一种肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集检测试剂盒及应用

摘要

本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集检测试剂盒及在肠出血性大肠杆菌O157:H7检测中的应用，试剂盒包括：a)乳胶检测试剂、b)样品处理液、c)阳性对照样品、d)阴性对照样品，所述的乳胶检测试剂是能与肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性反应的乳胶试剂，采用抗Intimin蛋白单克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯乳胶所得。本发明具有以下优点：1、操作简单、方便快捷、检测成本低，适合现场的快速检测；2、提高了抗体的偶联率和乳胶检测试剂的敏感性和稳定性，适合产品研发和大规模生产的要求；3、能直接对样品中肠出血性大肠杆菌O157:H7进行检测，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集检测试剂盒及在肠出血性大肠杆菌 O157:H7检测中的应用，属禽类免疫学技术领域。

背景技术

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的食源性病原菌，是当今世界上不断增多的食品 安全和突发性公共卫生事件的主要诱因之一。该菌能感染禽类和其它动物，人主要通过污染 的食物发病。1982年，O157:H7首先在美国发现，此后在世界各地散发或地方流行，已成为 全球性的公共卫生和食品安全问题。因此发展快速、敏感、特异的检测方法和试剂是确保饮 水和食品安全、预防大肠杆菌O157:H7感染发生的重要手段。目前，国内外已报道的检测方 法有多重PCR、基因芯片、噬菌体分型、脉冲场凝胶电泳分析、生物传感器等，这些方法在 检测方面各有所长，但大多对仪器设备要求较高，因此使用范围有很大的局限性。分离培养 鉴定仍是检测O157:H7的金标准，但其通常需要数天才能得到结果，不能满足快速诊断的要 求。在大肠杆菌O157:H7的免疫学检测方法中，所用抗体多为多克隆抗体，抗O157:H7的多 克隆抗体与抗其它肠道细菌的抗体存在着严重交叉反应，通常的纯化不能满足精确的血清学 检验需求，而用单克隆抗体为基础建立的抗原检测方法和试剂国内外少见报道。乳胶凝集试 验是以聚苯乙烯乳胶颗粒为载体，将抗原或抗体吸附到载体上，用以检测相应的抗体或抗原 的方法。该方法操作简便，方便快捷，价格低廉，不需要特殊仪器，肉眼可判断结果，适合 现场快速检测，在临床检测中应用广泛。常用的致敏乳胶的方式主要是物理吸附法和化学交 联法，物理吸附法稳定性和敏感性较低，难以适合产品开发的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7 乳胶凝集检测试剂盒，该试剂盒选择抗肠出血性大肠杆菌O157:H7Intimin蛋白单克隆抗体致 敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂，并以该乳胶检测试剂为核心组装了一种用于检测肠出血性大肠杆 菌O157:H7的试剂盒，该试剂盒可快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，对该病的流行病学 调查及防控有重要意义。

本发明为解决上述技术问题而采取的技术方案为：一种肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶 凝集检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)乳胶检测试剂、b)样品处理液、c)阳性对 照样品、d)阴性对照样品，所述的乳胶检测试剂是能与肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性反 应的乳胶试剂，采用抗Intimin蛋白单克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯乳胶所得。

按上述方案，所述的抗Intimin蛋白单克隆抗体的制备方法是：从已经建株的5株杂交瘤 细胞中筛选1株抗体效价高、特异性强的杂交瘤细胞扩大培养，同时在BALB/c小鼠体内诱 生小鼠腹水生产单克隆抗体；取8周龄的BALB/c小鼠20只，腹腔注射不完全佛氏佐剂0.5mL/ 只，7d后腹腔注射扩大培养的杂交瘤细胞5×10⁶～5×10⁷/只，饲养观察，待小鼠腹部凸起且 行动迟缓时逐只抽取小鼠腹水，2000r/min离心8min，弃去脂肪收集上层澄清腹水，用间接 ELISA方法测定收集的每只小鼠腹水效价，将效价不低于1:(1000×2¹¹)的腹水混合，混合 后的腹水经测定最终效价为1:(1000×2¹²)，亚型鉴定为lgG2b。

