一种反向高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化产物中氨基葡萄糖含量的方法

摘要

本发明涉及一种乳清蛋白糖基化产物中氨基葡萄糖含量的定量检测方法，属于检测分析技术领域；本方法采用盐酸将糖基化乳清蛋白中的氨基葡萄糖水解，并且进行柱前衍生，再利用反相高效液相色谱法测定蛋白水解物中氨基葡萄糖的含量，方法快速简便，灵敏度高，适合各种蛋白质氨基葡萄糖糖基化产物中氨基葡萄糖含量的测定。

说明书

技术领域

本发明属于检测分析技术，主要涉及一种乳清蛋白糖基化产物中氨基葡萄糖含量的定量检测方法。

背景技术

乳清蛋白是原料乳中除了在pH等电点处沉淀的酪蛋白之外，留下来的蛋白质统称为乳清蛋白，约占 乳蛋白质的18％～20％。对乳清蛋白进行糖基化改性，由于糖基赋予糖基化蛋白的重要功能性质，因此可 以改善很多功能性质，包括乳化性、持水性、吸油性和致敏性。但是糖基化蛋白中氨基葡萄糖的释放和定 量检测问题是开发糖基化修饰技术的关键。

分析氨基糖可以采用比色法，将氨基葡萄糖的伯氨基乙酰化后再与显色剂反应，之后进行比色分析， 此方法操作繁琐费时，而且灵敏度和精确度不好。高效液相色谱法是一种快速高效的分析方法，可以采用 反相柱氨基柱示差检测器检测，或者柱前衍生化后利用紫外或荧光检测器进行含量测定。测定氨基糖的衍 生试剂有很多，有些衍生试剂的样品前处理过比较繁琐，选择合适的衍生试剂和开发前处理方法是决定分 析方法关键。通过盐酸将糖基化乳清蛋白中的氨基葡萄糖水解，并且进行柱前衍生，再利用反相高效液相 色谱法测定蛋白水解物中氨基葡萄糖的含量，方法快速简便，灵敏度高，为糖基化蛋白中氨基糖的检测提 供支持。

发明内容

本发明的目的是，通过盐酸将糖基化乳清蛋白中的氨基葡萄糖水解，并且进行柱前衍生，再利用反相 高效液相色谱法测定蛋白水解物中氨基葡萄糖的含量，方法快速简便，灵敏度高，为糖基化蛋白中氨基糖 的检测提供支持。

本发明的方法如下：

一种利用反向高效液相色谱分析蛋白糖基化产物中氨基葡萄糖含量的方法，该方法包括以下步骤： (1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml，密封， 100℃下水解3-5h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml；(2)取原料乳清蛋白60mg， 水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml，密封，100℃下水解3-5h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯 水定容至25ml；(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.2-0.4 ml衍生试剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1mL3-巯基丙酸， 25℃暗处衍生12-18min；(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱 参数为4.6mm×250mm，所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓 冲液，B液的pH 3.4-3.8，洗脱过程中A液和B液的体积比为60：40-76：24，流速为1ml/min，柱温为 35℃，进样量为10μl，所述的高效液相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。

所述的水解条件为：100℃下水解4h。

所述的样液衍生条件为：分别取0.3ml由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml 硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试剂混匀，25℃暗处衍生15min。

所述的分析色谱条件为：色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm，所述的流动相包括A液 和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗脱过程中A液和B液的 体积比为32：68，进样量为10μl。

