一种基于顺序超声强化酶解制备谷朊蛋白降血压肽的方法

摘要

本发明一种基于顺序超声强化酶解制备谷朊蛋白降血压肽的方法，其涉及农副产品深加工技术领域。将谷朊蛋白悬浮液，施加超声处理，其中顺序三频超声频率为：20 KHz、28 KHz、35 KHz；超声功率为16.67W/L，预处理时间20-50 min。预处理后加蛋白酶酶解，酶解过程中保持pH9.0，温度50℃。酶解时间30min，100℃下灭酶10 min，12000 r/min下离心10min，收集上清液即可。本发明采用三频顺序超声波预处理谷朊蛋白悬浮液，提高了酶解效率，与其他类别的超声波预处理方式相比，酶解液的ACE抑制率提高13％～20％。能耗降低了3~53.75倍。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，特指采用顺序三频超声波预处理谷朊蛋白原料，再利用酶解方法制备谷朊蛋白降血压肽的一种技术。

技术背景：

小麦谷朊蛋白是小麦淀粉加工的副产物，其蛋白质含量高达75-80%，氨基酸组成均衡齐全，是营养丰富、物美价廉的植物性高蛋白聚合物。我国的小麦谷朊蛋白年产量大约60多万吨，目前主要作为面粉品质改良剂、饲料粘结剂、营养添加剂等用于食品和饲料工业。最新研究发现，谷朊蛋白作为一种非常有潜力的制备生物活性肽的植物蛋白源，其酶解产物可通过显著地抑制血管紧张素转换酶（ACE）的活性，而达到降低血压的目的。然而，由于谷朊蛋白疏水性氨基酸含量（主要含Pro、Gln、Leu、Ala含量较高）溶解性较差，分散性差，造成谷朊蛋白不能与酶充分的结合，酶解效率较低。蛋白质的功能性质主要由其结构决定，改性是改善或加强某些食物蛋白功能性质的有效方法。超声预处理蛋白底物可通过改变蛋白质的二级结构、蛋白分子颗粒大小，以及分子之间结合的紧密程度而改善谷朊蛋白原料的酶解特性，提高产品活性。然而，超声处理时间和工作模式直接影响到蛋白结构的变化程度，这种变化与其酶解特性的改善和生物活性的提高密切相关。

研究发现，双频或者多频超声组合福射对声化学反应产额的提高具有明显的增强效应，双频或者多频超声同时辐射的合效应均明显大于各频率超声单独辐射效应之和。例如，28 kHz与1.7 MHz组合的双频超声组合的双频超声组合辐射,当取1.7 MHz超声强度大于3 W/cm²时，其合效应约为单独效应之和的1.5倍；当1.7 MHz改为1.06 MHz或0.87 MHz时，其合效应可接近单独效应之和的2倍。在双频正交辐射的甚础上加入一束低频率的超声构成三频正交辐照，可使其声化学产额得到更大的提高,三者合作用结果大约为三者分别辐照产额之和的1.4 - 1.8倍。《现代食品科技》（2014，30（3）：23-26）发表的“不同频率超声对鲢鱼肌原纤维蛋白结构的影响”一文，以鲢鱼为原料，采用单频、双频和三频超声分别处理鲢鱼肌原纤维蛋白，研究不同频率超声处理对肌原纤维蛋白表面疏水性和表面巯基含量的影响。发现与未超声的样品对比，经三频超声处理10 min、单频超声处理15 min后蛋白的表面疏水性分别提高了65.34%，56.88%，蛋白表面巯基含量分别提高了13.32%，11.19%。双频超声对蛋白表面疏水性和表面巯基的影响作用介于单频和三频超声处理的之间。这说明三频超声在蛋白质改性方面也就用明显的优势。

现有文献对多频超声的研究大多是以同步多频的工作模式下，利用多频超声波峰峰叠加的效应，提高超声波的处理效果。这种效果是在多个频率的超声波发生器同时工作同时发出超声波的情况下发生的，构成的合成波谱非常复杂，会随着处理时间的延长，产生不同程度的峰峰相加和峰峰相消。