所述的抗Intimin蛋白单克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯乳胶的具体制备方法：(1)取摇匀的 羧化聚苯乙烯乳胶200ul放入EP管中；(2)用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm， 15min，离心弃上清；(3)再用pH4.5，0.01M的磷酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，15min， 离心，弃上清；(4)然后加入100mM的EDC 1000uL、20mM的NHS 1000uL重悬，混匀， 使两者的终浓度分别为50mol/L及10mol/L，于摇床中26℃缓慢震摇4.5h；(5)用pH8.0，0.01M 硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpin，20min，离心弃上清；(6)用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液 1000ul悬浮，悬浮乳胶浓度为2％，4℃保存备用；(7)逐滴缓慢加入1:4倍稀释的抗肠出血 性大肠杆菌O157:H7Intimin蛋白单克隆抗体1000ul，所述蛋白单克隆抗体的蛋白含量2.78 mg/mL，加样时间控制为1小时，于26℃摇床中缓慢震摇5h；(8)加入0.1M乙醇胺100ul， 于26℃摇床中缓慢震摇15min终止反应，12000rpm，20min，离心弃上清；(9)沉淀用pH8.0， 0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpin，20min，离心弃上清；(10)沉淀用pH8.0，0.01M硼 酸盐缓冲液2000ul悬浮，即为致敏好的乳胶检测试剂，4℃保存。

按上述方案，所述的样品处理液的组分及含量按重量/体积为：称取胰蛋白胨20.0g,3 号胆盐1.12g，乳糖5.0g，无水磷酸氢二钾4.0g，无水磷酸二氢钾1.5g,NaCl 5.0g，将上述 成分溶于1000ml ddH₂O，调pH值为6.9±1，121℃高压灭菌15min，取出过滤灭菌的新生霉 素溶液20mg/L加入，使最终浓度为20ug/L。

按上述方案，所述的阳性对照样品为灭活的肠出血性大肠杆菌O157:H7菌悬液，所述的 阴性对照样品为不含大肠杆菌O157:H7高压灭菌的TSB培养液。

本发明选用化学交联法，利用带有羧基基团(-COOH)的羧化聚苯乙烯乳胶为载体，以 双功能试剂水溶性碳化二亚胺(EDAC)为介质，通过化学反应将抗体分子偶联到乳胶表面， 其稳定性和敏感性有很大的提高。Intimin蛋白(即紧密素)是大肠杆菌O157:H7LEE毒力岛 上的eae基因编码的外膜蛋白，其介导细菌与上皮细胞的紧密黏附，是最重要的黏附因子， 紧密素的特异性抗体可阻断细菌的黏附而使其丧失致病力，具有较强的免疫原性和免疫保护 性。为此，选择抗肠出血性大肠杆菌O157:H7Intimin蛋白单克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯乳胶 作为本发明乳胶检测试剂，组装简便快速的试剂盒。

本发明的肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集检测试剂盒的应用，其特征在于包括以下 具体步骤：1)将收集到的待检样品于样品处理液中37℃培养4-6小时；2)于干净的玻片或 玻板上分别滴加10ul阳性对照样品、10ul阴性对照样品和10ul待检样品，然后再向阳性对照 样品、阴性对照样品、待检样品中滴加10ul所述的乳胶检测试剂，充分混匀，缓慢摇动，1 分钟后在蓝色背景下观察结果；3)结果判定：对照试验1分钟出现如下结果，试验方可成立： 阳性对照样品与乳胶检测试剂作用出现+++以上的乳胶凝集，阴性对照样品与乳胶检测试剂 作用不凝集；待检样品在1分钟内出现++以上的乳胶凝集判为阳性，呈现原有均匀乳状判定 为阴性。

