit-2突变体菌株，在形态学特征、致病力和逆境胁迫适应性等缺陷比 其他硫胺素转运蛋白基因的突变体菌株更显著，尤其是对活性氧压力的敏 感性极显著。

本发明将获得的大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体 VdΔthit-2菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为： CGMCC No.10906；分类命名为：大丽轮枝菌Vertivillium dahliae。保藏 单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2015 年6月25日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所。

本发明所述大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体菌株能够作 为研究的工具材料应用于研究大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白的功能、研究大 丽轮枝菌致病机理以及研究大丽轮枝菌活性氧信号传导的代谢机理。

本发明还公开了一种所述大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变 体菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)构建硫胺素转运蛋白基因的基 因敲除质粒；(2)将步骤(1)所构建的基因敲除质粒转化农杆菌，进行 野生型大丽轮枝菌的遗传转化；(3)筛选转化子，鉴定，即得。

其中，步骤(1)所构建的基因敲除质粒为pGKO-Neo-Thit。硫胺素 转运蛋白基因(Thit)的同源重组DNA片段构建采用In-Fusion(Frandsen  R.et al.,2012)克隆技术。本发明用同样的方法还将trpC-P、VdThit、Nos 三段基因连接到PCTHyg载体上，构建PCTHyg-VdThit载体。本发明所述 野生型大丽轮枝菌为大丽轮枝菌Vd991菌株。

本发明将基因敲除质粒pGKO-Neo-Thit和PCTHyg-VdThit载体转化到 农杆菌中，用于大丽轮枝菌的遗传转化。本发明共挑取到抗遗传霉素的转 化子195个，PCR检测结果表明有5个转化子没有扩增到Thit基因片段， 可能是大丽轮枝菌VdΔthit缺陷突变体菌株。本发明对上述5个转化子进 行三代继代培养后再进行PCR验证，发现在野生型的菌株中能扩增到Thit 基因，不能扩增到Neo基因；而在5个VdΔthit转化菌株中没有扩增到Thit 基因，却可以扩增到Neo基因。以上结果表明，本发明用遗传霉素基因的 表达盒取代VdThit基因的ORF，获得了5个大丽轮枝菌VdΔthit缺陷突变 体菌株，突变体菌株具有遗传霉素抗性。经PCR验证，本发明还成功获 得4个VdΔthit缺陷突变体菌株的回补转化菌株，都能克隆到硫胺素转运 蛋白基因和潮霉素基因片段。

本发明随机挑选2个VdΔthit缺陷突变体菌株进行形态学分析，结果 表明，在不同碳源培养基上培养的2个VdΔthit突变体菌株的菌落直径都 显著低于野生型以及VdΔthit突变体的回补转化菌株，而且生长速率也显 著低于野生型以及VdΔthit突变体的回补转化菌株，而小种VdΔthit-2的生 长速率缺陷更加显著，表明VdΔthit突变体菌株生长能力出现缺陷。

产孢量和孢子萌发率测定结果表明，2个VdΔthit突变体菌株的孢子 产量显著低于野生型及VdΔthit突变体的回补转化菌株；孢子的萌发率也 明显降低，而小种VdΔthit-2的产孢量和孢子萌发率的缺陷更加显著，表 明VdΔthit突变体菌株表现出生殖能力缺陷。

VdΔthit缺陷突变体的致病力实验结果表明，其致病力与野生型相比 显著降低；而VdΔthit-2突变体小种接种的本生烟仅有一到两片真叶出现 感病症状。对感病本生烟植株根基部往上1cm处茎段的大丽轮枝菌真菌 生物量的测定结果表明，接种VdΔthit突变体菌株的本生烟植株中大丽轮 枝菌真菌生物量显著低于接种野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌 株的本生烟植株，而VdΔthit-2突变体小种接种的本生烟的真菌生物量更 低。

野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株对UV照射的逆境胁迫 表现出一定的适应性，而VdΔthit突变体菌株对UV照射的逆境胁迫能力 降低，对紫外照射非常敏感，经过UV照射的VdΔthit突变体菌株在UV 照射5s后孢子存活率都在1％以下，尤其VdΔthit-2突变体小种对紫外照 射的敏感性更强。

