一种固定化κ-卡拉胶酶及其制备κ-卡拉胶寡糖的方法

摘要

本发明公开了一种固定化κ-卡拉胶酶及其制备κ-卡拉胶寡糖的方法，步骤如下：（a）利用Fe2+和Fe3+共沉淀法制备出四氧化三铁磁性纳米粒子，在碱性条件下加入油酸进行包埋，再加入高锰酸钾对油酸上的双键进行氧化，得到羧基功能化的四氧化三铁磁性纳米粒子；（b）以戊二醛作为交联剂与羧基功能化的四氧化三铁磁性纳米粒子进行交联，通过外加磁场对载体进行磁分离，载体清洗后加入κ-卡拉胶酶液进行固定化，固定结束清洗数次除去未结合的游离酶得到固定化κ-卡拉胶酶；（c）利用制备的固定化κ-卡拉胶酶对κ-卡拉胶进行水解，制备κ-卡拉胶寡糖。本发明工艺简单，酶活回收率高，固定化酶稳定性好，可重复利用，产物易分离，可适应于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种固定化κ-卡拉胶酶及其制备κ-卡拉胶寡糖的方法。

背景技术

卡拉胶，又称鹿角菜胶、角叉菜胶，爱尔兰苔菜胶，主要是从一些红藻类海藻的细胞壁中提取的天然海藻多糖，广泛应用于食品、化工、轻工、医药等领域。卡拉胶寡糖是由卡拉胶降解形成的，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、免疫调节等生理活性。

传统的制备卡拉胶寡糖的方法主要是物理降解法和化学降解法。然而采用物理降解法和化学降解法制备卡拉胶寡糖存在反应条件难以控制、污染环境、产物不均一、不易分离纯化等缺点。酶降解法制备卡拉胶寡糖具有高效、专一、反应易控制、产物易分离、环境污染少等优点。因此，采用酶法降解卡拉胶逐渐取代传统的物理降解法和化学降解法，成为制备卡拉胶寡糖的最佳方法。

酶虽然是一种高效、专一、作用条件的温和的生物催化剂，但是作为蛋白质，酶又具有对有机溶剂、重金属、变性剂、酸、碱、温度等的高度敏感性，遇到高浓度的盐类、高温、强酸、强碱时会变性从而失去催化功能。另外，纯的酶有利于终产物的分离纯化，但是纯酶生产成本较高，这些都限制了酶在工业上的应用。近年来，固定化技术的出现在一定程度上解决了上述问题，不仅提高了酶的活性、稳定性，还实现了酶的可重复利用性。

固定化酶的方法主要包括吸附法、交联法、结合法及包埋法。其中，吸附法和包埋法的工艺简便，条件温和，载体廉价易得，酶的生物活性破坏程度低，但是酶与载体的结合不牢固，容易脱落，并且包埋法对大分子底物及产物不适合。共价法和交联法中酶与载体结合牢固，使用过程中不易脱落，稳定性能好，可以使用高浓度的底物及离子强度的溶液，但是这两种方法操作复杂，反应条件剧烈，破坏了酶的高级结构。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种固定化κ-卡拉胶酶及其制备κ-卡拉胶寡糖的方法，本方案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化κ-卡拉胶酶的制备方法，通过戊二醛浓度、游离κ-卡拉胶酶浓度、交联时间、固定时间、固定温度对固定化κ-卡拉胶酶活力及酶活回收率的影响，确定最佳的固定化条件，进而提高单位载体固定的酶活力。并对制备的固定化κ-卡拉胶酶的最适反应条件、储存稳定性及重复利用性进行研究，为固定化κ-卡拉胶酶的应用奠定理论基础。

本发明的另一目的是利用制备的固定化κ-卡拉胶酶对κ-卡拉胶底物进行水解，制备κ-卡拉胶寡糖。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：

一种固定化κ-卡拉胶酶，其制备步骤如下：

步骤一、固定化载体的制备：

利用共沉淀法制备油酸包埋的磁性Fe₃O₄纳米粒子，即Fe³⁺与Fe²⁺在加入氨水的条件下反应，在反应过程中加入油酸对其进行包埋，制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，然后加入10 mg/mL的KMnO₄溶液对制备好的油酸包埋的磁性Fe₃O₄纳米粒子进行氧化，制得羧基功能化的磁性Fe₃O₄纳米粒子；