本发明方法的特点：操作方便简单，灵敏度高重现性好、确证能力强，可用于各种蛋白质-氨基葡萄糖 糖基化产物中氨基葡萄糖含量的测定。

附图说明

图1是本发明的技术流程图；

图2是标准氨基葡萄糖(20μg/mL)色谱图；

图3是样品色谱图；

图4是氨基葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图来对具体实施例来进一步描述。

一种利用反向高效液相色谱分析蛋白糖基化产物中氨基葡萄糖含量的方法，该方法包括以下步骤： (1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml，密封， 100℃下水解3-5h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml；(2)取原料乳清蛋白60mg， 水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml，密封，100℃下水解3-5h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯 水定容至25ml；(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.2-0.4 ml衍生试剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1mL3-巯基丙酸， 25℃暗处衍生12-18min；(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱 参数为4.6mm×250mm，所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓 冲液，B液的pH 3.4-3.8，洗脱过程中A液和B液的体积比为60：40-76：24，流速为1ml/min，柱温为 35℃，进样量为10μl，所述的高效液相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。

所述的水解条件为：100℃下水解4h。

所述的样液衍生条件为：分别取0.3ml由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml 硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试剂混匀，25℃暗处衍生15min。

所述的分析色谱条件为：色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm，所述的流动相包括A液 和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗脱过程中A液和B液的 体积比为32：68，进样量为10μl。

实施例1

(1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封， 100℃下水解4h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(2)取原料乳清蛋白60mg，水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封，100℃下水解4h，取水解 液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试 剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1ml 3-巯基丙酸，25℃暗 处衍生15min。

(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm， 所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗 脱过程中A液和B液的体积比为68：32，流速为1ml/min，柱温为35℃，进样量为10μl，所述的高效液 相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。

实施例2

(1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封， 100℃下水解3h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(2)取原料乳清蛋白60mg，水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封，100℃下水解3h，取水解 液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试 剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1mL3-巯基丙酸，25℃暗 处衍生12min。

(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm， 所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗 脱过程中A液和B液的体积比为60：40，流速为1ml/min，柱温为35℃，进样量为10μl，所述的高效液 相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。

实施例3

(1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封， 100℃下水解5h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(2)取原料乳清蛋白60mg，水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封，100℃下水解5h，取水解 液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试 剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1mL3-巯基丙酸，25℃暗 处衍生18min。

(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm， 所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗 脱过程中A液和B液的体积比为60：40，流速为1ml/min，柱温为35℃，进样量为10μl，所述的高效液 相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。

实施例4

(1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封， 100℃下水解4h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(2)取原料乳清蛋白60mg，水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封，100℃下水解4h，取水解 液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试 剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1mL3-巯基丙酸，25℃暗 处衍生18min。

(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm， 所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗 脱过程中A液和B液的体积比为76：24，流速为1ml/min，柱温为35℃，进样量为10μl，所述的高效液 相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。

实施例5

(1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封， 100℃下水解3h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(2)取原料乳清蛋白60mg，水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封，100℃下水解3h，取水解 液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试 剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1mL3-巯基丙酸，25℃暗 处衍生15min。

(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm， 所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗 脱过程中A液和B液的体积比为76：24，流速为1ml/min，柱温为35℃，进样量为10μl，所述的高效液 相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。

实施例6

(1)准确称取乳清蛋白氨基葡萄糖糖基化产物60mg，加到水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封， 100℃下水解3h，取水解液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(2)取原料乳清蛋白60mg，水解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml密封，100℃下水解3h，取水解 液1ml，调节pH至7.0，用超纯水定容至25ml。

(3)由步骤(1)和步骤(2)得到的样品和空白处理液，加入0.7ml硼酸缓冲溶液和0.3ml衍生试 剂混匀，衍生试剂为50mg邻苯二甲醛溶解于1ml甲醇，10ml硼酸缓冲液和0.1mL3-巯基丙酸，25℃暗 处衍生12min。

(4)将衍生后的样液进行反向高效液相色谱分析，色谱柱为Elite C18，色谱柱参数为4.6mm×250mm， 所述的流动相包括A液和B液，A液为甲醇，B液为0.025mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，B液的pH 3.6，洗 脱过程中A液和B液的体积比为76：24，流速为1ml/min，柱温为35℃，进样量为10μl，所述的高效液 相色谱检测器为荧光检测器，激发波长337nm发射波长454nm。