发明内容：

本发明的目的是本专利采用较低功率的顺序三频超声设备对谷朊蛋白进行预处理，旨在提高谷朊蛋白的酶解产物的降血压活性，缩短酶解时间，并且降低能耗。开发一种具有良好疗效的，安全的，价格合理的食物蛋白源的降血压活性肽。本发明上述目的是通过以下技术手段实现的：

先对蛋白溶液进行超声预处理，再进行酶解反应。具体技术方案是一种基于顺序超声强化酶解制备谷朊蛋白降血压肽的方法，按照下述步骤进行：（1）将谷朊粉配制成质量浓度为3％(W/W)的悬浮液，施加超声处理，其中顺序三频超声频率为：20 KHz、28 KHz、35 KHz；三频超声时间分别为20s、20s、20s；超声功率为16.67 W/L，预处理时间10-60 min。（2）加蛋白酶酶解：加3800 U/g碱性蛋白酶进行酶解，酶解过程中保持PH 9.0，温度50 ℃。酶解时间30 min，100℃下灭酶10 min，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，即可得到蛋白降血压肽的提取液。

本发明所具有的优点是：

本发明采用超声预处理原料蛋白对超声作用后酶解产物的ACE抑制活性进行了研究。经过三频超声预处理后，改善了酶解效果，提高了酶解产物的活性，并且与原有的超声处理方式相比降低了能耗。酶解液的ACE抑制率活性提高13％～20％。能耗降低了3~53.75倍。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明：

图1为本发明使用的顺序三频超声预处理谷朊蛋白的设备图。

具体实施方式

图1为本发明使用的顺序三频超声预处理谷朊蛋白的设备图，为江苏大学自主研制。超声发生器9、10、11能发出20、28、35 kHz的超声波，单台超声波发生器功率为100 w。超声池4中内壁竖直放置超声波振板，通过超声波发生器9、10、11分别控制超声波振板1、2、3；电脑控制器8设定超声波各参数后，控制超声波发生器9、10、11，发出符合要求的超声波；5为本发明中设备的恒温水浴池，通过温度计6实时监控温度，并根据工作需要调节介质温度；将需要处理的液原料通过蠕动泵7泵入超声池4中进行超声波处理。

人体中过多的血管紧张素转化酶 (ACE) 是引起血压升高的重要原因之一。因此本发明以酶解产物对ACE的抑制率评价其降血压活性。酶解产物ACE抑制活性的测定按照文献“J. Jia, H. Ma, W. Zhao, The use of ultrasound for enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from wheat germ protein, Food Chemistry. 119 (2010) 336-342.”的方法进行，以马尿酰组氨酰亮氨酸 (Hippuryl-His-Leu,HHL) 作为ACE催化的底物，研究其吸光度的变化，利用高效液相色谱法测定。

对照例：

（1） 配制2％（W/W） 的谷朊蛋白悬浮液500 mL，放入带转子的30摄氏度恒温水浴锅中搅拌30min，加入3800 U/g (E/S) 碱性蛋白酶进行酶解，酶解过程中保持pH 9.0，温度50℃，酶解30 min，之后沸水浴灭酶10min，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，稀释2倍后测定ACE抑制活性。经过测定，谷朊蛋白酶解产物稀释液的ACE抑制率为64.957%。

（2） 配制3％（W/W）的谷朊蛋白悬浮液500 mL，放入带转子的20摄氏度恒温水浴锅中搅拌30min，加入3800 U/g (E/S)碱性蛋白酶进行酶解，酶解过程中保持pH 9.0，温度50℃，酶解30 min，之后沸水浴灭酶10min，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，稀释3倍后测定ACE抑制活性。经过测定，谷朊蛋白酶解产物稀释液的ACE抑制率为66.012%。