步骤二、固定化酶的制备：

将步骤一制备的羧基功能化的磁性Fe₃O₄纳米粒子20mg与5ml质量体积浓度为2-3%的戊二醛进行交联反应2-3h，反应结束用0.05 M pH 7.5的PBS缓冲清洗若干次，磁分离得到活化的羧基功能化的磁性Fe₃O₄纳米粒子，然后加入酶液进行固定化，加入的1 mL13.9- 69.5 U/mL的κ-卡拉胶酶液，固定化温度为4-25°C，固定化时间为2-3 h，固定结束后用0.05 M pH 7.5的PBS缓冲清洗若干次除去未结合的游离酶，得到固定化κ-卡拉胶酶。

作为实施例的优选方式，所述步骤二中，戊二醛的质量体积浓度为2.5%，交联时间为2h，加入1ml的13.9U/mL的κ-卡拉胶酶液进行固定化，固定化时间为2 h，固定化温度为25°C。

作为实施例的优选方式，所述步骤二中，戊二醛的质量体积浓度为3%，交联时间为3h，加入1ml的69.5U/mL的κ-卡拉胶酶液进行固定化，固定化时间为3 h，固定化温度为4°C。

作为实施例的优选方式，固定化κ-卡拉胶酶在4°C下储存20天，酶活性仍然维持在50%以上；固定化κ-卡拉胶酶重复利用4次后残余酶活力大于40%。

一种固定化κ-卡拉胶酶制备κ-卡拉胶寡糖的方法，包括以下步骤：

将固定化κ-卡拉胶酶与底物κ-卡拉胶溶液反应24 h后，磁分离反应液，将反应液离心后取上清进行乙醇分级沉淀去除未降解的多糖，溶液透析24 h，收集透析外液旋转蒸发后冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶寡糖混合物。

作为实施例的优选方式，固定化κ-卡拉胶酶与底物κ-卡拉胶的最适反应温度为55°C，最适反应pH为7.5。

作为实施例的优选方式，将0.1 g所述固定化κ-卡拉胶酶与0.5% κ-卡拉胶溶液50°C反应12 h后，再加入0.1 g所述固定化酶继续50°C反应12 h，反应结束后磁分离得反应液，将所述反应液9800×g离心15 min，取上清进行乙醇分级沉淀去除未降解的多糖，再将溶液在3500 Da的透析袋中以蒸馏水为透析外液进行透析24 h，收集透析外液旋转蒸发后冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶寡糖混合物。

作为实施例的优选方式，所述不同聚合度的κ-卡拉胶寡糖混合物为偶数寡糖。

本发明工艺简单，酶活回收率高，固定化酶稳定性好，可重复利用，产物易分离，可适应于工业化生产。

附图说明

图1-1羧基功能化的磁性纳米粒子、固定化κ-卡拉胶酶的磁性；其中，1为羧基功能化的磁性纳米粒子；2为固定化κ-卡拉胶酶；

图1-2固定化κ-卡拉胶酶的磁分离效果；其中，左侧图为磁分离前，右侧图为磁分离后；

图2不同戊二醛浓度对固定κ-卡拉胶酶活力的影响；

图3不同κ-卡拉胶酶量对固定κ-卡拉胶酶活力的影响；

图4不同交联时间对固定κ-卡拉胶酶活力的影响；

图5不同固定时间对固定κ-卡拉胶酶活力的影响；

图6不同温度对固定κ-卡拉胶酶活力的影响；

图7固定化κ-卡拉胶酶的最适反应温度；

图8固定化κ-卡拉胶酶的最适反应pH；

图9固定化κ-卡拉胶酶的储存稳定性；

图10固定化κ-卡拉胶酶的重复利用性。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例中采用的检测方法：

κ-卡拉胶酶活力的测定:取20 mg羧基功能化的纳米粒子载体制备的固定κ-卡拉胶酶，加入15 mL 溶于50 mmol /L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.5）的0.5%的κ-卡拉胶（高温溶解后保温于60°C水浴中），60°C温浴5 min，反应结束取0.4 mL反应液，加0.6 mL DNS，沸水浴10 min后立即冷却，补加蒸馏水到5 mL，测520 nm处的吸光值，然后依据以D-半乳糖为标准品的标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，以检测柚皮作为载体制备的固定κ-卡拉胶酶的活力。以沸水浴灭活10 min的酶液作为对照。以上述条件下1 min催化产生1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