本发明的检测试剂盒能直接对样本中的肠出血性大肠杆菌O157:H7进行检测，若样品中 含有肠出血性肠出血性大肠杆菌O157:H7，则乳胶检测试剂在1分钟内出现++以上的乳胶凝 集，即可判为阳性结果；若样品中不含有肠出血性大肠杆菌O157:H7，则乳胶检测试剂在1 分钟内液滴仍然呈现原有的均匀乳状，即可判为阴性结果。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明的检测试剂盒无需专门操作技能和任何特殊仪器设备，操作简单、方便快捷、 检测成本低，适合现场的快速检测；

2、本发明的检测试剂盒克服了乳胶致敏抗体时偶联率低、抗体容易脱落等缺点，提高了 抗体的偶联率和乳胶检测试剂的敏感性和稳定性，适合产品研发和大规模生产的要求；

3、本发明的检测试剂盒能直接对样品中肠出血性大肠杆菌O157:H7进行检测，具有特异 性强、灵敏度高、检测时间短的特点。

附图说明

图1为乳胶凝集结果判定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1抗肠出血性大肠杆菌O157:H7intimin蛋白单克隆抗体致敏乳胶试剂的制备

抗Intimin蛋白单克隆抗体的制备方法是：从已经建株的5株杂交瘤细胞中筛选1株抗体 效价高、特异性强的杂交瘤细胞扩大培养，同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克 隆抗体；取8周龄的BALB/c小鼠20只，腹腔注射不完全佛氏佐剂0.5mL/只，7d后腹腔注 射扩大培养的杂交瘤细胞5×10⁶～5×10⁷/只，饲养观察，待小鼠腹部凸起且行动迟缓时逐只 抽取小鼠腹水，2000r/min离心8min，弃去脂肪收集上层澄清腹水，用间接ELISA方法测定 收集的每只小鼠腹水效价，将效价不低于1:(1000×2¹¹)的腹水混合，混合后的腹水经测定 最终效价为1:(1000×2¹²)，亚型鉴定为lgG2b；

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7intimin蛋白单克隆抗体单克隆抗体致敏乳胶试剂的制备： ①取摇匀的羧化聚苯乙烯乳胶200ul放入4mlEP管中；②用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液洗3 遍，12000rpm，15min，离心弃上清；③再用pH4.5，0.01M的磷酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm， 15min，离心，弃上清；④然后加入100mM的EDC重悬，20mM的NHS1000uL重悬，混匀， EDC与NHS使两者的终浓度分别达到50mol/L及10mol/L，于摇床中26℃缓慢震摇4.5h；⑤ 偶联结束后的致敏用乳胶用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpin，20min，离心弃 上清；⑥用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液悬浮，悬浮乳胶浓度为2％，4℃保存备用；⑦逐滴 缓慢加入1:4倍稀释的抗肠出血性大肠杆菌O157:H7intimin蛋白单克隆抗体1000ul，所述蛋 白单克隆抗体的蛋白含量2.78mg/mL，加样时间控制为1小时，于26℃摇床中缓慢震摇5h； ⑧加入终止剂0.1M乙醇胺于26℃摇床中缓慢震摇15min终止反应(按浓度为1％的1mL抗 体乳胶中加入50uL乙醇胺溶液)，12000rpm，20min；⑨用⑤同样的方法处理致敏羧化乳胶， 重悬，4℃保存备用。

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7intimin蛋白单克隆抗体致敏乳胶试剂的具体制备方法条件 摸索如下：

1、2％羧化乳胶的制备：①取200uL摇匀的羧化乳胶放入4mlEP管中；②用pH9.6，0.1M碳 酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，15min，离心弃上清；③再用pH4.5，0.01M的磷酸盐缓冲 液洗3遍，12000rpm，15min，离心，弃上清；④然后加入100mM的EDC1000uL重悬，20mM 的NHS1000uL混匀，EDC与NHS使两者的终浓度分别达到50mol/L及10mol/L，于摇床中 26℃缓慢震摇4.5h；⑤偶联结束后的致敏用乳胶用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍， 12000rpin，20min，离心弃上清；⑥用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液1000ul悬浮，悬浮乳胶浓 度为2％，4℃保存备用。

