一种研究水稻与病原物互作模式的方法

摘要

本发明公开了一种研究水稻与病原物互作模式的方法，属于植物生物技术领域。本发明综合应用转录组、蛋白质组及miRNA组研究水稻响应病原物侵染的互作模式的方法，其具体步骤包括：A.别取接种病原物前后不同时间点的抗病材料及感病材料的水稻叶片总RNA、Small RNA及总蛋白；B.分别进行差异表达谱分析、差异蛋白质组学分析及miRNA鉴定及其靶基因分析；C.将三种方法鉴定出差异基因、蛋白、miRNA靶基因进行整合、关联以揭示水稻与病原物互作过程中所激活或抑制的抗、感病反应途径，从而可以较为系统的阐明水稻-稻瘟病菌的互作机制。本发明所述的方法能快速和有效地筛选到与水稻抗病相关联的候选基因。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种研究水稻与病原物互作模式的方法，更具体为基于转录组、蛋白质组(iTRAQ)及miRNA组联合研究水稻-稻瘟病菌互作机制的方法。

背景技术

水稻(Oryza Sativa)是世界上重要的粮食作物之一，养活着全球半数以上的人口。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病，是水稻生产上的重要限制因素，它具有传播速度快、发生范围广、危害严重等特点。随着水稻和稻瘟病菌全基因组测序计划的相继完成，水稻-稻瘟病菌的互作机制研究已成为植物-病原物互作机制研究的模式系统。

水稻与稻瘟病菌的互作是一个十分复杂和动态的过程，涉及到众多基因的表达与调控而形成的连续信号逐级传导的过程，主要包括三个阶段：信号分子的产生和识别，通常有JA、SA及ET等植物激素类信号，Ca²⁺、活性氧(ROS)及一氧化氮(nitric oxide,NO)等第二类信使类信号，谷胱甘肽(glutathione,GSH)等小分子肽类、脂类和糖类等信号分子；细胞内信号的传导，如跨膜GTP结合蛋白、胞间Ca²⁺通道、钙依赖性蛋白激酶CDPK、促分裂原活化蛋白激酶MAPK的级联以及磷酸酶催化的蛋白质的磷酸化/去磷酸化；防卫反应的开启和系统获得抗性的产生。而每次的传导都可产生相应的生化反应，从而发挥相应的生理功能，完成特定的生物学效应。

前人已经分别采用多种方法进行了水稻响应稻瘟病侵染的差异组学研究，然而都是单一的转录组或蛋白质组学的研究。其中，基因芯片技术主要揭示mRNA水平的变化，单纯依赖该技术并不能客观真实地揭示植物与病原物的具体互作机制，而蛋白质组学技术也大多数采用基于2D电泳分离和质谱鉴定联合应用，属于对于一个细胞或组织的蛋白质进行的定性研究，仅能确定蛋白质的身份但不能对蛋白质的功能给出最终定论。虽然差异蛋白质组学能显著克服差异转录组学的局限性，但实际上蛋白的表达变化与基因的表达变化并不十分一致，这可能是由mRNA的剪接、翻译调控或翻译后加工和蛋白质降解等因素引 起的，这无疑会影响对植物与病原物的互作机制的真实阐明，而miRNA的鉴定则可以很好的将蛋白质组学与转录组学的结果有机的统一起来。因此，采用单一的方法与技术去研究稻瘟病抗病性反应，难以真正的揭示其复杂的分子抗性机制，而综合利用转录组学、定量蛋白质组学(iTRAQ)进行差异组学的分析，两者不匹配的地方进一步借助miRNA进行分析以确定转录后水平或者蛋白质翻译水平是否被调控所导致的，有望较为全面真实的揭示水稻-稻瘟病的具体互作机制以进一步阐明植物抗病的分子机理。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点与不足，提供一种研究水稻与病原物(稻瘟病菌)互作模式的方法，用以克服现有单一技术的研究效果不准确的问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种研究水稻与病原物互作模式的方法，综合应用转录组、蛋白质组(iTRAQ)及miRNA组研究水稻响应病原物侵染的互作模式的方法，其具体步骤包括：

A.别取接种病原物前后不同时间点的抗病材料及感病材料的水稻叶片总RNA、Small RNA及总蛋白；

B.分别进行差异表达谱分析、差异蛋白质组学(iTRAQ)分析及miRNA鉴定及其靶基因分析；

C.将三种方法鉴定出差异基因、蛋白、miRNA靶基因进行整合、关联以揭示水稻与病原物互作过程中所激活或抑制的抗、感病反应途径，从而可以较为系统的阐明水稻-稻瘟病菌的互作机制。