野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株对活性氧压力不敏感； 在10μg/mL维生素k3生长条件下的VdΔthit突变体菌株的菌落直径、生 长速率都显著低于0μg/mL维生素k3生长条件下，表明VdΔthit突变体菌 株对活性氧压力非常敏感；而所获得的VdΔthit-2突变体小种菌株对活性 氧压力极敏感，在10μg/mL维生素k3生长条件下的菌落直径与生长速率 极显著低于野生型和其回补，也显著低于另一个突变体小种VdΔthit-7。

综上，本发明所构建获得的VdΔthit突变体菌株的形态学特征、致病 力、逆境胁迫适应性等都出现显著的缺陷；其中，VdΔthit-2突变体菌株的 形态学特征、致病力、逆境胁迫的适应性缺陷更显著，对活性氧压力的敏 感性极显著，为研究大丽轮枝菌活性氧信号传导的代谢机理与致病机制提 供了一个不可复制的菌株。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

硫胺素转运蛋白目前仅在人类等哺乳动物中对其进行功能分析，在大 丽轮枝菌Vd991菌株中还没有克隆并进行功能分析。本发明利用同源重 组的方法获得大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白的敲除突变体，首次从反向遗传 学的角度分析其功能，发现突变体的形态特征、逆境胁迫的适应性都显著 降低，尤其是其致病力相比野生型出现显著的降低；首次在大丽轮枝菌的 抗病应用中提供理论和试验基础。本发明所获得的VdΔthit-2突变体菌株 及其回补菌株对活性氧压力的敏感性极显著，为研究其活性氧信号传导的 代谢机理与致病机制提供了一个不可复制的菌株。

附图说明

图1为用遗传霉素抗性基因表达盒取代大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白， 获得其敲除突变体；其中，A：通过同源重组获得VdΔthit敲除突变体的 过程；B：获得的VdΔthit敲除突变体的转化子；C：以Thit-J-F/Thit-J-R 为引物，PCR检测VdΔthit敲除突变体；其中，1-5(突变体菌株)电泳通 道没有扩增到Thit基因片段，而Wt(野生型菌株)电泳通道扩增到Thit 基因片段，M是DNA marker；D：以Neo-J-F/Neo-J-R为引物，PCR检测 VdΔthit敲除突变体；其中，1-5(突变体菌株)电泳通道扩增到遗传霉素 基因片段，而Wt(野生型菌株)电泳通道没有扩增到遗传霉素基因片段， M是DNA marker；

图2为转化子的PCR检测筛选(A，B)；箭头是通过PCR检测获得 的可能的VdΔthit突变体菌株；

图3为VdΔthit突变体的回补的获得；其中，A：以Thit-J-F/Thit-J-R 为引物，PCR检测VdΔthit突变体回补；1-4(回补转化菌株)电泳通道和 Wt(野生型菌株)电泳通道都扩增到Thit基因片段，M是DNA marker； B：以Hyg-J-F/Hyg-J-R为引物，PCR检测VdΔthit敲除突变体回补；1-4 电泳通道(回补)中获得扩增到的潮霉素基因片段，而Wt(野生型菌株) 电泳通道没有扩增到，M是DNA marker；

图4为VdΔthit突变体和野生型菌株的形态学表型特征；其中，VdΔthit 突变体相比较野生型在不同碳源上(自上而下依次是蔗糖、果胶质、淀粉、 半乳糖、木糖)的菌落直径的测量生长表型；

图5为VdΔthit突变体和野生型菌株的产孢量(A)和孢子萌发率(B) 分析；

图6为VdΔthit突变体和野生型菌株侵染本生烟实验；其中，A：蘸 根法接种VdΔthit突变体和野生型菌株的本生烟病程曲线；B：本生烟植 株被侵染12天以后，25ng的本生烟DNA中的大丽轮枝菌DNA的实时定 量分析；

