一种解淀粉芽孢杆菌Z16-1水酶法提取樟树籽仁油的方法

摘要

一种解淀粉芽孢杆菌Z16-1水酶法提取樟树籽仁油的方法，包括解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液的制备；樟树籽仁油湿法粉碎；酶解处理；离心分离；变温处理破乳化释放樟树籽仁油等步骤。本发明所产发酵酶液水解樟树籽仁蛋白的效果比国内常用产中性蛋白酶菌所发酵酶液更好，更适宜应用于水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂中。本发明克服了压榨法提取植物油脂技术中枯饼中残油率较高、溶剂浸出法提取植物油脂技术中存在有机溶剂残留问题，同时可到较高品质的动物饲料和有机肥料，樟树籽资源的利用率较高。本发明樟树籽仁油得率高于55％(相对于樟树籽仁质量)，樟树仁油提取率高于95％(相对于樟树籽仁含油量)，酸价升高值小于1.0。

说明书

技术领域

本发明属于农业领域，涉及水酶法提取樟树仁油。

背景技术

樟树籽仁油的中碳链甘油三酯含量高于94％，不仅可作为优良的功能食用油，同时也是生产新一代肠外营养剂——结构脂质(Structure Lipids，SLs)、中碳链食品添加剂、化妆品乳化剂等的优良原材料。我国樟树资源十分丰富，在黄河以南地区有大量种植，目前我国樟树籽年产量近3万吨，樟树籽仁油年产量可达1万吨以上，然而这些资源仍未得到合理的开发利用。

到目前为止，国内外工业化生产中提取植物油脂的工艺技术仍以压榨法和预压-有机溶剂浸出法为主。压榨法提取植物油脂得率低于90％，粕中含油率达7％以上，同时植物油料蛋白变性严重难以被提取利用。预榨-有机溶剂浸出法提取植物油脂需要使用正己烷、石油醚等有毒、易燃有机溶剂，生产过程中存在易燃易爆安全隐患，产品存在有机溶剂残留等问题。

水酶法提取植物油脂是将油料经过机械破碎后，加入蛋白酶等生物酶充分破坏油料细胞组织释放油脂，最后经离心分离植物油脂和水解蛋白质。该法不仅提油品质好、提取条件温和、能耗低、过程安全，而且油脂得率较高(大于94％)，能同时能获得植物蛋白，体现了油脂生产和研发领域的发展方向。然而该法也存在油脂易被分解、使用的生物酶成本过高等缺点，至今无法应用于工业化生产中。水酶法提取油脂中使用的中性蛋白酶基本上是枯草芽孢杆菌AS1.398、栖土曲霉3942、放线菌166等菌株所生产的。研究发现，采用这些菌株所产中性蛋白酶液的水酶法提取樟树籽仁油，樟树籽仁油的得率小于83％、酸价大于5mgKOH/g。造成樟树籽仁油得率低、酸价高的原因是樟树籽仁油中的中碳链脂肪酸甘油酯对枯草芽孢杆菌AS1.398等革兰氏阳性菌、霉菌及生物酶具有较强的抑制作用，枯草芽孢杆菌AS1.398产脂肪酶活力较高(产脂肪酶活力都在30U/mL以上)。筛选耐MCFA、产中性蛋白酶能力强、产脂肪酶能力很弱的菌株，是提高水酶法提取樟树籽仁油得率，大幅降低水酶法提取植物油脂技术的生产成本，实现水酶法提取植物油脂技术的工业化生产应用的关键。

发明内容

本发明的目的是提出一种解淀粉芽孢杆菌Z16-1水酶法提取樟树籽仁油的方法。

本发明所使用的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z16-1 CGMCC No.10727，已于2015年4月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10727。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明包括以下步骤：

1、解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液的制备

将活化好的解淀粉芽孢杆菌Z16-1接种到普通肉汤培养基中，37℃、200～240r/min摇瓶培养22～26h，制得种子液。以2～4％(v/v)接种量将种子液接种到发酵培养基中，37℃、200～240r/min摇瓶培养42～46h，将发酵液4000～5000r/min离心6～10min，所得上清液即为解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液。

