含有VEGF特异性表位和/或血管生成素-2特异性表位的DNA疫苗

摘要

本发明提供了用于癌症的治疗或预防试剂，其含有编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，其中包含特异性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

说明书

技术领域

本发明涉及对于癌症治疗或预防有效的DNA疫苗。

背景技术

对于肿瘤长大，依赖肿瘤的生长，需要增加将营养素和氧递送至肿瘤的血管。肿瘤细胞被视为通过经由自身分泌血管生长因子来诱导肿瘤血管的血管生成，所述血管生长因子刺激附近血管的血管内皮细胞生长。因此，已尝试通过抑制血管生长因子的功能且压制肿瘤血管生成来治疗或预防肿瘤。作为此类方法之一，靶向肿瘤血管生成相关因子的疫苗疗法已受到关注。在疫苗疗法中，癌症通过下述得到治疗或预防：将肿瘤血管生成相关因子、包含在所述因子中的表位或编码它们的表达载体施用于癌症患者或具有发展癌症的危险的靶标，从而在患者体内诱导针对肿瘤血管生成相关因子的抗体，从而中和所述因子的功能且压制肿瘤血管生成。作为肿瘤血管生成相关因子，多种因子例如VEGF、血管生成素、FGF、PDGF等是已知的。

例如，专利文件1公开了通过施用编码VEGF受体-1、VEGF受体-2或Flk-1的DNA疫苗，来抑制肿瘤微环境中的血管内皮细胞增殖、预防血管生成且抑制肿瘤生长和转移的方法。

专利文件2描述了通过使用异源VEGF疫苗来压制血管生成相关疾病，特别是癌症的发展和转移。

然而，对诸如VEGF等因子的免疫耐受性一般已建立，因为这些因子是患者的自身组分。因此，即使当这些因子或其部分肽直接施用于患者时，也难以在患者体内有效诱导针对这些因子的抗体。因而，需要一些技术构思以使得患者的免疫系统识别这些自身抗原，从而诱导其抗体的产生。

乙型肝炎病毒核心(HBc)抗原蛋白质通过自装配构成球形核心颗粒。核心颗粒具有极高免疫原性。当使用通过将所需表位插入在HBc抗原蛋白质的特定位点内，或将所需表位连接至HBc抗原蛋白质的末端而获得的融合多肽时，表位呈现于通过自装配形成的颗粒的表面上。使用融合多肽，插入的表位容易由免疫系统识别，并且可以有效地诱导识别所述表位的抗体的产生。因此，即使抗原难以由免疫系统识别，已尝试利用HBc抗原蛋白质作为疫苗平台，诱导抗体产生(非专利文件1，非专利文件2)。

专利文件3公开了由含有具有表位的外源氨基酸序列的嵌合HBc抗原蛋白质组成的颗粒，其中所述外源氨基酸序列插入在HBc抗原的氨基酸残基80-81之间。

然而，用于肿瘤血管生成相关因子的疫苗的有效性并非充分令人满意。

[文件列表]

[专利文件]

专利文件1：JP-A-2005-519092 

专利文件2：中国专利公开号1406629 

专利文件3：JP-B-3228737 

[非专利文件]

非专利文件1：D. C. Whitacre等人，Expert Rev. Vaccines，第8卷，no.11，1565-1573页，2009

非专利文件2：B. E. Clarke等人，Nature，第330卷，381-384页，1987。

发明概述

待由本发明解决的问题

如专利文件1中所述，当VEGF受体用作疫苗抗原时，因为待通过疫苗攻击的靶标变成表达VEGF受体的血管内皮细胞或一部分的癌细胞，所以通过经由增强细胞毒性免疫压制肿瘤中的血管生成而显示出抗肿瘤效应。然而，因为VEGF受体不仅在肿瘤组织的新生血管内皮细胞中表达，还在正常血管内皮细胞中表达，所以当VEGF受体用作疫苗抗原时，可以对正常血管功能发挥不利影响。