图7为VdΔthit突变体菌株和野生型菌株在逆境胁迫的生长表型；其 中，A：紫外照射；B、C：活性氧压力。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料

菌株和质粒：大丽轮枝菌Vd991(中国农业科学院植物保护研究所， 简桂良研究员惠赠)，根癌农杆菌AGL1、质粒pGKO2、PCTHyg、pUC-Neo、 pCAM-Neo(中国农业科学院农产品加工研究所，戴小枫研究员惠赠)。

培养基：LB用于大肠杆菌培养，YEB用于农杆菌液体培养，CM、 PDA、Czapek培养基用于大丽轮枝菌的培养。MM和IM(Hooykaas P， Roobol C，Schilperoort R.Regulation of the transfer of Ti plasmids of  Agrobacterium tumefaciens.Microbiology，1979，110(1):99-109.)用 于转化农杆菌的培养。

实施例1大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体的构建

1、实验方法

1.1基因敲除质粒pGKO-Neo-Thit的构建

Thit基因的同源重组DNA片段构建采用In-Fusion(Frandsen R., Frandsen M,Giese H.Targeted gene replacement in fungal pathogens via  Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation[M]//Plant Fungal  Pathogens.Humana Press,2012:17-45.)克隆技术。以质粒pUC-Neo为模 板，以Neo-F/R为引物(引物序列见表1)，扩增长度为2.6kb的遗传霉素 抗性基因盒。以大丽轮枝菌Vd991基因组为模板，分别以Thit-5F/5R和 Thit-3F/3R为引物(引物序列见表1)，引物Thit-5R/3F 5'端的16bp含有 与Neo-F/R互为反向回补的接头，引物Thit-5F/3R 5'端的16bp含有与 pGKO2(经EcoR I和Hind III线性化的片段)两段互为反向回补的接头， PCR扩增长度分别为0.8kb和1kb的Thit基因(VDAG_01137，Broad  Institute)(klosterman S.,Subbarao K.,Kang S.et al.Comparative Genomics  Yields Insights into Niche Adaptation of Plant Vascular Wilt Pathogens.PLoS  Pathogens,2011,Vol.7(NO.7).)上下游DNA片段，获得末端含有相应互 为反向回补序列的3个PCR产物。通过HD Cloning Kit User  Manual(Clontech，USA)将3个片段整合到pGKO2载体上，成功构建 载体pGKO2-Neo-Thit(图1A)。同样的方法将trpC-P、VdThit、Nos三 段基因连接到PCTHyg载体上，构建PCTHyg-VdThit载体。

表1 引物序列

1.2农杆菌介导的大丽轮枝菌的转化

电击法将基因敲除质粒pGKO-Neo-Thit和PCTHyg-VdThit载体转化到 农杆菌AGL-1中，用于大丽轮枝菌的遗传转化。转化方法参照Mullins 等(18.Mullins E.,Chen X,Romaine P,et al.Agrobacterium-mediated  transformation of Fusarium oxysporum:an efficient tool for insertional  mutagenesis and gene transfer.Phytopathology,2001,91(2):173-180.)的方 法进行。

1.3转化子筛选

挑取转化子，放在含有遗传霉素抗性的液体CM中培养震荡7d(25℃， 200r/min)，收集菌丝，提取总基因组DNA。使用引物Thit-J-F/R进行 PCR筛选检测。

1.4VdΔthit缺陷突变体以及VdΔthit突变体回补的获得

最初筛选到的突变体在含有遗传霉素抗性的PDA培养基继代培养3 代以后，转入液体CM中培养震荡7d(25℃，200r/min)，收集菌丝， 提取总基因组DNA。分别使用引物Thit-J-F/R和Neo-J-F/R(引物序列见 表1)进行PCR验证。

在含有潮霉素抗性筛选获得VdΔthit突变体回补转化菌株继代培养3 代以后，转入液体CM中培养震荡7d(25℃，200r/min)，收集菌丝， 提取总基因组DNA。分别使用引物Thit-J-F/R和Hph-F/R(引物序列见表 1)进行PCR验证。

