桦褐孔菌连续深层发酵液和发酵粉的生产方法

摘要

本发明涉及桦褐孔菌技术领域，更具体而言，涉及桦褐孔菌连续深层发酵液和发酵粉的生产方法；提供一种将发酵设施技术和中草结合的桦褐孔菌连续深层发酵液和发酵粉的生产方法；按照以下步骤进行：a、母种纯化；b、桦褐孔菌前发酵；c、连续混合深层发酵；d、发酵液的制备；e、发酵粉的制备；本发明将发酵设施技术和中草进行结合，以其桦褐孔菌菌种本身特有的生物活性和营养成分及化学特性结合中草药进一步连续深层发酵；本发明主要应用在人体保健及治疗方面。

说明书

技术领域

本发明涉及桦褐孔菌技术领域，更具体而言，涉及桦褐孔菌连续深层发酵液和发酵粉的生产方法。

背景技术

桦褐孔菌属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐孔菌属，是一种生于桦树上的药用真菌，其子实体呈现类似于碳的黑色块状形态。当桦褐孔菌10～15年后起药效时，它能吸干桦木的精髓，使树木枯死。桦褐孔菌主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、日本（北海道），滋生在北半球北纬40°～50°的地区。桦褐孔菌化学成分有多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸,还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物.桦褐孔菌含有大量的抗癌、降血压、降血糖、复活免疫作用的植物纤维类多糖体。可以提高免疫细胞的活力，抑制癌细胞扩散和复发，在胃肠内防止致癌物质等有害物质的吸收，并促进排泄。桦褐孔菌的精制菌粉对糖尿病治愈率达93%。

发明内容

本发明提供一种将发酵设施技术和中草结合的桦褐孔菌连续深层发酵液和发酵粉的生产方法。

本发明采用的技术方案为：

桦褐孔菌连续深层发酵液和发酵粉的生产方法，按照以下步骤进行：

a、母种纯化；

b、桦褐孔菌前发酵；

c、连续混合深层发酵；

d、发酵液的制备；

e、发酵粉的制备。

所述a步骤按照以下方式进行：1）配制原料；2）制作培养基；3）分装试管；4）塞皮塞；5）试管包扎；6）培养基灭菌；7）摆放斜面；8）检查灭菌效果；9）母种接种；10）培养桦褐孔菌母种；

上述配制原料具体为：按照质量百分比的下列组分分别进行配置，桦褐孔菌子实体0.5%，马铃薯5%，葡萄糖0.05%，蛋白胨0.1%，琼脂0.4%,磷酸二氢钾0.012%，硫酸镁0.05%和余量的水，PH为7；

上述制作培养基具体为：桦褐孔菌子实体磨成80目的细粉，将桦褐孔菌子实体和马铃薯加入1000ml的水中，煮沸后微火保持30分钟，然后用双层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，再依次加入葡萄糖、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁，继续加热并搅拌至全部溶化，最后用清水补足至1000毫升，完成培养基制作。

所述b步骤按照以下方式进行：1）配制原料；2）培养液制作与灭菌；3）培养液接种；4）液体菌种的培养；

上述配制原料具体为：按照质量百分比的下列组分分别进行配置，桦褐孔菌子实体0.5%，马铃薯5%，葡萄糖0.05%，玉米粉5%，麦麸3%，蛋白胨0.1%，琼脂0.4%,磷酸二氢钾0.012%，硫酸镁0.05%和余量的水，PH为7；

上述培养液制作与灭菌具体为：桦褐孔菌子实体磨成80目的细粉，将桦褐孔菌子实体和马铃薯加入1000ml的水中，煮沸后微火保持30分钟，然后用双层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，再依次加入葡萄糖、磷酸二氢钾、玉米粉、麦麸、蛋白胨、硫酸镁，继续加热并搅拌至全部溶化，最后用清水补足至1000毫升，完成培养液制作；培养液熬制后要分装在发酵器中，装入量为总体容量的60%，然后用封口纸或封口膜将器具口封包住，将包装好的液体器具装入高压锅内进行高压灭菌，待温度升至121℃开始计时，温度控制在121—123℃，维持30分钟即可达到灭菌效果。