2、致敏时最佳单抗加入量的选择：取100uL上述制备好的2％羧化乳胶，加入100uLBBS稀释 的不同稀释度的单克隆抗体(倍比稀释1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)，26℃摇床中缓慢震摇5h， 加入10uL0.1M乙醇胺终止剂于26℃摇床中15min终止反应，12000rpm，20min，取上清测 定，沉淀用pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍，然后用200ul pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液 重悬。用制备好的致敏乳胶对不同稀释度的阳性对照样品进行检测，同时进行自凝现象的检 测。回收的上清经UV-120紫外分光光度计测定蛋白含量。致敏前加入蛋白量为X1mg/mL，致 敏完毕后，上清蛋白含量为X2mg/mL，计算偶联的蛋白量X＝Xl-X2(试验结果如表1、表2)。 试验结果表明：单抗稀释1：4倍时，偶联率最高，敏感性最高，且致敏后的乳胶不自凝。

表格1 加入蛋白量与偶联蛋白量的关系

表格2 加入蛋白量与敏感性关系

3、最佳致敏时间的选择：取400ul上述制备好的2％羧化乳胶液，加入400ul 1:4倍稀释的 单抗，分别致敏1h、2h、3h、4h、5h、6h和7h，每隔1小时取100ul于1.5mlEP管中，加 入5uL0.1M乙醇胺终止剂终止反应，测定致敏前后蛋白量，计算偶联蛋白量和偶联率(试验 结果如表3、表4)。由表可知，偶联时间为5h时，偶联率最高，敏感性最高，且致敏后的乳 胶不自凝。

表格3 偶联时间与偶联率的关系

表格4 偶联时间与敏感性的关系

4、不同致敏方式对偶联率的影响

采用最佳致敏温度、最佳致敏时间、最佳致敏抗体量，研究不同的致敏方式对偶联率的 影响，选择偶联效率最高的为最佳致敏方式(试验结果如表5)。结果表明采用“摇床缓慢振 摇、单抗逐滴缓慢加入、控制整个加样时间为1小时”这种方式偶联率最高。

表格5 不同致敏方式对偶联率的影响

5、自凝性检验:用等量的PBS、灭菌生理盐水、灭菌蒸馏水等代替待检样品进行检测，观察 致敏乳胶的自凝性(试验结果如表6)。结果见下表格：

表6 自凝性试验

注明：++++为100％的乳胶凝集，乳胶形成大的颗粒聚集在液滴边缘，液体呈现完全透明 的状态(如图1A)；+++为75％的乳胶凝集，有明显的颗粒形成，液体稍浑浊(如图1B)； ++为50％的乳胶凝集，有明显但较细的颗粒形成，液体比较浑浊(如图1C)；+有些许的凝 集，液体呈浑浊状态(如图1D)；-不凝集，液滴呈现原有的均匀乳状(如图1E)。结果以出 现++以上的乳胶凝集为阳性。

实施例2肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集检测试剂盒的使用方法

1、样品的处理：将收集到的待检样品置于样品处理液中37℃培养4-6小时。

2、被检样品的检测：1)于干净的玻片或玻板上分别滴加10ul阳性对照样品、10ul阴性对照 样品和10ul待检样品。然后再向阳性对照样品、阴性对照样品、待检样品中滴加10ul所述的 乳胶检测试剂，搅拌均匀，摇动1分钟后在蓝色背景下观察结果。2)结果判定：对照试验1 分钟内出现如下结果，试验方可成立：阳性对照样品与乳胶检测试剂作用出现+++以上的乳 胶凝集，阴性对照样品与乳胶检测试剂不凝集；待检样品在1分钟内出现++以上的乳胶凝集 判为阳性，呈现原有均匀乳状判定为阴性。

试剂盒能直接对样品中的肠出血性大肠杆菌O157:H7进行检测，若样品中含有肠出血性 大肠杆菌O157:H7，则乳胶检测试剂在1分钟内出现++以上的乳胶凝集，即可判为阳性结果； 若样品中不含有肠出血性大肠杆菌O157:H7，则乳胶检测试剂在1分钟内液滴仍然呈现原有 的均匀乳状，即可判为阴性结果。