1.5形态学特征分析

VdΔthit缺陷菌株的生长和形态学特征分析主要从菌落的直径和产孢 量以及孢子萌发率三个方面分析。

菌落直径的测量：制备2×10⁶孢子/mL的野生型菌株与VdΔthit突变 体菌株以及其回补转化菌株的孢子悬浮液，各吸取2μL的孢子悬浮液滴在 不同的碳源[蔗糖(30g/L)、木糖(10g/L)、果胶质(10g/L)、半乳糖(10g/L)、 淀粉(17g/L)](Tzima A.,Paplomatas E.,Rauyaree P,et al.VdSNF1,the  sucrose nonfermenting protein kinase gene of Verticillium dahliae,is required  for virulence and expression of genes involved in cell-wall degradation. Molecular plant-microbe interactions,2011,24(1):129-142.)的Czapek真菌 培养基中心位置，培养到3天、6天、9天、12天、15天时，测量其菌落 的大小和观察其形态区别与变化。

产孢量的测定：制备2×10⁶孢子/mL的野生型菌株与VdΔthit突变体 菌株以及其回补转化菌株的孢子悬浮液，取2.0μL滴加于PDA培养基中 心位置，封口并置于恒温培养箱25℃培养7天后，统计孢子数。

孢子萌发率的测定：制备1×10⁴孢子/mL的野生型菌株与VdΔthit突 变体菌株以及其回补转化菌株的孢子悬浮液，取10.0μL于CM液体培养 基中震荡培养(25℃，200r/min)，分别在培养5小时，10小时，15小 时，20小时，25小时，30小时后统计孢子萌发率。

1.6UV-照射、活性氧压力下的表型特征分析

制备10³孢子/mL的野生型菌株与VdΔthit突变体菌株以及其回补转 化菌株的孢子悬浮液，吸取40μL均匀的涂在PDA培养基上，分别直接暴 露于302nm波长的紫外透射仪下照射(Biometra,Jena,Germany)10秒、15 秒、20秒、25秒、30秒，封口并置于恒温培养箱25℃培养5天后，统计 菌落数。

制备2×10⁴孢子/mL的野生型菌株与VdΔthit突变体菌株以及其回补 转化菌株的孢子悬浮液，各吸取2μL的孢子悬浮液分别滴在0μg/mL和 10μg/mL维生素k3的Czapek真菌培养基中心位置，封口并置于恒温培养 箱25℃培养14天后，观察菌落形态，并统计菌落孢子直径。

1.7致病性试验和qPCR分析寄主植物体内真菌的生物量

将灭菌处理的烟草种子栽培在无菌的环境下，待幼苗长至5-7片真叶 时，用已准备好的10⁶孢子/ml的野生型菌株和VdΔthit缺陷突变体菌株以 及其回补转化菌株孢子悬浮液各自接种烟草幼苗，每种菌株设置3组(10 棵幼苗)重复，12天以后观察植株的感病状况并统计植株的病情指数。

为了分析寄主内大丽轮枝菌的生物量的变化，用感病的本生烟植株地 上1cm茎段作为qPCR真菌生物量检测的材料，提取DNA，以本生烟的 actin(引物序列见表1)基因作为内参基因，真菌的核糖体RNA基因 (Z29511)作为真菌生物量的检测基因，引物Vd-F/Vd-R(引物序列见表 1)是基于核糖体RNA基因的ITS1和ITS2区域，检测感病本生烟中真 菌的生物量。qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-ΔΔCt法进 行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

2、实验结果

2.1大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因突变体(VdΔthit)的获得

本发明共挑取到抗遗传霉素的转化子195个(图1B)，分别提取总 DNA，用引物对Thit-J-F/Thit-J-R进行PCR扩增检测，结果发现，5个转 化子没有扩增到Thit基因片段，这5个转化子可能是大丽轮枝菌VdΔthit 缺陷突变体菌株(图2)，在对这5个转化子进行三代继代培养后再进行 验证。