实施例1：固定化κ-卡拉胶酶制备及κ-卡拉胶寡糖的制备

利用Fe²⁺和Fe³⁺共沉淀法制备出四氧化三铁磁性纳米粒子，在氨水存在条件下加入油酸进行包埋，再加入10 mg/mL氧化剂高锰酸钾对油酸上的双键进行氧化，得到羧基功能化的四氧化三铁磁性纳米粒子，冷冻干燥后常温储存。取羧基功能化的四氧化三铁磁性纳米粒子与戊二醛溶液进行交联，交联结束用0.05 M pH 7.5的PBS缓冲清洗数次，磁分离后加入κ-卡拉胶酶液进行固定化，固定化结束后用0.05 M pH 7.5的PBS缓冲液清洗数次除去未结合的游离酶，得到固定化κ-卡拉胶酶。戊二醛的质量体积浓度为3%，交联时间为3h，加入1ml的69.5U/mL的κ-卡拉胶酶液进行固定化，固定化时间为3 h，固定化温度为4°C。

一种固定化κ-卡拉胶酶制备κ-卡拉胶寡糖的方法，包括以下步骤：

将固定化κ-卡拉胶酶与底物κ-卡拉胶溶液反应24 h后，磁分离反应液，将反应液离心后取上清进行乙醇分级沉淀去除未降解的多糖，溶液透析24 h，收集透析外液旋转蒸发后冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶寡糖混合物。

作为实施例的优选方式，固定化κ-卡拉胶酶与底物κ-卡拉胶的最适反应温度为55°C，最适反应pH为7.5。

作为实施例的优选方式，将0.1 g所述固定化κ-卡拉胶酶与0.5% κ-卡拉胶溶液50°C反应12 h后，再加入0.1 g所述固定化酶继续50°C反应12 h，反应结束后磁分离得反应液，将所述反应液9800×g离心15 min，取上清进行乙醇分级沉淀去除未降解的多糖，再将溶液在3500 Da的透析袋中以蒸馏水为透析外液进行透析24 h，收集透析外液旋转蒸发后冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶寡糖混合物。

作为实施例的优选方式，所述不同聚合度的κ-卡拉胶寡糖混合物为偶数寡糖。

实施例2：磁性纳米粒子、固定化κ-卡拉胶酶磁特性表征和磁分离效果

取羧基功能化的磁性纳米粒子载体和固定κ-卡拉胶酶在室温下，用振动样品磁强计（Vibrating Sample Magnetometer，VSM）测定磁滞回线，表明制备的载体及固定化κ-卡拉胶酶均具有磁性，见图1-1；取20 mg固定化κ-卡拉胶酶于试管中，加入5 mL蒸馏水，震荡混匀后用外加磁场即永磁铁进行磁分离，可以看到分离效果良好，见图1-2。

实施例:3：不同戊二醛浓度对固定κ-卡拉胶酶活力的影响

取羧基功能化的磁性纳米粒子20 mg，分别加入5 mL浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5%（w/v）的戊二醛溶液，4°C下交联3 h，交联结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，加入1 mL 69.5 U/mL的κ-卡拉胶酶液，4°C下固定3 h，固定化结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，外加磁场进行磁分离得到固定化κ-卡拉胶酶。测得最大固定化酶活力及酶活回收率在戊二醛浓度为2.5%时得到，分别为278.6 U/g纳米粒子和8.0%，结果见图2。

实施例:4：不同游离κ-卡拉胶酶量对固定κ-卡拉胶酶活力的影响

取羧基功能化的磁性纳米粒子20 mg，加入5 mL 2.5%（w/v）的戊二醛溶液，4°C下交联3 h，交联结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，分别加入1 mL 酶活力分别为6.95、13.9、27.8、41.7、55.6、69.5 U/mL的κ-卡拉胶酶液，4°C下固定3 h，固定化结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，外加磁场进行磁分离得到固定化κ-卡拉胶酶。测得在游离κ-卡拉胶酶为13.9 U/mL（即游离κ-卡拉胶酶的加入量为13.9 U/20 mg磁性纳米粒子）时得到较好的固定化酶活力及酶活回收率，分别为285.5 U/g纳米粒子和41.1%，结果见图3。

实施例5：不同固定时间对固定κ-卡拉胶酶活力的影响

取羧基功能化的磁性纳米粒子20 mg，加入5 mL 2.5%（w/v）的戊二醛溶液，4°C下分别交联0.5、1、2、3、4、5 h，交联结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，加入1 mL 酶活力为13.9、U/mL的κ-卡拉胶酶液，4°C下固定3 h，固定化结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，外加磁场进行磁分离得到固定化κ-卡拉胶酶。测得最大固定化酶活力及酶活回收率在交联时间为2 h时得到，分别为311.2 U/g纳米粒子和44.8%，结果见图4。