相应地，本发明旨在提供用于癌症治疗或预防的更好的疫苗，其靶向肿瘤血管生成相关因子且对正常血管功能具有降低的不利影响的危险。

解决问题的方法

本发明人已进行深入研究，且发现嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体的施用主要诱导对体液因子的体液免疫，所述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽通过将体液因子例如VEGF和血管生成素-2的特异性表位插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间获得，并且通过有效压制肿瘤血管生成，同时避免通过细胞介导的免疫对正常血管功能的不利影响，而能够治疗或预防癌症。基于这些发现，他们已进一步研究且完成本发明。

即，本发明涉及下述。

[1]　用于癌症的治疗或预防试剂，其包含编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，其中包含特异性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

[2]　[1]的治疗或预防试剂，其中所述癌症是实体瘤。

[3]　[1]或[2]的治疗或预防试剂，其中所述实体瘤是选自下述的任一种：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和前列腺癌。

[4]　[1] - [3]中任一项的治疗或预防试剂，其中所述插入的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或2中所示的氨基酸序列。

[5]　[1] - [3]中任一项的治疗或预防试剂，其中所述插入的氨基酸序列包含SEQ ID NO：31、32或33中所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列的部分序列，其包含SEQ ID NO：1或31中所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列的部分序列，其包含SEQ ID NO：2或31中所示的氨基酸序列。

[6]　[1] - [3]中任一项的治疗或预防试剂，其中所述插入的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3或4中所示的氨基酸序列。

[7]　[1] - [6]中任一项的治疗或预防试剂，其中所述插入的氨基酸序列进一步包含一种或多种特异性表位。

[8]　[1] - [7]中任一项的治疗或预防试剂，其多次施用。

[9]　[8]的治疗或预防试剂，其中所述施用次数为2、3或4次。

[10]　[9]的治疗或预防试剂，其中所述施用次数为3次。

[11]　[1] - [10]中任一项的治疗或预防试剂，其以半年间隔施用3次。

[12]　编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，所述表达载体用于癌症的治疗或预防，其中包含特异性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

[13]　编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：1或2显示的氨基酸序列，所述表达载体用于非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌或前列腺癌的治疗或预防，其中所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

[14]　编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：3或4显示的氨基酸序列，所述表达载体用于非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌或前列腺癌的治疗或改善，其中所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

[15]　[12] - [14]中任一项的表达载体，其中所述插入的氨基酸序列进一步包含一种或多种特异性表位。

[16]　用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，其包括给所述哺乳动物施用有效量的表达载体，所述表达载体编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，其中包含特异性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

发明效果

本发明提供了用于癌症治疗或预防的更好的疫苗，其靶向肿瘤血管生成相关因子且对正常血管功能具有降低的不利影响的危险。

因为本发明的疫苗主要诱导对体液因子例如VEGF和血管生成素-2的体液免疫，而不是细胞介导的免疫，所以可以降低细胞介导的免疫对正常血管功能的不利影响的危险。

此外，因为VEGF和血管生成素-2是分泌蛋白质，所以不易发生组织炎症，因为通过疫苗接种诱导的抗体主要与血液中的分泌蛋白质结合。

附图简述

图1显示了疫苗接种对肿瘤组织生长的影响。纵轴显示肿瘤组织的体积，并且横轴显示肿瘤注射后的天数。

图2显示了疫苗接种对注射有肿瘤的小鼠的存活率的影响。纵轴显示存活率，并且横轴显示肿瘤注射后的天数。

图3显示了在VEGF-贝伐珠单抗界面处的框架残基。红色：在与贝伐珠单抗的结合表面中的残基。黄色：红色中尤其重要的残基。蓝色：与VEGFR-1的结合表面中的残基。绿色，与VEGFR-2的结合表面中的残基。每个残基由单字母代码表示。

图4显示了DNA疫苗接种的时间过程。疫苗接种最初使用6周龄小鼠(0w)执行，并且随后的疫苗接种在第一次疫苗接种后2、4和8周时给予。

图5显示了在16周时的抗VEGF抗体滴度。VEGF的总IgG滴度在来自分别用HBc-mVEGF (7 a.a.)、HBc-mVEGF (13 a.a.)、HBc-mVEGF (17 a.a.)或HBc免疫接种的小鼠的小鼠血清(100稀释度)中进行定量。数据为平均值±S.E.M。