实施例3肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集检测试剂盒的初步应用

1、敏感性试验：挑取山梨醇麦康凯平皿上37℃培养18-24h后的肠出血性大肠杆菌单菌落， 于5mLTSB液体培养基中培养18-24h，用平板计数法对细菌进行计数，并将菌液进行不同梯 度稀释，用分光光度计检测细菌菌液OD₆₀₀值，然后用致敏好的乳胶试剂进行检测(试验结果 如表7)。试验结果：菌液稀释到1:256倍(菌量2.3×10⁷CFU/ml)时，仍然可以出现明显可 见的凝集反应，试验结果表明敏感性较好。

表格7 敏感性试验

2、特异性试验：将致敏好的乳胶试剂分别与沙门氏菌、大肠杆菌其他血清型、禽巴氏杆菌、 新城疫等病原进行乳胶凝集检测，对其特异性进行研究(试验结果如表8)。试验结果：致敏 乳胶试剂与大肠杆菌O157:H7反应为阳性，与禽巴氏杆菌、沙门氏菌等病原反应均为阴性， 试验结果表明特异性较好。

表格8 特异性试验

抗原 凝集状态 抗原 凝集状态 禽巴氏杆菌 - 大肠杆菌O78 - 沙门氏菌 - 大肠杆菌O1 - 阳性对照 ++++ 阴性对照 - 大肠杆菌O157:H7 ++++ 新城疫 -

3、重复性试验

3.1、批内重复性试验：制备3批肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集抗原检测试剂盒(试剂 盒批号分别为1401、1402、1403)，每批次10个，在每批次试剂盒中随机抽取3个试剂盒对 阳性对照样品、阴性对照样品、肠出血性大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌、禽巴氏杆菌进行检 测，观察其敏感性、特异性和稳定性，并检测乳胶是否自凝(试验结果如表9)。结果表明其 敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明批内重复性良好。

表格9 批内重复性试验

3.2、批间重复性试验：选取在不同时间制备的3批肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集抗原 检测试剂盒(试剂盒批号分别为1401、1402、1403)，对同一份阳性对照样品、阴性对照样 品、肠出血性大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌、禽巴氏杆菌进行检测，观察其敏感性、特异性 和稳定性，并检测乳胶是否自凝(试验结果如表10)。结果表明其敏感性、特异性和稳定性 没有变化，说明批间重复性良好。

表格10 批间重复性试验

4、符合率试验：对人工模拟的污染样品进行检测。挑选50份灭菌的ddH₂O，从中随机选择 30份人工添加肠出血性大肠杆菌O157:H7，分别采用本发明组装的乳胶凝集抗原检测试剂盒 和PCR方法对上述的50份样品进行检测(试验结果如表11)。结果显示本发明组装的乳胶凝 集抗原检测试剂盒检出阳性样品29份，阳性检出率为96.67％；检出阴性样品21份，阴性检 出率为100％；与PCR检测结果比较，总符合率为98.00％。

表格11 符合率试验结果

实施例4肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集检测试剂盒的组装

1、肠出血性大肠杆菌O157:H7乳胶凝集抗原检测试剂盒，包括

2、相关溶液的配制

1)样品处理液的配制：称取胰蛋白胨20.0g,3号胆盐1.12g，乳糖5.0g，无水磷酸氢二钾 4.0g，无水磷酸二氢钾1.5g,NaCl 5.0g，ddH₂O1000ml,将上述成分溶于水后调pH值为6.9± 1,121℃高压灭菌15min，取出滤过灭菌的新生霉素溶液20mg/L加入，使最终浓度为20ug/L， 混匀后分装，4℃保存备用。

2)阳性对照样品的配制：将肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株于高压灭菌的TSB中37℃培养 18-24小时，加入甲醛溶液使其终浓度为0.2％，于摇床中37℃缓慢振摇72h，分装到1.5mlEP 管中，-20℃保存备用。

3)阴性对照样品的配制：不含肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的高压灭菌的TSB培养液，分 装到1.5mlEP管中，-20℃保存备用。