步骤A所述的病原物优选为稻瘟病菌。

步骤A所述的接种稻瘟病菌前后不同时间点优选为0h和24h两个时间点。

步骤A的具体步骤包括：分别取接种稻瘟病菌前后0h和24h两个不同时间点的抗病材料及感病材料的叶片，液氮研磨、离心、裂解处理，并分别进行总RNA、总蛋白及Small RNA的制备及相应的质量检测。

步骤B中所述的差异表达谱分析的具体步骤包括：使用RNA Clean-up(MN)纯化步骤A所得的RNA并进行双链cDNA的合成、纯化；然后体外转录合成生物素标记cRNA，纯化cRNA后进行cRNA的片段化处理；使用 Hybridization Oven 640将试验材料cRNA与芯片杂交；通过 Fluidics Station 450进行洗脱、染色；使用 Scanner3000扫描芯片，用Operating Software Version1.4软件分析芯片杂交图像，把图像信号转化为数字信号，并用dChip软件(http://www.dchip.org)做校正和标准化处理；每个探针在不同时间点和不同处理间比较以确定差异表达相关基因。

步骤B中所述的差异蛋白质组学(iTRAQ)分析的具体步骤包括：将步骤A所得的蛋白质样品进行进一步FASP酶解、肽段标记、SCX分级及LC-MS质谱分析，进一步对所得的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，进行GO聚类分析，选取差异倍数>1.2或<0.8、p-value<0.05的蛋白进行进一步分析初步确定差异表达相关蛋白。

步骤B中所述的miRNA鉴定及其靶基因分析的具体步骤包括：对步骤A所回收的18-30nt small RNA与5’adaptor、3’adaptor连接，并进行反转录；反转录产物于Solexa High-throughput Sequencer(Illumina,USA)进行测序，将Solexa测序所得的35nt序列，通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度及分布过程完成初级分析，进一步对初级分析所得到的序列作分类注释，获得样品中包含的各组分及表达量信息。对差异miRNA进行靶基因预测以得到可能调控的靶基因信息，并对靶基因进行Go分类及KEGG通路分析。

步骤C的具体步骤包括：对差异表达谱鉴定的差异基因、差异蛋白质组学鉴定的差异蛋白及miRNA预测的靶基因进行三者的关联分析，以较为全面地揭示水稻与稻瘟病菌互作的复杂分子机制。

步骤C中所述的差异表达谱鉴定的差异基因为差异倍数为2倍以上的基因。

步骤C中所述的差异蛋白质组学鉴定的差异蛋白为差异倍数为1.2倍以上的蛋白。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明能够较完整的鉴定出参与水稻-稻瘟病菌互作过程中的差异基因/蛋白，本发明实施例利用该方法鉴定了一些水稻响应稻瘟病侵染过程中的发生变化的基因/蛋白；本发明方法对深入揭示水稻-稻瘟病互作机制提供了一个方法借鉴；在利用转基因技术培育抗稻瘟病品种上具有重要的参考价值。其优点为：①能快速和有效地筛选到与水稻抗病相关联的候选基因；②本发明很好的利用基因芯片技术、iTRAQ技术及miRNA的深度测序等这些高通量、准确的组学研究手段来研究与水稻抗稻瘟病相关的候选基因/蛋白；③可以广泛应用于植物抗病等性状的研究和开发并且结合转基因技术来培育抗病性强的植物新品种。

附图说明

图1差异表达谱鉴定的部分差异基因的GO功能注释分析；其中注：

细胞组件(1-细胞、2-细胞部分、3-膜、4-细胞外区、5-细胞外区部分、6-高分子配合物、7-膜蛋白、8-细胞器、9-细胞器部分、10-合成酶、11-合成酶部分)分子功能(12-抗氧化、13-结合、14-催化活性、15-电子载体、16-酶调节、17-金属伴侣、18-转运活性、19-营养存储、20-结构分子、21-转录调节、22-翻译调节、23-运输、生物学途径(24-解剖结构的形成、25-生物粘连、26-生物调节、27-细胞组件发生、28-细胞组件组织、29-细胞进程、30-死亡、31-发育过程、32-定位的建立、33-生长、34-免疫过程、35-定位、36-运动、37-代谢过程、38-多种生物过程、39-多细胞生物过程、40-色素沉着、41-生殖、42、生殖过程、43-应激反应、44-周期性过程)

