一种同时制备伏马毒素B1,B2和B3标准品的方法

摘要

本发明提供了一种同时制备伏马毒素B1，B2和B3标准品的方法，该方法包括如下步骤：样品提取；粗净化；中压制备。本发明的同时制备伏马毒素B1、B2和B3标准品的方法稳定、成熟，能够适用于玉米、大米、小麦、PDA等多种谷物基质中的伏马毒素的制备，成本低廉、制备流程高效快捷，标准品纯度高，效果好。

说明书

技术领域

本发明涉及农产品安全检测技术领域，具体地说涉及一种同时制备伏马毒素B1， B2和B3标准品的方法。

背景技术

伏马毒素是由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)在一定温度和湿度条件下繁 殖产生的水溶性次级代谢产物，其中最为重要的是伏马毒素B1，B2和B3，能够广泛 污染玉米、小麦、大米等农作物，具有神经毒性、肺毒性、肝毒性、肾毒性、致癌性， 并具有一定的免疫毒性、胚胎毒性和植物毒性，给人畜的生命健康和财产安全带来了 严重的危害。

由于伏马毒素的较强的毒性及广泛分布的特性，已经引起了世界范围内的高度重 视，目前已经开展了伏马毒素B1、B2和B3的检测技术的研究。其中，标准品是计量 活动尤其是化学计量活动的重要载体。研制伏马毒素标准品，对确保各级、各部门检 测数据的量值统一、准确和可溯源性，继而实现测量结果的国际互认和为政府决策提 供准确依据具有重要意义，并且其在促进社会发展和推动经济建设中也将发挥着越来 越重要的作用。此外，开展伏马毒素的筛查、形成机理、代谢规律及危害评估等方面 的研究，也必须用到大量的伏马毒素标准品。

但是，关于伏马毒素标准品的制备技术研究非常薄弱，现有的商品化的伏马毒素 B1，B2和B3标准品主要由国外进口，价格非常昂贵，其中伏马毒素B1的价格即上千 元每毫克，而伏马毒素B3甚至达到了近万元每毫克。以最为便宜的小鼠毒理学实验 为例，假如单次灌胃给药20毫克，一次实验的成本即近10万元，这显然是不可实现 的。标准品价格的昂贵导致很多科学研究无法继续下去。

国内外现有伏马毒素分离纯化的文献报道较少，主要是通过硅胶层析柱结合薄层 色谱法和离心分配色谱法进行粗分离，但这些方法都存在着一次处理样品量少、纯度 较低、回收率不高和制备效率较低等缺点。因此，建立一种能够用于多种伏马毒素的 同时制备方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时制备伏马毒素B1，B2和B3标准品的方法，该方 法包括如下步骤：

样品提取：将样品先采用有机溶剂和水的混合溶液提取；

固相萃取柱净化：提取液经过正离子交换前处理固相小柱粗净化；

中压制备：分别通过反相和正相制备色谱柱分离制备伏马毒素B1、B2和B3的标 准品。

该方法十分适合小麦、玉米、大米、PDA等谷物基质中伏马毒素B1、B2和B3标 准品的纯化制备。

具体的说：

(1)提取样品为能够被伏马毒素B1、B2和B3污染的谷物样品，如玉米、小麦、 大米、PDA或其它谷物样品；

(2)提取液为有机溶剂和水的混合液，其中有机溶剂为甲醇、乙腈或其它性质 相似的有机溶剂；有机溶剂与水的比例为：5/95-95/5(v/v)；提取溶剂与样品的比 例为：0.1/1-100/1(v/m)；提取方式为：超声、震荡、均质或者其它，提取时间为 10min-4h；

(3)用于粗净化的前处理固相小柱为阳离子交换柱，其填料为阳离子交换材料， 如MAX小柱，MultiSep 211Fum小柱或其它类似特征填料的固相净化柱；液体流速(包 括上样液、淋洗液、洗脱液)为0.1-10mL/min；

(4)中压制备的第一步为反相制备色谱制备，所采用的制备色谱柱的填料为反 相填料，如Unitary C18制备色谱柱(10mm×250mm，5μm)或其它类似制备柱； 流动相A相为乙腈、甲醇或其他有机溶剂，B相为水、或含有甲酸或乙酸的水溶液， 甲酸或乙酸与水的比例为0.1％-5％(v/v))，进样量为0.1-5mL；

(5)中压制备的第二步为正相制备色谱精制备，所采用的制备色谱柱的填料为 正相填料，如Semi-Preparative SB-CN制备色谱柱(9.4mm×250mm，5μm)或其 它类似制备柱；流动相A相为乙腈、甲醇或其他有机溶剂，B相为水、或含有甲酸或 乙酸的水溶液，甲酸或乙酸与水的比例为0.1％-5％(v/v))，进样量为0.1-5mL。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)首次建立了一种能够同时用于伏马毒素B1、B2和B3三种标准品的制备方 法；