肉汤培养基的优化配方为：蛋牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

发酵培养基的优化配方为：玉米粉45g，麸皮25g，豆粕40g，CaCl₂ 3g，KH₂PO₄ 0.3g，Na₂HPO₄·12H₂O 4g，水1000mL，pH 7.5，，121℃灭菌20min。

优化培养条件为：37℃、220r/min摇瓶培养24h，制得种子液。种子液以3％(v/v)的接种量接种到发酵培养基，37℃、220r/min摇瓶培养44h。

2、樟树籽仁油湿法粉碎

将樟树籽仁与水按1:4～1:5(g/ml)混合，加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎6～10min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液A。

3、酶解处理 

将樟树籽仁油-蛋白-水乳液A 4000～5000r/min离心分离20～30min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相和下层固相混合，加入10～20％(v/v)解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液，35～45℃酶解3.0～5.0h，之后加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎6～10min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液B。

优化酶解处理条件为：解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液加入量15％(v/v)，酶解温度40℃，酶解时间4.0h，

4、离心分离 

将樟树籽仁油-蛋白-水乳液B 4000～5000r/min离心分离20～30min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相进入喷雾干燥工序，所得粉末即为樟树籽仁蛋白粉，可用做动物饲料。下层固相气流干燥后可用做植物有机肥料。

5、变温处理破乳化释放樟树籽仁油

将变温罐降温至-5～-15℃保温2.0～4.0h，然后45～65℃保温处理1.5～3.5h。将变温处理后的料液4000～5000r/min离心20～30min，油相转入储油罐，固相(湿蛋白)进入气流干燥工序。

樟树籽仁油得率达到50.0％以上(相对于樟树籽仁质量)，樟树籽仁油提取率达到95.0％以上(相对于樟树籽仁含油量)，酸价升高值小于1.0。

油脂得率定义为：获得的油脂质量/油料质量。油脂提取率定义为：获得的油脂质量/油料中含油质量，其中油料中的含油质量采用国标GB/T 14772-2008法测定。酸价定义为：中和1g油脂中所含脂肪酸所需的KOH毫克数，采用国标GB/T 5530-2005法测定，单位为(KOH)/(mg/g)。

本发明使用的解淀粉芽孢杆菌Z16-1所产发酵酶液水解樟树籽仁蛋白的效果比国内常用产中性蛋白酶菌所产发酵酶液更好，更适宜应用于水酶法提取樟树籽仁油等中 碳链油脂中。解淀粉芽孢杆菌Z16-1种子液的最佳培养条件为37℃、220r/min摇瓶培养24h。解淀粉芽孢杆菌Z16-1的最佳培养条件为以3％(v/v)接种量将种子液接种到发酵培养基，37℃、220r/min摇瓶培养44h。解淀粉芽孢杆菌Z16-1水酶法提取樟树籽仁油的最佳发酵酶液加入量为15.0％(v/v)，最佳酶解温度40℃，最佳酶解时间为4.0h。在此条件下，樟树籽仁油得率55.2％(相对于樟树籽仁质量)，樟树仁油提取率95.1％(相对于樟树籽仁含油量)，酸价升高值小于1.0。比国内常用产中性蛋白酶菌水酶法提取樟树籽仁油的得率(约为84.5％)高10％以上。此方法克服了压榨法提取植物油脂技术中枯饼中含油率较高(高于6％)、溶剂浸出法提取植物油脂技术中存在有机溶剂残留问题，同时可到较高品质的动物饲料和有机肥料，樟树籽资源的利用率较高。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

实施例1。

1、取一环活化好的解淀粉芽孢杆菌Z16-1接种到肉汤培养基中(50mL肉汤培养基装在250mL的锥形瓶中)，37℃、220r/min摇瓶培养24h，制得种子液。将种子液以3％(v/v)接种量接种到发酵培养基中(100mL发酵培养基装在500mL锥形瓶中)，37℃、220r/min摇瓶培养44h，将发酵液4500r/min离心8min，所得上清液即为解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液。

2、取樟树籽仁500g(樟树籽仁油含量58.0％)、水2L，加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎8min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液A。

3、将樟树籽仁油-蛋白-水乳液A 4500r/min离心分离25min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相和下层固相混合，加入15％(v/v)解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液，40℃酶解4.0h，之后加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎8min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液B。