图2iTRAQ差异蛋白质组鉴定的部分差异蛋白的GO功能注释分析；其中注：

细胞组件(1-细胞、2-细胞部分、3-膜、4-细胞外区、5-细胞外区部分、6-高分子配合物、7-膜蛋白、8-细胞器、9-细胞器部分)分子功能(10-抗氧化、11-结合、12-催化活性、13-结构分子、14-转录调节、15-运输、生物学途径(16-解剖结构的形成、17-生物调节、18-细胞组件发生、19-细胞组件组织、20-细胞进程、21-死亡、22-发育过程、23-定位的建立、24-生长、25-免疫过程、26-定位、27-代谢过程、28-多种生物过程、29-多细胞生物过程、30-色素沉着、31-生殖、32、生殖过程、33-应激反应)

图3miRNA组调控的部分靶基因的GO功能注释分析；其中注：

细胞组件(1-细胞、2-细胞部分、3-细胞外区部分、4-高分子配合物、5-膜蛋白、6-细胞器、7-细胞器部分)分子功能(8-结合、9-催化活性、10-转运活性、11-结构分子、12-转录调节、13-运输、生物学途径(14-生物调节、15-细胞组件组织、16-细胞进程、17-死亡、18-发育过程、19-定位的建立、20-生长、21-定位、22-代谢过程、23-多细胞生物过程、24-色素沉着、25-生殖、26、生殖过程、27-应激反应)

图4三者鉴定所得到的差异蛋白(或基因)的关联；

图5基于三种方法的茉莉酸类物质(JA)的生物合成途径分析，其中注：正方形框为本研究中鉴定到的差异基因表达(|log2Ratio|≥1)；三角形框为本研究中鉴定到的已知及候选miRNA的靶基因；椭圆形框为本研究中利用iTRAQ鉴定到的蛋白质。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

实施例1

一种基于转录组、蛋白质组(iTRAQ)及miRNA组联合研究水稻-稻瘟病菌互作机制的方法

一、差异表达谱分析。

1.样品制备

水稻(H4)、中二软占(ZE)长至3-4叶期接种稻瘟病菌株GD0193，附模拟接种为对照；接种0h和24h后分别采集水稻叶片，放入冻存管中，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存备用；每个试验对象同时取完全备份的材料用于qRT-PCR验证。

使用Reagent(Invitrogen,USA)提取总RNA：称取约100mg叶片组织，液氮研磨至粉末状，转移到2.0mL离心管中，加入1mLReagent，振荡混匀；15-30℃温育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振荡15s后静置2-3min；4℃，12000rpm离心15min，将上层水相移至新的1.5mL离心管中，加入0.6mL异丙醇，室温放置10min；4℃，12000rpm离心10min，弃上清；加入1mL 70％乙醇洗涤，振荡样品，然后4℃，12,000rpm离心15min；去上清，空气干燥RNA样品；加入200μL DEPC水溶解，然后进一步进行RNA的沉淀：加1/10体积3M NaAc pH5.2和2.5倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置最少1h，4℃12000g离心20min；80％乙醇洗涤沉淀2次，空气干燥沉淀；DEPC处理水重新溶解沉淀然后进行RNA浓度和纯度测定。

2.cDNA制备

利用SuperScript^ⅡRT进行第一条cDNA链的合成，接着进行第二条cDNA链的合成，并用酚氯仿对其纯化、乙醇沉淀；参考BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit合成生物素标记的cRNA，并用QIAGEN RNeasy Columns纯化体外转录产物，进一步乙醇沉淀、纯度及浓度检测，并用片断化cRNA进行杂交。杂交条件如表1所示。

杂交前室温平衡探针，99℃，5min，通过加样孔加入适量体积1×Hybridization Buffer湿润芯片，45℃，60rpm预杂交芯片10min，45℃最大速离心5min，从 芯片中取出Buffer，加等体积处理好的杂交液，45℃，60rpm杂交芯片16h；进一步对芯片进行洗脱、染色、并利用Scanner 3000扫描芯片，用Gene Operating Software Version1.4软件分析芯片杂交图像，把图像信号转化为数字信号，并用dChip软件(http://www.dchip.org)做校正和标准化处理。