所述c步骤按照以下方式进行：1）连续发酵液体培养基；2）连续发酵罐的消毒；3）装料灭菌；4）接种；5）发酵液体的培养；

上述连续发酵液体培养基具体为：按照质量百分比的下列组分组成，桦褐孔菌子实体干粉2%，葡葡糖0.5%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.075%，马铃薯浓缩液5%，蛋白胨0.05%、消泡剂60mL/100L、50目的玉米粉3%、麦麸5%、早莲草0.15%、生白术0.15%、柴胡0.1%、炒栀子0.1%、牡丹皮0.15%、制女贞子0.15%、茯苓0.15%、白茅根0.15%、生白芍0.15%、蔓荆子0.1%、熟地黄0.15%、党参0.15%、芦根0.15%、炒杏仁0.1%和余量的水组成。

所述d步骤按照以下方式进行：使用过滤机在温度25～28℃开始过滤，回流过滤液10分钟，收集澄清的滤液，即得桦褐孔菌发酵液；过滤所得的液体经超高温瞬时杀菌机杀菌，杀菌温度(110±5)℃，时间10秒，杀菌过的液体放至暂存罐急速冷却到50～55℃，进行浓缩；在真空度0.096～0.099兆帕、液体温度50～55℃、蒸汽压力0.196～0.294兆帕下浓缩，浓缩至可溶性固形物达42％～45％后进行二次杀菌；将浓缩好的液体用液体灌装机将液体装入专用瓶（袋）中，然后在90℃杀菌30分钟；将成品在-18～-25℃冷库中恒温冷藏。

所述e步骤按照以下方式进行：把过滤后的发酵固形物用低温冻干设备全部干燥后，再用低温磨粉设备磨成120目的细粉, 即得桦褐孔菌发酵粉，再进行真空包装保存。

本发明所具有的有益效果为：本发明将发酵设施技术和中草进行结合，以其桦褐孔菌菌种本身特有的生物活性和营养成分及化学特性结合中草药进一步连续深层发酵，所生产的液体和固形物具有平衡血糖、降低高血脂、高血压、改善心血管疾病、改善胃肠功能调节血脂、镇痛、解毒、抗过敏，提高血液供氧能力，增强脑细胞的活性，增强记忆力、防止血栓、血管硬化和中风及改善痴呆症状。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

本发明的工艺流程按照如下方式进行：1）母种纯化；2）桦褐孔菌前发酵；3）连续混合深层发酵；4）发酵液的制备；5）发酵粉的制备。

一、母种纯化

1、配方:1000ml为例

桦褐孔菌子实体0.5%，马铃薯5%，葡萄糖0.05%，蛋白胨0.1%，琼脂0.4%,磷酸二氢钾0.012%，硫酸镁0.05%，PH7。

2、培养基制作

选择优质的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分，切成长0.5毫米的薄片，称取200克，桦褐孔菌子实体要提前磨成80目的细粉。加水1 000毫升，煮沸后微火保持30分钟，马铃薯煮熟而不酥，即8成熟左右。然后用2层沾湿纱布过滤，之后加入琼脂继续加热，并不断用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶化，最后依次加入葡萄糖、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁等，继续加热并搅拌至全部溶化。最后用清水补足至1000毫升，即可进行分装。

3、分装试管。左手持5支试管管口朝上，下端整齐，上移试管至漏斗软管，插入试管内约3厘米。右手捏紧软管止流夹，使培养基液体流入试管 ，每支试管装量约为试管长度的1/5即可。此时松开止流夹液体停止流入。将试管下移离开软管，再分装第2支试管，依此方法分装其他试管，直至全部装完。分装试管要求速度要快，尤其在低温季节，以防止培养基凝固。装量要准确，因为装量偏多摆成的斜面变短，又浪费培养基，装入量偏少则使摆成的斜面太薄，营养少，菌丝难以正常生长。注意避免将培养基黏附到试管管口，以免造成粘着皮塞的现象，还易引起皮塞上孳生杂菌，给菌种质量留下隐患。

4、塞皮塞，用手把专用皮塞塞入试管，皮塞要紧贴管壁不起皱纹，皮塞塞入管中的部分约为2.5厘米，外露部分约占皮塞总长的1/3。

5、试管包扎。试管塞好皮塞后，取10支同样规格的试管，用牛皮纸或双层报纸将棉塞包住，并向下延伸到试管中部，用粗棉线将其扎成一把。

6、培养基灭菌。母种培养基多采用手提式高压灭菌锅进行灭菌，灭菌过程是：检查高压蒸汽灭菌锅的压力表及各部位是否灵活、可靠；尤其注意检查安全阀是否发生堵死或锈死。在锅内加入约3千克自来水，加至支架下缘。将捆好的培养基棉塞向上垂直放入菌筐（桶），将锅盖上垂下的排气管插入套筒内壁的导气管中，然后双手同时用力，分别将对角线方向的两个螺丝拧紧。封盖后关闭排气阀开始加热，当加热至压力达0.05兆帕时，打开排气阀，排尽冷空气，待压力降至0后，即可关闭排气阀。最好依上法排2次。继续加热，当压力上升至0.11兆帕时开始计时，在0.11～0.14兆帕压力下保持30分钟，停止加热，使其自行冷却降至0℃。打开排气阀，再将锅门打开一条10厘米左右的缝隙散热。