（3）配制3％ (W/W) 的谷朊蛋白悬浮液500 mL，放入带转子的20℃恒温水浴锅中搅拌50min，加入3800 U/g (E/S) 碱性蛋白酶进行酶解，酶解过程中保持pH 9.0，温度50℃，酶解30 min，之后沸水浴灭酶10min，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，稀释3倍后测定ACE抑制活性。经过测定，谷朊蛋白酶解产物稀释液的ACE抑制率为64.761%。

（4）配制2％ (W/W) 的谷朊蛋白悬浮液500 mL，采用单频探头式超声波处理谷朊蛋白悬浮液，超声初始温度30 ℃，功率896 W/L，脉冲时间4 s，间歇时间3 s，超声总时间30 min.超声结束后加入3800 U/g (E/S) 碱性蛋白酶进行酶解，酶解过程中保持pH 9.0，温度50℃，酶解时间30 min，之后沸水浴灭酶10 min，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，稀释2倍后测定ACE抑制活性。经过测定，谷朊蛋白酶解产物稀释液的ACE抑制率为70.770%。

（5）配制2％ (W/W) 的谷朊蛋白悬浮液6 L，在机械搅拌的条件下，采用频率为20 kHz、28kHz、35kHz，同步超声时间为10 s、间歇时间为5 s；超声功率为50 W/L，初始温度为30℃的发散式同步三频超声波处理30 min；以3800 U/g的比例加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解的温度为50℃，pH为9.0，酶解30min；酶解结束后，将酶解液煮沸10 min灭酶，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，即可得到蛋白降血压肽的提取液。谷朊蛋白降血压肽提取液稀释2倍后测定ACE抑制活性。经过测定，谷朊蛋白酶解产物稀释液的ACE抑制率为70.07%。

实施例1. 配制2%的谷朊蛋白悬浮液6 L，在机械搅拌的条件下，采用频率为20 kHz、28 kHz、35 kHz，三频超声时间为20s、20s、20s；超声功率为16.67 W/L，初始温度为30度的发散式超声波处理30 min；以3800 U/g的比例加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解的温度为50℃，pH为9.0，酶解30min；酶解结束后，将酶解液煮沸10 min灭酶，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，即可得到蛋白降血压肽的提取液。谷朊蛋白降血压肽提取液稀释2倍后测定ACE抑制活性。

经过测定，有超声处理过程的酶解产物稀释液的ACE抑制率为73.80%，与对照（1）相比，降血压活性提高13.62％。与对照例（4）相比降血压活性提高4.29%，功率密度缩小53.75倍。与对照例（5）相比降血压活性提高5.32%，功率密度缩小3倍。

实施例2. 配制3%的谷朊蛋白悬浮液6 L，在机械搅拌的条件下，采用频率为20kHz、28kHz、35kHz，三频超声时间为20s、20s、20s；超声功率为16.67 W/L，初始温度为20度的发散式超声波处理30 min；以3800 U/g的比例加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解的温度为50℃，pH为9.0，酶解30 min；酶解结束后，将酶解液煮沸10 min灭酶，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，即可得到蛋白降血压肽的提取液。谷朊蛋白降血压肽提取液稀释3倍后测定ACE抑制活性。

经过测定，有超声处理过程的酶解产物稀释液的ACE抑制率为77.73%，与对照例（2）相比降血压活性提高了17.75％。

实施例3. 配制3%的谷朊蛋白悬浮液6 L，在机械搅拌的条件下，采用频率为20 kHz、28 kHz、35 kHz，单频超声时间为20s、20s、20s；超声功率为16.67 W/L，初始温度为20℃的发散式超声波处理50 min；以3800 U/g的比例加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解的温度为50℃，pH为9.0，酶解30 min；酶解结束后，将酶解液煮沸10 min灭酶，12000 r/min下离心10 min，收集上清液，即可得到蛋白降血压肽的提取液。谷朊蛋白降血压肽提取液稀释3倍后测定ACE抑制活性。

经过测定，有超声处理过程的酶解产物稀释液的ACE抑制率为76.76%，与对照例（3）相比降血压活性提高了18.53％。