一种银杏内酯B制备方法及其制备得到的银杏内酯B

摘要

本发明提供一种银杏内酯B的制备方法及其制备得到的银杏内酯B。本发明摒弃了有毒的有机溶剂，代之以乙醇和水并配合分离柱、水处理以及中低浓度乙醇重结晶技术用于银杏内酯B的分离纯化，得到高纯度的银杏内酯B，杂质含量少且未检出白果内酯和致敏性成分银杏酸。

说明书

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种银杏内酯B的制备方法及其 制备得到的银杏内酯B。

背景技术

银杏内酯属于萜类化合物，是银杏叶中一类重要的活性成分，均具有拮抗血 小板活化因子(PAF)受体、甘氨酸(Gly)受体、γ-氨基丁酸(GABA)受体 的作用，其中拮抗PAF受体作用表现为能高度选择性地拮抗由PAF诱导的血小 板聚集，从而防止血栓的形成，拮抗Gly受体、GABA受体作用表现为对中枢神 经系统的保护作用；拮抗PAF受体活性研究表明，银杏内酯B(GB)的活性最 强，其次为银杏内酯A(GA)，再次为银杏内酯C，最后为银杏内酯M(仅存 在于银杏根皮中，叶中不含)。

银杏内酯B在银杏叶中的含量较低，约为0.2％，在银杏叶提取物中含量在 1％～2％，且银杏各内酯成分结构相似、性质差异小，因而从银杏叶、银杏叶提 取物中分离银杏内酯B具有很大的困难。现有的银杏内酯B的分离纯化报道较 多，但绝大部分都用到乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂，对工业化生产带来诸 多不便和安全隐患。

银杏内酯B分离纯化方法已经报道很多，如专利200510063407.X、 200310104958、200710050245.5、200810046162.3中所提到的方法，分离纯化过 程中均用到有机溶剂，如正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷，且所得银杏内酯B 的收率普遍很低，溶剂消耗量较大，不具备工业应用价值；再如专利 200910184916.6中所提到的方法，以纯度>95％的银杏总内酯为原料，采用重结 晶-超临界CO₂萃取组合工艺进行纯化，得到纯度>99.5％的单体GA、GB，该方 法对起始原料要求较高，且采用超临界CO₂萃取对设备要求较高；又如专利 00117758.3采用制备型高效液相色谱分离制备GA、GB，且液相流动相为乙酸乙 酯和石油醚的混合液，不适宜工业化大生产。

为了解决现有问题，本发明摒弃了有毒的有机溶剂，代之以乙醇和水并配合 分离柱、水处理以及中低浓度乙醇重结晶技术用于银杏内酯B的分离纯化，得 到高纯度的银杏内酯B，杂质含量少且未检出白果内酯和致敏性成分银杏酸。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种银杏内酯B的制备方法及 其制备得到的银杏内酯B。本发明所述的银杏内酯B制备方法，摒弃了有毒的有 机溶剂，仅应用乙醇和水，并配合分离柱和重结晶技术即可得到高纯度的银杏内 酯B，含量≥98％，并且白果内酯和银杏酸均未检出。

所述制备方法包括如下步骤：

(1)以银杏叶为原料，中高浓度乙醇热回流提取，合并提取液，回收乙醇，浓 缩，过分离柱，纯水、乙醇分别洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶 提取物；

(2)高浓度乙醇溶解银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱，高浓度乙醇洗脱，收集 洗脱液，浓缩，得总银杏内酯粗品；

(3)向总银杏内酯粗品加入纯水，30～90℃下溶解搅拌，过滤，收集滤饼，浓缩， 干燥，得干品；

(4)向干品加中低浓度乙醇，重结晶，得银杏内酯B。

优选的，

所述步骤(1)中，以银杏叶为原料，粉碎，8-12倍(乙醇体积(ml)与银 杏叶重量(g)比值，V/W)50％～90％乙醇热回流提取1-2次，每次1-2小时；

更优选的，10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)60％-80％ 的乙醇热回流提取，提取2次，每次2小时。

优选的，所述步骤(1)中，乙醇热回流提取，合并提取液，回收乙醇，浓 缩体积至3-5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)；

更优选的，浓缩体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)。

优选的，所述步骤(1)中，分离柱为HPD450、DM130或HPD700大孔树 脂柱，洗脱液乙醇的体积百分浓度为60％～80％；

更优选的，分离柱为HPD450大孔树脂柱，乙醇洗脱浓度为70％。

所述步骤(1)的优选技术方案为：

以银杏叶为原料，粉碎，8-12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)50％～90％乙醇热回流提取1～2次，每次1-2小时，合并提取液，浓缩至乙 醇尽，且浓缩体积至3-5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)， 置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇 浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液 加入HPD450或DM130或HPD700大孔树脂柱，先用纯水洗脱，弃去洗脱液， 再用60-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。

所述步骤(1)更优选的技术方案为：

以银杏叶为原料，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)60％-80％乙醇加热回流，提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压 浓缩至乙醇尽，且浓缩体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇 至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇 尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，弃去洗脱液，再用70％乙醇 洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。