分别通过两对引物Thit-J-F/Thit-J-R和Neo-J-F/Neo-J-R，挑取已三次 继代培养的5个VdΔthit突变体转化菌株进行PCR实验验证，结果发现， 在野生型的菌株中能扩增到Thit基因，不能扩增到Neo基因；而在5个 VdΔthit转化菌株中没有扩增到Thit基因，却可以扩增到Neo基因(图1C、 D)。以上实验结果表明：获得的5个VdΔthit突变体转化菌株经PCR验 证，确定是大丽轮枝菌VdΔthit缺陷突变体菌株。因此本发明用遗传霉素 基因的表达盒取代VdThit基因的ORF，获得了大丽轮枝菌VdΔthit缺陷突 变体菌株，突变体菌株具有遗传霉素抗性(图1A、B)。

通过两对引物Thit-J-F/Thit-J-R和Hph-J-F/Hph-J-R，分别对已获得的 4个VdΔthit缺陷突变体菌株的回补转化菌株进行PCR实验验证，结果发 现，在已经三次继代培养的VdΔthit突变体的回补转化菌株中，都能克隆 到硫胺素转运蛋白基因(图3A)和潮霉素基因片段(图3B)，表明本 发明已经成功获得4个VdΔthit缺陷突变体菌株的回补转化菌株。

2.2VdΔthit突变体菌株的形态学分析

野生型菌株和随机挑选的2个VdΔthit缺陷突变体菌株(VdΔthit-2、 VdΔthit-7)以及VdΔthit突变体的回补转化菌株(VdΔthit-2-com、 VdΔthit-7-com)，在不同碳源(果胶质、木糖、蔗糖、淀粉、半乳糖)的 查比克培养基上培养3天、6天、9天、12天、15天后，观察和测量其直 径发现：2个VdΔthit突变体菌株的菌落直径都显著低于野生型以及 VdΔthit突变体的回补转化菌株，而且生长速率也显著低于野生型以及 VdΔthit突变体的回补转化菌株(图4)，而且小种VdΔthit-2的生长速率 缺陷更加显著(图4)，表明VdΔthit突变体菌株生长能力出现缺陷。

对2个VdΔthit突变体菌株和野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转 化菌株的产孢量和孢子萌发率测定发现：2个VdΔthit突变体菌株的孢子 产量显著低于野生型及VdΔthit突变体的回补转化菌株(图5A)；孢子 的萌发率也明显降低(图5B)，而且小种VdΔthit-2的产孢量和孢子萌发 率的缺陷更加显著。表明VdΔthit突变体菌株表现出生殖能力缺陷。

综上实验结果表明，VdΔthit突变体菌株与野生型菌株相比，其形态 学特征出现显著的缺陷差异，同时VdΔthit突变体的生长和生殖能力出现 明显的缺陷，而且小种VdΔthit-2生长和生殖能力的缺陷更加显著。

本发明将大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因敲除突变体VdΔthit-2菌株 提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物 保藏编号为：CGMCC No.10906。

2.3VdΔthit突变体菌株降低大丽轮枝菌的致病力

VdΔthit缺陷突变体的致病力实验发现：其致病力与野生型相比，致 病力显著降低(图6A)。接种大丽轮枝菌的本生烟第8天、第10天、第 12天以后，观察发现：接种VdΔthit突变体菌株本生烟植株的感病症状显 著低于野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株。在第12天以后接种 野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株的本生烟植株基本都出现萎 焉并枯死，而接种VdΔthit突变体菌株的本生烟植株仅植株的下部叶片出 现枯萎，上部叶片没有出现感病症状，整个植株没有出现萎焉和枯死的症 状，而且VdΔthit-2突变体小种接种的本生烟仅有一到两片真叶出现感病 症状。

同时本发明对感病本生烟植株根基部往上1cm处的茎段的大丽轮枝 菌真菌生物量的测定发现：接种VdΔthit突变体菌株的本生烟植株中大丽 轮枝菌真菌生物量显著低于接种野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化 菌株的本生烟植株，而且VdΔthit-2突变体小种接种的本生烟的真菌生物 量更低(图6B)。

综上研究结果表明：VdΔthit突变体菌株的致病力与野生型相比，表 现出显著的缺陷，致病力显著降低，而且VdΔthit-2突变体小种的致病力 缺陷更加显著，致病力极显著降低。