7、摆放斜面。观察到报纸干燥后，打开锅盖，当培养基温度降到60℃左右时及时取出摆放斜面。注意培养基要盖住试管底部，斜面长度应以试管长度的五分之三。当试管内培养基完全凝固后收起备用。制备好的培养基应放置在通风干燥处保存。如果温度很高时就摆放斜面，培养基凝固后表面会出现较多的冷凝水，不利菌丝生长。在摆放好斜面后，用厚实的棉布盖住培养基，使培养基缓慢降温冷却，也可减少冷凝水出现。

8、灭菌效果检查。随机取部分试管斜面，放在28℃下进行空白培养，3天后，检查斜面上有无细菌和霉菌菌落。如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要重新灭菌。

9．母种接种。接种前把培养基放入接种箱中进行消毒，消毒要求按前述进行。接种时，手和接种钩用75％的酒精棉球揩擦，点燃酒精灯，使火焰周围空间形成无菌区，左手平行并排拿起母种试管和供接种用的斜面试管，两支试管斜面向上，管口要齐平，右手大拇指和食指持接种钩，在酒精灯的火焰上燃烧灭菌。把接种钩上方可进入试管的部分都要进行灼烧。将左手试管移至火焰旁，用右手的小指、无名指和手掌，在火焰旁分别夹下两支试管的棉塞，将试管口在火焰上稍微烤一下，以杀灭管口上的杂菌，随后将管口移至距火焰1～2厘米处，将灼烧过的接种耙伸入菌种管内，先接触试管内壁，使其冷却，再将其爬壁的气生菌丝钩掉，并将培养基前端最薄处切断，连同气生菌丝一并钩出管外。再用接种钩（铲、耙）将母种纵横割成许多小方块，然后挑取一小块，迅速移入接种的试管斜面的中前部，轻轻抽出接种钩，再烤一下试管口，迅速塞上过火焰的棉塞，一支母种一般可扩接试管30～40支。

技术要点：整个过程均须在火焰旁边进行无菌操作，母种上的接种块以及周边已老化的要去除，挑选菌龄短的菌丝块进行生产。试管从接种箱取出之前，应逐支试管正面的上方贴上标签，写明菌种编号、接种日期。

10．桦褐孔菌母种的培养

    接种完成后把试管置培养箱（室）中进行保温培养。温度调至25℃，一般15～20天菌丝体可长满试管，由于桦褐孔菌菌丝生长速度较慢，所以可在1个母种斜面上转接2个菌块，长满试管的时间可缩短一半。

11．桦褐孔菌的母种质量标准

    要求试管完整、无破损，棉塞干燥、洁净，松紧适宜，能满足透气和滤菌要求；斜面顶端距棉塞45厘米；菌丝白色或微黄色，生长健壮、浓密、均匀，菌落边缘整齐；培养基不干缩，无暗斑，无绿霉菌等杂菌 。

12．桦褐孔菌母种生长异常的原因及解决方法

（1）接种块周围菌丝生长无力，甚至成为无菌丝区域。这是由于接种块偏大、种源菌龄不适宜、培养温度太高、培养基连续使用一个配方、培养基pH值>8等原因所致。处理方法为：接种块尽量取小一些，选择适龄种源，调控培养温度为24℃左右，更换培养基配方，几个配方交替使用，并使培养基灭菌后的pH值达到7.2左右。

（2）试管内气生菌丝上有暗红色水珠。这是由于培养温度过高所致。处理办法为调控培养温度至22～24℃。

（3）菌丝倒伏，发黄，气生菌丝明显生长不整齐，分枝不清晰，生长无力，死菌丝。这是因为种源老化、接种时培养基挑得太厚、培养温度过高或温差过大、培养环境通风不良、供氧不足、培养基比例营养严重不平衡、真菌或病毒感染等原因所致。