还优选的，所述步骤(2)中，银杏叶提取物，用95％乙醇溶解1～2次，合 并溶解液，加至重量是银杏叶提取物10～30倍的酸性氧化铝(100-300目)层析 柱，用2-4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙 醇洗脱，收集洗脱液；

更优选的，酸性氧化铝的重量是银杏叶提取物重量的20倍，用3倍(乙醇 体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇洗脱。

还优选的，所述步骤(3)中，总银杏内酯粗品中加入40-80倍(纯水体积 (ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，40-90℃搅拌溶解0.5-1 小时，趁热过滤，收集滤饼，浓缩至干，得干品；

更优选的，加入50-70倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比 值，V/W)纯水，于50℃-80℃搅拌溶解0.5小时。

还优选的，所述步骤(4)中，向步骤(3)所述得到的干品中加20-50倍(乙 醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)5％-50％乙醇；

更优选的，加入40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)15％-30％ 乙醇。

所述步骤(4)的优选技术方案为：

向步骤(3)得到的干品中，加入20-50倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g) 比值，V/W)5％-50％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继 续于0-10℃冷藏12-24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次， 收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B；

所述步骤(4)更优选的技术方案为：

向步骤(3)得到的干品中，加入40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g) 比值，V/W)15％-30％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继 续于0-10℃冷藏12小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次， 收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B；

本发明的有益技术效果：(1)制备过程未使用有毒的有机试剂，在能够制 备出高纯度银杏内酯B的同时提高了制备提取过程的安全，不仅对环境友好， 同时能够有效的提高对实验、生产人员的健康保障；(2)使用纯水加热分离银 杏内酯B，有别于分离柱的纯水洗脱，可以有效分离银杏内酯B；(3)使用中 低浓度乙醇进行重结晶纯化银杏内酯B，避免甲醇等毒性有机试剂的使用；(4) 制备得到的银杏内酯B纯度能够达到98％以上，同时未检测到白果内酯与致敏 物质银杏酸。

附图说明：

图1：实施例1银杏内酯B液相色谱图，峰1为溶剂峰，峰2为银杏内酯B；

图2：实施例2银杏内酯B液相色谱图，峰1为溶剂峰，峰2为银杏内酯B；

图3：实施例3银杏内酯B液相色谱图，峰1为溶剂峰，峰2为银杏内酯B。

图4：空白溶剂液相色谱图，峰1为溶剂峰。

具体实施方式：

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施 例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1：

银杏叶150kg，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至 乙醇尽，且浓缩液体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)， 置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓 度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入 HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点， 弃去洗脱液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物 53.79kg。

取银杏叶提取物10.0kg，先用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量 (g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，再用5倍(乙醇体积(ml) 与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶 解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的20倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝 (100-300目)层析柱，用3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比 值，V/W)95％乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃ 减压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；

总银杏内酯粗品中加入60倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g) 比值，V/W)纯水，于60℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃ 减压浓缩至干，得干品；

干品先用40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)15％乙醇加 热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12小时析晶，过 滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程2次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得 银杏内酯B 14.76g，转移率为16.56％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为99.2％， 白果内酯和银杏酸均未检出。

实施例2：

银杏叶150kg，粉碎，用8倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)90％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至 乙醇尽，且浓缩液体积至3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)， 置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓 度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入 DM130大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点， 弃去洗脱液，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物 57.34kg。

取银杏叶提取物10.0kg，先用8倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g) 比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5h，再用4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶 提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，合并溶解液；溶 解液加入用95％乙醇已处理过的30倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝(100-300 目)层析柱，用2倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W) 95％乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减压浓缩至 干，得总银杏内酯粗品；

总银杏内酯粗品中加入80倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g) 比值，V/W)纯水，于30℃搅拌溶解1小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减 压浓缩至干，得干品；

干品先用50倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)50％乙醇加 热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过 滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程2次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得 银杏内酯B 17.56g，转移率为21.17％，经HPLC检测，银杏内酯B含量98.3％， 白果内酯和银杏酸均未检出。

实施例3：

银杏叶150kg，粉碎，用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)50％乙醇加热回流提取1次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至 乙醇尽，且浓缩液体积至5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)， 置于0℃-5℃冷藏12小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓 度达75％，置于0℃-5℃冷藏12小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入 HPD700大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点， 弃去洗脱液，再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物 60.56kg。

取银杏叶提取物10.0kg，先用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量 (g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，再用6倍(乙醇体积(ml) 与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶 解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的10倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝 (100-300目)层析柱，用4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比 值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减 压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；

总银杏内酯粗品中加入40倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g) 比值，V/W)纯水，于90℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃ 减压浓缩至干，得干品；

干品用20倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)5％乙醇加热 搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤， 得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏 内酯B 20.52g，转移率为22.77％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.1％， 白果内酯和银杏酸均未检出。

实施例4：

银杏叶150kg，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)60％乙醇加热回流提取1次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至 乙醇尽，且浓缩液体积至3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)， 置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓 度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入 HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点， 弃去洗脱液，再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物 59.46kg。