表1 杂交体系条件

3.数据分析

每个探针在不同时间点和不同处理间比较。用Clutster3.0软件将各样品中有效的检测信号值进行聚类分析，采用Hierachical，Average linkage，K-means算法进行聚类，分析芯片的重复性，对于筛选出的基因，利用分子功能注释系统MAS3.0的基因组数据库(http://www.capitalbio.com/zh-hans/support/MAS)，根据每个基因的TIGR登录号寻找对应的功能注释。根据荧光强度比值，对同一接种处理在不同时期间(0h和24h)的差异基因分别进行筛选。选择表达差异两倍基因(即log₂Ratio≥1或log₂Ratio≤-1)为显著差异的探针，在接种稻瘟病菌株GD0193后，共检测到1837个上调探针和2476个下调探针。排除模拟处理对照的影响，菌株GD0193的侵染能特异的诱导345个基因上调表达和215个下调表达。对这些差异表达基因进行简易GO分类(如图1)，结果显示大部分差异基因主要参与内源刺激反应、信号转导、生物刺激反应、蛋白修饰、细胞分化、电子传递、细胞分解代谢等生物学过程。其中内源刺激反应与信号转导分别占14％与13％，非生物刺激反应与胁迫反应分别占8％和10％，生物刺激、生物合成及蛋 白修饰分别占6％、9％和8％，脂质代谢与氨基酸及衍生物代谢都占5％和7％，而其他生物学过程都在5％以下。

二、差异蛋白质组学(iTRAQ)分析。

1.叶片总蛋白的提取

取水稻组织样品，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25ml提取液-20℃沉淀1h。离心10000rpm，45min，去除上清。空气干燥。按10:1加入SDT buffer(4％SDS，1mM DTT，150mM Tris-HCl pH8.0)，涡旋混匀，沸水浴5min。超声破碎(80w，超声10s，间歇15s，共10次)沸水浴5min，离心取上清，BCA法蛋白质定量，另取约20μg蛋白质样品进行12.5％SDS-PAGE电泳并进行考马斯亮蓝染色。

2.iTRAQ样品的准备 

取400μg样品，加入DTT，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μl UA buffer(8M Urea，150mM Tris-HCl，pH8.0)混匀，转入30kd超滤离心管，离心14000g，15min；加入200μl UA buffer离心14000g，15min，弃滤液。加入100μl IAA(50mM IAA in UA)，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g,10min。加入100μl UA buffer，离心14000g,10min重复2次。加入100μl Dissolution buffer，离心14000g,10min重复2次。加入40μl Trypsin buffer(4μg Trypsin in 40μl Dissolution buffer)，600rpm振荡1min，37℃16-18h。换新收集管，离心14000g 10min，取滤液，OD₂₈₀肽段定量。分别取各组样品约90μg，按照AB公司试剂盒：iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)说明书进行标记。将标记后的所有肽段混合，采用AKTA Purifier 100(GE Healthcare)仪器进行SCX预分级，收集穿流及洗脱fraction约30份，根据SCX色谱图每组样品合并成10份，冻干后C₁₈Cartridge(Sigma)脱盐。

3.质谱鉴定及数据分析

每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2cm*100μm 5μm-C18)，再经分析柱Thermo scientific EASY column(75μm*100mm 3μm-C18)分离，流速为250nl/min。相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0％到35％；100min-108min，B液线性梯度从35％到100％；108min-120min，B液维持在100％。每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长：120min，检测 方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z200，AGC target:3e6，一级Maximum IT:10ms，Number of scan ranges:1，Dynamic exclusion:40.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2scan)，MS2Activation Type:HCD，Isolation window:2m/z，二级质谱分辨率：17500at m/z 200，Microscans:1，二级Maximum IT:60ms，Normalized collision energy:30eV，Underfill ratio:0.1％。原始数据经降噪、去同位素等步骤获得峰图列表。同时建立参考蛋白序列数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定，鉴定的方法即使用专门的蛋白质鉴定软件Mascot2.2对参考数据库进行搜索。本试验所使用的数据库为uniprot_oryza.fasta。结果过滤参数为：Peptide FDR≤0.01。采用Proteome Discoverer1.3软件对肽段报告离子峰强度值进行定量分析。差异蛋白进行GO功能注释分析及验证