二、桦褐孔菌前发酵

1、配方:50000mL为例

  桦褐孔菌子实体0.5%，马铃薯5%，葡萄糖0.05%，玉米粉5%，麦麸3%，蛋白胨0.1%，琼脂0.4%,磷酸二氢钾0.012%，硫酸镁0.05%，PH7。

2.培养液制作与灭菌

按照制作母种固体培养基的方法熬制培养液，培养液熬制后要分装在发酵专用发酵器中，装入量为总体容量的60%，然后用专用的封口纸或封口膜将器具口封包住。将包装好的液体器具装入高压锅内进行高压灭菌，待温度升至121℃开始计时，温度控制在121—123℃，维持30分钟即可达到灭菌效果。

3、培养液接种

把灭菌后的发酵液体器具在专用接种室内接种， 其方法选取新培养好的菌种一支（若从冰箱中取出需提前24小时活化），松动器具的封口包装物，以备接种方便，在酒精灯火焰旁将棉塞顺时针旋转松动，放在一旁，而后在酒精灯旁将平板封口膜撕掉，拿起接种钩在火焰上烧红，并慢慢倾斜灼烧，接种时将平皿盖打开放在一旁，在平板菌种上进行划线（中间接种块不纳入接种部分）平均接种块为0.5*0.5cm，划线后接种钩暂放在试管架上。右手拔出三角瓶棉塞握在手里，用接种钩挑取4-5块接种块，迅速放入器具中。

4、液体菌种的培养：

A、接种后的液体器具置于摇床上或者磁力搅拌器上进行培养，温度控制在23—24℃，转速或频率126/分钟。

B、定时观察培养液颜色、浓度以及菌球形态。

C、液体菌龄一般控制在7天，此时培养液内出现大量微粒菌球，培养液呈褐色，带有甜香味道。

三、连续混合深层发酵

1、连续发酵液体培养基

桦褐孔菌子实体干粉2%，葡葡糖0.5%， 磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.075%，马铃薯浓缩液5% ，蛋白胨0.05%、消泡剂60mL/100L 、50目的玉米粉3%、麦麸5%、早莲草0.15%、生白术0.15%、柴胡0.1%、炒栀子0.1%、牡丹皮0.15%、制女贞子0.15%、茯苓0.15%、白茅根0.15%、生白芍0.15%、蔓荆子0.1%、熟地黄0.15%、党参0.15%、芦根0.15%、炒杏仁0.1%。

2、连续发酵罐的消毒

将灭菌补料罐加水至总体积的70%。打开补料罐电源开关，将温度设定到121℃—125℃， 打到此温度后，关闭空气总管道阀门，打开蒸气阀门，让蒸气通过二级过滤器依次进入三级、四级，最后到发酵罐；当发酵罐温度达ll8℃—120℃后，将接种阀、取样阀;排气阀打开一点，让蒸气慢慢排出一点，对其进行灭菌(在整个过程中每3—5分钟要排一次过滤器下部产生的冷凝水)，保持30分钟后，先打开发酵罐后面的排气阀门，然后将灭菌补料罐出料口阀门慢慢打开一点，让高温高压水流出少许，对其三通预热后，打开进入过料管道的蒸气阀门，当发酵罐后面的排气阀门有大量蒸气排出后，关闭发酵罐后面的排气阀门，打开发酵罐后面的进料口阀门，然后关闭取样阀，迅速将取样金属管头插入甲醛瓶内，关闭发酵罐顶上接种与排气阀门；先打开接种抢开关阀门，再将发酵罐出种口阀门慢慢打开一点，让高温高压水流出少许，对其三通预热后，打开进入出种管道的蒸气阀门，当接种抢出种口有大量蒸气排出后，将出气量调小，有少量蒸气排出即可，灭菌30分钟后关闭接种枪开关及出菌种口阀门，用无菌袋子密封备用。将温度设定到低于室温，打开气泵，关闭蒸气分阀门，打开空气总阀门，吹干滤芯，让无菌空气进入罐内，调整罐压在0.03—0.05MPa，关闭过滤器下面的排气阀门，让整个系统保持正压。结束后用75%医用酒精棉球把发酵罐顶部中心的接种口阀门封好。