取银杏叶提取物10.0kg，先用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量 (g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，再用4倍(乙醇体积(ml) 与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，合并溶 解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的15倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝 (100-300目)层析柱，用4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比 值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减 压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；

总银杏内酯粗品中加入50倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g) 比值，V/W)纯水，于50℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃ 减压浓缩至干，得干品；

干品用30倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)30％乙醇加热 搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤， 得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏 内酯B 18.67g，转移率为19.61％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.7％， 白果内酯和银杏酸均未检出。

实施例5：

银杏叶150kg，粉碎，用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)80％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至 乙醇尽，且浓缩液体积至5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)， 置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓 度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入 HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点， 弃去洗脱液，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物 59.34kg。

取银杏叶提取物10.0kg，先用8倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g) 比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，再用6倍(乙醇体积(ml)与银 杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶解液； 溶解液加入用95％乙醇已处理过的30倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝 (100-300目)层析柱，用2倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比 值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减 压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；

总银杏内酯粗品中加入70倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g) 比值，V/W)纯水，于80℃搅拌溶解1小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减 压浓缩至干，得干品；

干品用20倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)40％乙醇加热 搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤， 得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏 内酯B18.19g，转移率为20.35％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.5％，白 果内酯和银杏酸均未检出。

实施例6：

银杏叶150kg，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值， V/W)70％乙醇加热回流提取1次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至 乙醇尽，且浓缩液体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)， 置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓 度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入 HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点， 弃去洗脱液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶54.32kg。

取银杏叶提取物10.0kg，先用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量 (g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，再用5倍(乙醇体积(ml) 与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶 解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的20倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝 (100-300目)层析柱，用3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比 值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减 压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；

总银杏内酯粗品中加入60倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g) 比值，V/W)纯水，于40℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃ 减压浓缩至干，得干品；

干品用40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)20％乙醇加热 搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤， 得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏 内酯B17.34g，转移率为19.78％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.6％，白 果内酯和银杏酸均未检出。

表1：实施例1-6银杏内酯B纯度及转移率

具体实施例序号 银杏内酯B纯度 银杏内酯B转移率 1 99.2％ 16.56％ 2 98.3％ 21.17％ 3 98.1％ 22.77％ 4 98.7％ 19.61％ 5 98.5％ 20.35％ 6 98.6％ 19.78％

试验例1：

银杏内酯B和白果内酯的色谱测定方法：

色谱系统和系统适用性试验：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇/ 水(30:70)为流动相，蒸发光散射检测器检测(参数：Agilent380-LC:漂移管温 度40℃，雾化室温度35℃，载气流量1.6SLM，柱温30℃)。

对照品溶液的制备：分别取银杏内酯B对照品、白果内酯对照品适量，精 密称定，加甲醇制成每1ml各含1mg、2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取银杏内酯B纯化物1mg，用甲醇溶解并定容至5ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：分别精密量取对照品溶液5ul、15ul，供试品溶液10ul，注入液 相色谱仪，测定，用外表两点法对数方程分别计算银杏内酯B、白果内酯的含量， 即得。

总银杏酸的测定方法：

色谱系统和系统适用性试验：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇 -1％冰醋酸溶液(90:10)为流动相；检测波长为310nm；

对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml 含5ug的溶液，作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml 含100ug的溶液，作为定位用对照溶液。

供试品溶液的制备：取银杏内酯B纯化物100mg，精密称定，加入石油醚 (60-90℃)50ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用 石油醚(60-90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，减压 回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得。

测定方法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各10ul，注 入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总面积，以白 果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。

利用上述检测方法，对实施例1-3的银杏内酯B、白果内酯和银杏酸进行检 测，检测结果分别见图1-3。

试验例2：

本发明制备方法与表2所列四种不同制备方法(对比例)做对比，分别检测 银杏内酯B成品中银杏内酯B纯度和转移率，白果内酯以及总银杏酸含量。试 验结果见表2。

其中四个对比例与本发明制备方法比较，不同点在于：

对比例1：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银 杏内酯粗品，用15％乙醇重结晶得银杏内酯B成品；

对比例2：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银 杏内酯粗品，用甲醇重结晶得银杏内酯B成品；

对比例3：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银 杏内酯粗品，加纯水于60℃下搅拌溶解，过滤，收集滤饼，浓缩至干，用甲醇 重结晶得银杏内酯B成品；

对比例4：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银 杏内酯粗品，加纯水于60℃下搅拌溶解，过滤，收集滤饼，浓缩至干，95％乙醇 重结晶得银杏内酯B成品；

以上四个对比例的实验参数均与本发明具体实施例1中参数相同。

表2 不同提取分离纯化方法效果对比

表1的测定结果表明，与4种对比例相比，本发明制备方法得到的银杏内酯 B的纯度高、转移率高、杂质含量少，尤其是未检出致敏成分银杏酸。整个工艺 过程仅使用纯水和乙醇，未使用有毒有机溶剂，重结晶用中低浓度乙醇，整个过 程适合工业化大生产，对环境友好，也保障了实验及工作人员的健康。