应用Mascot软件对样品间差异表达蛋白进行表达量计算，当同一蛋白在样品间的丰度比接近1时，表明该蛋白的表达量在样品间差异不显著，而当蛋白质丰度比达到1.2以上，且经统计检验P-value小于0.05时，认为此蛋白为两样品间的差异蛋白。在无菌水处理及稻瘟病菌侵染24h后，各组差异表达蛋白数量相当(309～322个)，上调表达为137～153个，下调为161～177个。

为了进一步挖掘稻瘟病菌诱导的差异蛋白的表达情况，利用Venny在线作图工具对各处理之间差异蛋白进行交集比对后发现，在稻瘟病侵染24h后，ZE品种特异性表达的蛋白有62个(28个上调，34个下调)，ZE和H4共同差异表达的蛋白有31个(15个上调，16个下调)，而H4品种则有88个差异表达蛋白(上调50个，下调38个)。进一步的对这些差异蛋白进行的GO注释分析发现：这些差异表达蛋白显著富集在生理过程、响应刺激、生物胁迫或非生物胁迫等、代谢等。

三、miRNA鉴定及其靶基因分析。

1.Small RNA的分离、回收及测序

将RNA样品加入等体积的8M尿素上样缓冲液，于80℃水浴中变性5min，迅速放到冰上2min以上，用微量进样器上样；500V电泳1.5h后，在紫外灯下，将对应于18-30nt的小分子RNA切下来，转移到1.5mL的离心管；加入1mL 0.3M乙酸钠(pH5.2)和40U Rnasin，16-25℃振荡2h；4℃，12000rpm离心10min。收集上清，并向胶中加入0.3M NaAc(pH5.2)，16-25℃振荡2h；4℃，12000rpm离心10min。收集上清，并向胶中加入0.3M NaAc(pH5.2)，16-25℃振荡过夜；4℃，12000rpm离心10min。收集上清，转移到1.5ml离心管中，每管0.33ml； 加入2μl肝糖原和3倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀20min或-20℃沉淀过夜；4℃，14000rpm离心30min。去上清，DEPC水溶解RNA，稀释RNA至300μl；加入33μl 3M乙酸钠(pH5.2)，900μl无水乙醇，2μl肝糖原混匀，于-80℃沉淀20min或-20℃沉淀过夜；4℃，14000rpm离心30min，去上清，70％乙醇洗涤RNA沉淀，空气干燥，加入40μL DEPC水和1μl RNasin溶解RNA，-80℃保存备用。按图2流程，构建small RNA测序文库。将回收的18-30nt small RNA与5’adaptor、3’adaptor连接，并进行反转录；反转录产物于Solexa High-throughput Sequencer(Illumina,USA)进行测序，由华大基因(深圳)完成。

2.测序结果的生物信息学分析。

将Solexa测序所得的35nt序列，通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度及分布等过程完成初级分析。将初级分析所得到的序列作分类注释，获得样品中包含的各组分及表达量信息。测序获得4个small RNA文库的数据，其统计结果见表2。A文库(ZE-CK)、B文库(H4-CK)、C文库(ZE GD0193)、D文库(H4-GD0193)分别获得10521573、14885325、12439284、13644512的高质量测序片段；去除无3’端序列、无插入序列、5’端接头污染等，8749036、12157795、9937360、11138187clean reads可分别于A、B、C、D 4个文库中获得。Clean reads分布于10-30nt间，主要以21nt、24nt为主。

表2 Small RNA测序数据产出统计

文库间的small RNA组成在不同的水稻品系间、不同处理间均表现一定程度变异。抗、感材料的small RNA组成在对照处理或者病原菌诱导下均表现较大差异，表明抗、感材料间在正常生长状况下表型差异等同样也可引起small RNA表达变异，79216(3.15％)和97743(10.73％)small RNA序列分别为对照处理的文库间(A、B)和病原菌处理的文库间(C、D)所共有；然而，文库间表现最显著的差异是由病原菌诱导中二软占文库(A、C)产生的，A、C文库间仅共有64782(2.72％)small RNA序列，且A文库具有所有文库内最丰富的small RNA序列；相反地，H4文库间(B、D)的变异是最小的，即病原菌诱导的抗病品系small RNA组成的变异最小，它们具有123609(11.94％)的相同序列。因此，不同的small RNA的表达谱应与水稻品系间的稻瘟病抗性差异相关。为了获取与病原菌诱导相关的已知miRNA，本研究将稻瘟病菌GD0193处理后的文库与对照文库进行比对，并分别使用log₂-ratio比较这些miRNA在不同文库中的相对表达量差异情况。ZE_GD0193与ZE_CK比较后，ZE和H4中分别有21个和28个miRNA在稻瘟病菌侵染后表达量显著升高，分别有102个和13个miRNA在稻瘟病菌侵染后表达量显著降低。