实施例6：不同固定时间对固定κ-卡拉胶酶活力的影响

取羧基功能化的磁性纳米粒子20 mg，加入5 mL 2.5%（w/v）的戊二醛溶液，4°C下交联2 h，交联结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，加入1 mL 酶活力为13.9、U/mL的κ-卡拉胶酶液，4°C下分别固定0.5、1、2、3、4、5 h，固定化结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，外加磁场进行磁分离得到固定化κ-卡拉胶酶。测得最大固定化酶活力及酶活回收率在固定时间为2 h时得到，分别为359.5 U/g纳米粒子和51.8%，结果见图5。

实施例7：不同温度对羧基功能化的磁性纳米粒子固定κ-卡拉胶酶活力的影响

取羧基功能化的磁性纳米粒子20 mg，加入5 mL 2.5%（w/v）的戊二醛溶液，4°C下交联2 h，交联结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，加入1 mL 酶活力为13.9、U/mL的κ-卡拉胶酶液，分别在4°C和常温（25°C）下固定2 h，固定化结束用0.05 M pH 7.5 的缓冲液清洗数次，外加磁场进行磁分离得到固定化κ-卡拉胶酶。测得的固定化酶活力及酶活回收率在4°C和常温（25°C）下没有显著差异，从节约能源方面考虑，选择固定温度为常温（25°C），此时固定化酶活力及酶活回收率分别为326 U/g纳米粒子和46.9%，结果见图6。

实施例8：固定化κ-卡拉胶酶的最适反应温度

取20 mg羧基功能化的纳米粒子载体制备的固定κ-卡拉胶酶，加入15 mL 溶于0.05 M PBS缓冲液（pH 7.5）的0.5% κ-卡拉胶，分别在40、45、50、55、60、65、70°C条件下反应5 min，反应结束后迅速磁分离上清液，测酶活。以最高酶活力为100%，确定固定化κ-卡拉胶酶的最适反应温度，结果见图7。由图7可知，固定化κ-卡拉胶酶最适反应温度为55°C。

实施例9：固定化κ-卡拉胶酶的最适反应pH

取20 mg羧基功能化的纳米粒子载体制备的固定κ-卡拉胶酶，分别加入15 mL 溶于0.05 M 不同pH值的缓冲液的0.5% κ-卡拉胶，在55°C条件下反应5 min，反应结束后迅速磁分离上清液，测酶活。以最高酶活力为100%，确定固定κ-卡拉胶酶的最适反应pH，结果见图8。由图8可知，固定化κ-卡拉胶酶最适反应pH为7.5。

实施例10：固定化κ-卡拉胶酶的储存稳定性

将羧基功能化的纳米粒子载体制备的固定κ-卡拉胶酶，在4°C下储存30 d，不同时间取样测固定κ-卡拉胶酶残余酶活力，计算固定化κ-卡拉胶酶在4°C下的储存稳定性，结果见图9。由图9可知，在4°C下储存固定化κ-卡拉胶酶20天，酶活性仍然维持在50%以上。

实施例11：固定化κ-卡拉胶酶的重复利用性

取20 mg羧基功能化的纳米粒子载体制备的固定κ-卡拉胶酶，加入15 mL 溶于0.05 M PBS缓冲液（pH 7.5）的0.5% κ-卡拉胶（高温溶解后保温于60°C水浴中），60°C温浴5 min，反应结束后迅速磁分离上清液，测酶活。固定化κ-卡拉胶酶用0.05 M pH 7.5的PBS缓冲液清洗数次，洗去残留的反应液，再加入15 mL 溶于0.05 M PBS缓冲液（pH 7.5）的0.5% κ-卡拉胶，60°C温浴5 min，同样的步骤重复4次，重复4次后剩余酶活力为43.5%，结果见图10。

实施例12：利用固定化κ-卡拉胶酶制备κ-卡拉胶寡糖

取0.1 g固定化κ-卡拉胶酶与0.5% κ-卡拉胶溶液50°C反应12 h后再加入0.1 g固定化酶继续50°C反应12 h，反应结束后磁分离得反应液9800×g离心15 min，取上清进行乙醇分级沉淀去除为降解的多糖，再将溶液在3500 Da的透析袋中以蒸馏水为透析外液进行透析24 h，收集透析外液旋转蒸发后冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶寡糖混合物，此κ-卡拉胶寡糖是偶数寡糖。

本领域的普通技术人员从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。