(2)与现有的单种伏马毒素制备方法相比，建立的制备方法更加高效快捷，在 48h内即可获得伏马毒素B1，B2和B3三种标准品各10mg；

(3)制备获得的伏马毒素标准品纯度均高于98％，满足实验需要；

(4)实验流程固定，可重复性强，一般实验人员简单培训即可完成，实用性强；

(5)制备成本低廉，主要是仪器的消耗，三种标准品(10mg)消耗成本总价不 足2000元。

本发明的伏马毒素B1、B2和B3的制备方法稳定、成熟，能够适用于玉米、大米、 小麦、PDA等多种谷物基质中的伏马毒素的制备，成本低廉、制备流程高效快捷，标 准品纯度高，效果好。

附图说明

图1为实施例一制备获得的伏马毒素B1、B2和B3三种标准品的LC-MS/MS定性 分析结果，A为母离子图，B为子离子碎片图。

图2为实施例一制备获得的伏马毒素B1、B2和B3三种标准品谱图

其中：(a)：伏马毒素B1的H谱

(c)：伏马毒素B2的H谱

(e)：伏马毒素B3的H谱

(b)：伏马毒素B1的C谱

(d)：伏马毒素B2的C谱

(f)：伏马毒素B3的C谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

Oasis MAX固相萃取柱(Waters公司，美国)

Unitary C₁₈制备色谱柱(华谱新创科技有限公司，中国)

Semi-Preparative SB-CN制备色谱柱(Agilent公司，美国)

Thermo C18色谱柱(Thermo Fisher公司，美国)

超高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(UPLC-PDA)(Waters公司，美国)

实施例一 伏马毒素B1、B2、B3标准品的制备

1、样品提取

将烘干后的被伏马毒素污染的大米样本(随机市售大米，筛选出被伏马毒素污染 的样品)放入固体粉碎机中粉碎，通过1mm孔径网筛过滤。取200±0.01g样品粉 末置于2000mL广口瓶中，加入1000mL乙腈-水(50:50，v/v)溶液置摇床150rpm 振荡过夜，然后以whatma5滤纸过滤。将滤饼用1000mL乙腈-水(50:50，v/v)重 悬，150rpm振荡2h，过滤。合并两次滤液后置旋转蒸发仪40℃浓缩至提取液中乙 腈的含量为10％(v/v)左右。

2、固相萃取柱净化

取20mL提取液置于50mL离心管中，加入10mL正己烷，3000r/min离心10min， 弃上清液和中间油污，取下层溶液过MAX柱。MAX柱依次用5mL甲醇和5mL甲醇- 水(3:1，v/v)活化，然后加入10mL样品液，再依次加入5mL甲醇-水(3:1，v/v) 和5mL甲醇淋洗MAX小柱，最后用10mL甲醇-乙酸(99:1，v/v)洗脱，收集洗脱 液，在40℃氮气吹干，残渣用乙腈-水(50:50，v/v)定容至1mL，过0.22μm滤 膜后待用。

3、中压制备

3.1Unitary C₁₈制备色谱柱制备

色谱条件：Unitary C₁₈制备色谱柱(10mm×250mm，5μm)；流动相A为含0.1％ 甲酸的水溶液(v/v)，流动相B为乙腈；流速3.0mL/min；进样量1000μL。洗脱 条件设置见表1。

表1 制备液相色谱梯度洗脱条件

3.2Unitary C₁₈制备色谱柱馏分采集

经Unitary C₁₈制备色谱柱分离使FB₁、FB₂和FB₃完全分离，在不同时间段内分别 采集FB₁、FB₂和FB₃馏分，不同样品之间分别设置洗针程序，防止不同样品交叉污染。 不同样品收集及洗针时间设置如表2。

表2 不同馏分收集和洗针时间设置

3.3Semi-Preparative SB-CN制备色谱柱制备

色谱条件：Semi-Preparative SB-CN制备色谱柱(9.4mm×250mm，5μm)； 流动相为A为乙腈，流动相B为含0.1％甲酸的水溶液(v/v)，具体条件如表3。

表3 Semi-Preparative SB-CN色谱柱制备条件

4.冷冻干燥

将获得的含FB₁、FB₂、FB₃的溶液在40℃条件下旋转蒸发除去有机相，然后进一 步置于-80℃保存过夜后置冷冻干燥机(LL3000冷冻干燥机，丹麦Heto Powerdry 公司)干燥，直至完全冻干，将固体粉末取出(三种标准品的制备效率均在60％以上)， -20℃保存。