将4个文库中共296个miRNA提交到psRNATarget网站中，以MSU7.0为参考背景，共检测到149个靶基因，其中多个miRNA家族因其成员的成熟序列一致而靶向到同一个基因，也存在单个miRNA成员靶向多个基因。如miR156家族靶向SBP-box基因家族，miR164靶向3个NAC转录因子和OsFBX145。对这些靶基因进行功能预测发现，除转录调控外，这些基因还参与物质代谢，信号转导，胁迫响应，电子传递等生命过程(如图3)。

四、抗病相关的差异表达基因、蛋白及miRNA的关联。

将这些抗病相关的差异表达基因、蛋白及miRNA整合、进行关联性分析，由图4可以看出，水稻与稻瘟病菌互作过程中，差异基因在转录组水平与蛋白质组水平多数是一致的，但也有一部分表现并不一致，不一致的地方恰恰可能 是miRNA在转录(对mRNA)或者翻译水平(对蛋白质)上的调控所导致的。

水稻与稻瘟病菌互作的复杂过程中，抗病信号分子的产生及信号传导发挥着至关重要的作用。而这些信号分子中，植物激素则可依据不同激素之间的相互作用形成一个重要的抗病调控网络，其中，水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯(ET)与水稻的抗病性密切相关。本研究在稻瘟病菌诱导的差异表达基因及差异表达蛋白鉴定分析中，亦发现OsHI-LOX和OsAOS2上调表达，且转录水平上的变化(上调倍数)远大于翻译水平上的变化(上调倍数)。miRNA有可能参与调控了OsHI-LOX和OsAOS2的表达，进而控制JA的生物合成速度。并有研究表明JA含量在短暂时间内的增加就足以激活下游的JA应答基因，且AOS基因的过量表达实验亦证明相比组成型启动子CaMV35S，诱导型启动子PBZ1更能体现出AOS基因对JA合成的影响。

而AOS与HPL基因则同属于CYP74家族，催化共同的底物13-HPOT，进而分别生成JA和GLVs，导致GLVs和JA两条代谢途径既存在竞争关系也存在相互促进的关系。此外研究表明AOS基因沉默会减少JA的积累，增加GLVs的释放，而沉默HPL基因则有相反的结果。而本研究中亦鉴定到靶基因分别为OsAOS2和OsHPL3的候选miRNA，推测miRNA可能通过分别调控AOS与HPL基因的表达，进而控制GLVs和JA两条代谢途径的平衡关系，而不同外部胁迫(如稻瘟病菌侵染)诱导不同miRNA的表达，使GLVs和JA两条代谢途径向某个方向倾斜，来激活下游的防御体系。

研究中亦鉴定到多个与植物激素相关的差异表达基因(如OsAOS2、OsJMT1及OsACS2等)，差异表达蛋白(OsHI-LOX、OsPLDα及OsACX1等)，以及靶基因预测为植物激素(如OsPLDβ1、OsHPL3及OsEIL2等)的候选miRNA。而目前也有不少研究证实miRNA参与了多种植物激素的信号转导及代谢，如miR319的靶标是转录因子TCP的mRNA，TCP通过调控JA生物合成进程的关键酶基因LOX2从而控制着JA的生物合成；miR164可以降解转录因子NAC1的mRNA，从而下调AUX应答信号；OsmiR393过量表达下调了AUX的受体TIR1/AFB家族同源基因的表达。

本研究以茉莉酸JA生物合成途径为例，将受稻瘟病菌胁迫诱导的差异表达基因、抗病相关的蛋白及候选miRNA有机整合(图5)，从转录水平(mRNA)、miRNA调控水平(miRNA)及翻译(Protein)水平上对JA参与水稻对稻瘟病菌的抗性反应。

该项研究可以清晰地揭示出水稻-稻瘟病菌的具体互作机制，并对深入阐明 抗稻瘟病基因的抗病机制提供重要借鉴，为进一步科学有效的指导抗病育种提供重要指导

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。