4、将樟树籽仁油-蛋白-水乳液B 4500r/min离心分离25min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相进入喷雾干燥工序，所得粉末即为樟树籽仁蛋白粉，可用做动物饲料。下层固相气流干燥(或晒干)后可用做植物有机肥料。

5、将变温罐降温至-10℃保温3.0h，然后55℃保温处理2.5h。将变温处理后的料液4500r/min离心25min，油相转入储油罐，得到樟树籽仁油279g，樟树籽仁油得率55.8％(相对于樟树籽质量)，樟树仁油提取率96.2％(相对于樟树籽仁含油量)，酸价为2.5。步骤4与步骤5中的水相合并，经喷雾干燥后得到蛋白粉80g。步骤4与步骤5中的渣相合并，经气流干燥后得到有机肥料126g。

实施例2。

1、取一环活化好的解淀粉芽孢杆菌Z16-1接种到肉汤培养基中(50mL肉汤培养基装在250mL的锥形瓶中)，37℃、200r/min摇瓶培养26h，制得种子液。将种子液以2％(v/v)接种量接种到发酵培养基中(100mL发酵培养基装在500mL锥形瓶中)， 37℃、200r/min摇瓶培养46h，将发酵液5000r/min离心6min，所得上清液即为解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液。

2、取樟树籽仁500g、水2L，加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎6min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液A。

3、将樟树籽仁油-蛋白-水乳液A 5000r/min离心分离20min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相和下层固相混合，加入20％(v/v)解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液，45℃酶解3.0h，之后加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎6min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液B。

4、将樟树籽仁油-蛋白-水乳液B 5000r/min离心分离20min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相进入喷雾干燥工序，所得粉末即为樟树籽仁蛋白粉，可用做动物饲料。下层固相气流干燥(或晒干)后可用做植物有机肥料。

5、将变温罐降温至-5℃保温4.0h，然后45℃保温处理3.5h。将变温处理后的料液5000r/min离心20min，油相转入储油罐，得到樟树籽仁油276g，樟树籽仁油得率55.2％(相对于樟树籽仁质量)，樟树仁油提取率95.1％(相对于樟树籽仁含油量)，酸价为2.6。步骤4与步骤5中的水相合并，经喷雾干燥后得到蛋白粉82g。步骤4与步骤5中的渣相合并，经气流干燥后得到有机肥料128g。

实施例3。

1、取一环活化好的解淀粉芽孢杆菌Z16-1接种到肉汤培养基中(50mL肉汤培养基装在250mL的锥形瓶中)，37℃、240r/min摇瓶培养22h，制得种子液。将种子液以4％(v/v)接种量接种到发酵培养基中(100mL发酵培养基装在500mL锥形瓶中)，37℃、240r/min摇瓶培养42h，将发酵液4000r/min离心10min，所得上清液即为解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液。

2、取樟树籽仁500g、水2L，加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎10min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液A。

3、将樟树籽仁油-蛋白-水乳液A 4000r/min离心分离30min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相和下层固相混合，加入10％(v/v)解淀粉芽孢杆菌Z16-1发酵酶液，35℃酶解5.0h，之后加入内外齿间隙为0.2～0.4mm的胶体磨中湿法粉碎10min，得到樟树籽仁油-蛋白-水乳液B。

4、将樟树籽仁油-蛋白-水乳液B 4000r/min离心分离30min，上层油乳相转入变温处理罐。中层水相进入喷雾干燥工序，所得粉末即为樟树籽仁蛋白粉，可用做动物饲料。下层固相气流干燥(或晒干)后可用做植物有机肥料。

5、将变温罐降温至-15℃保温2.0h，然后65℃保温处理1.5h。将变温处理后的料液5000r/min离心20min，油相转入储油罐，得到樟树籽仁油277g，樟树籽仁油得率55.4％(相对于樟树籽仁质量)，樟树仁油提取率95.4％(相对于樟树籽仁含油量)，酸价为2.6。步骤4与步骤5中的水相合并，经喷雾干燥后得到蛋白粉84g。步骤4与步骤5中的渣相合并，经气流干燥后得到有机肥料132g。