实施例二

对实施例一制备得到三种标准品进行定性分析及纯度测定

1液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)定性分析

LC-MS/MS条件：Thermo C18色谱柱(2.1mm×100mm，5μm)；流动相A为甲 醇，流动相B为含0.1％甲酸的水溶液(v/v)；梯度洗脱：0～1mim，50％B～50％B；1-7 min，50％B～100％B；7～8min，100％B～100％B；8～8.2min，100％B～50％B；8.2～9.0 min，50％B～50％B；流速为300μL/min；进样量5μL；柱温30℃。碎裂电压为 1.5V；喷雾电压为3.5kV；雾化气压采用电喷雾ESI离子源(正负离子均采用)，扫 描力3500Pa；毛细管温度为350℃；鞘气压45Pa；辅助气压15Pa。扫描范围m/z 300～800；子离子碎片碰撞电压为30eV。

获得的FB₁、FB₂、FB₃制备品在正负离子模式下(ESI^-和ESI⁺)进行全扫描，负离 子下无峰，表明所得制备品不容易负离子化，然后正离子模式下(ESI⁺)得到单一、 高峰度的色谱峰。对特征峰进一步定性，在正离子模式下进行母离子扫描，FB₁、FB₂、 FB₃化合物的主要分子离子峰如图1-A，为722.30[M+H]+、706.30[M+H]⁺、706.30 [M+H]⁺；FB₁、FB₂、FB₃主要分子离子峰的主要二级碎片如图1-B，在ESI⁺模式下分子 离子峰722.30[M+H]⁺的主要二级碎片为352.30[M+H-2TCA-H₂O]⁺、 334.30[M+H-2TCA-2H₂O]⁺和704.35[M+H-H₂O]⁺；分子离子峰706.30[M+H]⁺的主要二级碎 片为354.30[M+H-2TCA]⁺、336.30[M+H-2TCA-H₂O]⁺和318.30[M+H-2TCA-2H₂O]⁺；以上数 据与文献报道(Journal of Separation Science,2010,33:2723–2733.)的FB₁、 FB₂、FB₃基本一致，鉴定化合物为FB₁、FB₂、FB₃。

2核磁共振鉴定

NMR鉴定是鉴定化合物结构的一种有效手段，FB1、FB2、FB3的1H和13C核磁图 谱如图2，与文献报道(Advances in Experimental medicine and Biology.1996,392: 75-91)中基本一致，进一步证明制备得到的是高纯度的FB1、FB2、FB3。

3超高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(UPLC-PDA)全扫描

用乙腈-水(50:50，v/v)将制备得到的FB1、FB2、FB3稀释100倍后在200nm-400 nm条件下进行全扫描。UPLC-PDA的流动相为：A相：乙腈；B相：水。线性梯度洗脱 梯度条件为：0-7min 10-100％A；7-8min 100％A；8-8.1min 100-10％A，8.1-10min 10％A。流速为0.3mL/min，扫描波长为210-400nm。

通过UPLC-PDA全扫描对FB1、FB2、FB3制备品进行纯度分析，结果发现通过 Unitary C18柱制备获得了较为纯净的标准品，但是仍然有一定的杂质峰，与其相比， 经Semi-Preparative SB-CN制备柱二次分离纯化后，无明显吸收峰，可以得到高纯 度的伏马毒素。

4LC-MS/MS外标法定量测定纯度

分别精确称取制备得到的FB1、FB2、FB3固体17.168mg、8.581mg、6.460mg 于25mL容量瓶中，用乙腈-水(50:50，v/v)定容至25mL，混匀，然后依次稀释 10²、10³、10⁴、10⁵倍，进LC-MS/MS测定。LC-MS/MS采用多反应监测模式进行测定， 监测参数如表4所示。

表4 FB1，FB2和FB3的质谱参数

FB1、FB2、FB3分别称量5次，以减少误差。称量结果如表5。然后采用商品化 的标准品作为参考进LC-MS/MS分析，检测得到不同稀释倍数样品的浓度与纯度如表 6，得出制备的伏马毒素的纯度分别为纯度98.760±0.12％、99.009±0.08％、 98.838±0.65％。

表5 FB₁、FB₂和FB₃称量结果

表6 不同制备样品的浓度和纯度

综上可见，本发明的一种同时制备伏马毒素B1、B2和B3的方法可以有效的对玉 米、小麦、大米、PDA等多种谷物中的伏马毒素B1、B2和B3制备纯化，方法快捷有 效，在48小时内即可获得3种真菌毒素标准品各10mg，并且方法的重现性高，制备 效果好(标准品纯度均高于98％)。与现有的商品化的标准品相比，在保证纯度的前提 下，极大的节省了成本，能够促进后续的检测、代谢、毒理等各个方面的研究。

本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改 都属于本发明的保护范围。