2.4VdΔthit突变体菌株降低大丽轮枝菌的逆境胁迫能力

硫胺素是机体所必需的因子，在生物体适应逆境胁迫中起一定的作 用，本发明敲除大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白基因，分析硫胺素转运蛋白对 机体适应逆境胁迫作用。

VdΔthit突变体菌株和野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株在 紫外照射后，结果发现：经过UV照射的VdΔthit突变体菌株在UV照射 5s后孢子存活率都在1％以下，随着照射时间的延长，孢子的存活率越来 越低，从照射15s后，幸存的孢子不存在(图7A)；而野生型菌株及VdΔthit 突变体的回补转化菌株在UV照射5s后，孢子的幸存率为26％，UV照射 10s后孢子的幸存率为9％，随UV照射时间的延长，存活的孢子越来越少， 在照射25s后基本没有存活的孢子(图7A)。

紫外照射的试验结果表明：野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化 菌株对UV照射的逆境胁迫表现出一定的适应性，而VdΔthit突变体菌株 对UV照射的逆境胁迫能力降低，对紫外照射非常敏感，尤其VdΔthit-2 突变体小种对紫外照射的敏感性更强(图7A)。

VdΔthit突变体菌株和野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株在 活性氧压力(10μg/mL维生素k3)下培养7天后，研究结果发现：在0μg/mL 和10μg/mL维生素k3生长条件下，VdΔthit突变体菌株的菌落直径、生 长速率都显著低于野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株(图7B、 C)；同时野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株的菌落直径、生 长速率在10μg/mL维生素k3生长条件与0μg/mL维生素k3生长条件下 基本一致，表明野生型菌株及VdΔthit突变体的回补转化菌株对活性氧压 力不敏感(图7B、C)；然而在10μg/mL维生素k3生长条件下的VdΔthit 突变体菌株的菌落直径、生长速率都显著低于0μg/mL维生素k3生长条 件下，表明VdΔthit突变体菌株对活性氧压力非常敏感(图7B、C)。而 且本试验获得的VdΔthit-2突变体小种菌株对活性氧压力极敏感，在 10μg/mL维生素k3生长条件下的菌落直径与生长速率极显著低于野生型 和其回补，也显著低于另一个突变体小种VdΔthit-7(图7B、C)；而且 在10μg/mL维生素k3生长条件下，VdΔthit-2突变体小种菌株的回补对活 性氧压力的菌落直径也显著低于其在0μg/mL维生素k3生长条件下的菌 株(图7B、C)，表明VdΔthit-2突变体小种菌株的回补对活性氧压力敏 感显著增强，其敏感程度强于突变体小种VdΔthit-7(VdΔthit-2突变体小 种菌株的回补菌落直径和生长速率显著低于突变体小种VdΔthit-7)(图7 B、C)。

综上，VdΔthit突变体菌株对逆境胁迫(紫外照射、活性氧压力)的 适应能力降低，敏感性增强；而且VdΔthit-2突变体小种菌株对活性氧压 力极敏感，表现出极大的缺陷，为大丽轮枝菌活性氧机理的探索提供了一 个不可复制的突变体菌株。

本发明通过同源重组的方法获得硫胺素转运蛋白的基因敲除突变体， 并对其进行功能分析，结果发现其形态学特征、致病力、逆境胁迫适应性 等都出现显著的缺陷，表明硫胺素转运蛋白在大丽轮枝菌新陈代谢过程中 起着不可替代的作用。尤其本发明获得的VdΔthit-2突变体菌株的形态学 特征、致病力、逆境胁迫的适应性缺陷更显著，对活性氧压力(10μg/mL 维生素k3)的敏感性极显著，为研究其活性氧信号传导的代谢机理与致 病机制提供了一个不可复制的菌株。总之，本发明用反向遗传学表明大丽 轮枝菌硫胺素转运蛋白是机体不可替代的蛋白因子，为大丽轮枝菌致病机 理的探索提供理论和试验基础。