3、装料灭菌

首先关闭灭菌补料罐蒸气总阀门与出料口阀门，将补料罐内加入所需装量70%的水(若水质太差需进行净化处理)，打开灭菌补料罐电源开关，温度设定到95℃，把所有原料用热水溶解在一起，当补料罐内温度升到950℃时，打开出料口阀门通入少量空气，在空气的搅拌下先加入消泡剂，当料液温度接近95℃时，关闭出料口阀门，超过95℃后关闭补料罐上所有阀门；将温度设定到121℃，打开计时器(灭菌时间设定30分钟)；将热交换器循环水管道接好，达到灭菌温度后，将灭菌罐顶部的加料口阀门，排气阀门都打开一点，让蒸气排出少许，对其灭菌，达到灭菌时间后，关闭加热电源及灭菌罐顶部所有阀门。先从灭菌补料罐下面的排污口排出500mL—1000mL料液，再将降温循环水通上，然后打开补料罐出料口阀门，将灭好菌的培养料，通过热交换器降温后进入发酵罐，将灭菌温控仪温度控制在25℃以下。

4、接种

提前2个小时用臭氧把培养室所有环境进行消毒，然后取出培养好的摇瓶种子，在酒精火焰保护下从接种阀门将菌种接入，--般二人配合进行，用浸湿酒精的火环套在接种口上，关闭进气阀门，打开排气阀门，让发酵罐内压力归零，第一人点着火环，用镊子拿掉接种阀门口的酒精棉球，打开接种阀门，第二人手持摇瓶，将金属管口放入火焰内，第一人用镊子拔掉管头内的棉塞，第二人将管子插入接种阀门内，斜提摇瓶接入菌种，接完后拔出管子，关闭阀门，去掉火环，接种口重新用75%医用棉球封好，打开进气阀门，通入无菌空气、发酵培养。

5、发酵液的培养

接种后以180转/分的叶轮速度搅拌培养 72小时,中间每隔12小时取样检测糖、氮、pH值、液体无菌度。放罐标准是发酵液pH值下降至5,残糖含量降至2.5左右,氨态氮不超过30毫克/升,菌球浓度达到1000～1500个/毫升,或经3000转/分离心10分,固形物湿重在20～25克/100毫升。检查发酵液质量项目包括:纯度检查,镜检或平板培养无细菌、霉菌;活力检查,镜检菌球边缘菌丝分枝细密,用结晶紫染色时着色深,菌丝细胞原生质尚未出现凝集现象,醪液静止5分,固形物不下沉;菌球大小,80%菌球直径小于1毫米; 将温控仪温度设定到23—25℃，罐内压力保持0.03—0.04MPa，通气量：料：气在1：（0.2—0.5）v/v发酵10天即可。

四、桦褐孔菌液体分离过滤（发酵液的制备）

1、使用专用过滤机在温度23～25℃开始过滤，要求滤网达到120目，回流过滤液10分钟，收集澄清的滤液。即得桦褐孔菌发酵液。

2、一次杀菌：过滤所得的液体经超高温瞬时杀菌机杀菌，杀菌温度(110±5)℃，时间10秒。杀菌过的液体放至暂存罐急速冷却到50～55℃，进行浓缩。

3、真空浓缩：在真空度0.096～0.099兆帕、液体温度50～55℃、蒸汽压力0.196～0.294兆帕下浓缩，浓缩至可溶性固形物达42％～45％后进行二次杀菌。

4、二次杀菌：将浓缩好的液体用液体灌装机将液体装入专用瓶（袋）中，然后在90℃杀菌30分钟。

5、冷藏：将成品在-18～-25℃冷库中恒温冷藏。

6、产品质量指标

（1）．感官指标

　　色泽：黑褐色液体，半透明；滋味及气味：具有桦褐孔菌特有的香气及气味，稀释到原汁浓度时无焦糊味，无异味；组织形态：组织为半透明均匀液体，五分层、沉淀现象；杂质：无外来杂质。

（2）．理化指标

　　可溶性固形物42％±1％；pH值5.0～7.0。

（3）．微生物指标

　　细菌总数≤3000个／毫升；大肠菌群、致病菌不得检出。

五、过滤固形物冻干磨粉（发酵粉的制备）

1、将桦褐孔菌发酵液过滤固形平铺于冻干盘内，滤上物平铺于冻干盘时应保持其高度均匀，以减少冻干后含水量的批内差，高度不可大于2cm，以免影响冻干效果；

2、冻干盘内待冻干物高度不能低于1.5cm；

3、开启冻干机，运行情况见下表：

                                                 

4、把过滤后的发酵固形物用低温冻干设备全部干燥后，再用低温磨粉设备磨成120目的细粉，再进行真空包装保存。