图6显示了疫苗的质粒DNA构建。(a) pcDNA3.1-HBc (对照载体)和pcDNA3.1-HBc-mVEGF (13 a.a.) (疫苗接种载体)的质粒图。HBc指示HBc的完全序列，HBc-N指示HBc的N末端(1-80 a.a.)，并且HBc-C指示HBc的C末端(81-183 a.a.)。mVEGF 13 a.a.指示关于小鼠VEGF蛋白质的抗原。(b)显示了关于VEGF疫苗质粒设计的详细信息。充当VEGF的抗原的十三个氨基酸(IMRIKPHQSQHIGE) (SEQ ID NO：1)，和接头(N末端I-T二肽接头和C末端GAT三肽)设计为与VEGF框内融合，以允许当表面暴露于HBc颗粒上时，VEGF表位的构象中的弹性。VEGF 13 a.a.和接头由单字母代码表示。

图7显示了在8周时的抗VEGF抗体滴度。VEGF的总IgG滴度仅在来自HBc-mVEGF (13 a.a.)组的小鼠血清(100稀释度)中是增加的(左图)。还使用亚型特异性IgG抗体评估了来自HBc-VEGF (13 a.a.)组的小鼠血清(100稀释度)中的IgG亚型分布(IgG1、IgG2a或IgG2b) (右图)。数据为平均值±S.E.M。*p < 0.05相对于对照(HBc和盐水)。

图8显示了免疫接种的血清与VEGF的特异性结合。在蛋白质印迹中用作一抗的免疫接种的血清不仅与BSA缀合的mVEGF(13 a.a.)结合，还与重组小鼠VEGF (rmVEGF)结合。装载样品如下。泳道1：重组小鼠VEGF-A。泳道2：BSA缀合的mVEGF (13 a.a.)。泳道3：作为阴性蛋白质的BSA缀合的人血管生成素-2肽。针对VEGF的商业单克隆抗体VG-1，用作阳性抗体。

图9显示了关于p-ERK和总ERK，在免疫接种的血清或对照血清的存在下，来自用以5 ng/mL的mVEGF刺激10分钟的HUVEC的细胞裂解产物的蛋白质印迹分析。

图10显示了免疫接种的血清对VEGF诱导的HUVEC的管形成的作用。将HUVEC以1x10⁵细胞/孔的密度铺平板到基质胶涂布的板上，并且在对照血清或免疫接种的血清的存在下温育。在7小时后，将毛细血管网拍照且定量。显示了代表性内皮管。放大率：50X。

数据为一式三份的平均值±S.E.M.。

实施方案的描述

本发明提供了用于癌症的治疗或预防试剂，其包含编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，其中包含特异性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。

当施用编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体时，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，诱导针对所表达的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位的免疫应答(优选体液免疫应答例如抗体产生等)，并且由抗体中和VEGF和/或血管生成素-2的活性，由此在癌症组织周围的血管生成可以被压制并且癌症组织的生长可以被抑制。相应地，成为本发明的治疗或预防试剂的靶标的癌症优选为实体瘤。实体瘤的例子包括但不限于非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、前列腺癌等。

虽然成为本发明的治疗或预防试剂的靶的癌症不受限制，但它优选是表达VEGF和/或血管生成素-2的癌症。在癌症中VEGF和/或血管生成素-2表达的存在或不存在可以通过使用针对VEGF的特异性抗体和/或针对血管生成素-2的特异性抗体的免疫学方法(免疫组织化学染色、蛋白质印迹等)加以证实。

虽然在本发明中预期了衍生自本发明治疗或预防试剂的应用靶标的哺乳动物的VEGF和血管生成素-2的使用，但它并不限于此。本发明治疗或预防试剂的应用靶标是哺乳动物。哺乳动物的例子包括啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等，兔形目例如兔等，有蹄类动物例如猪、牛、山羊、马、绵羊等，食肉动物例如狗、猫等，灵长类动物例如人、猴、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等，等等。哺乳动物优选是啮齿类动物(小鼠等)或灵长类动物(人等)。因此，例如，当本发明的治疗或预防试剂应用于人时，预期衍生自人的VEGF和血管生成素-2的使用，但并不限于此。同样，当本发明的治疗或预防试剂应用于小鼠时，预期衍生自小鼠的VEGF和血管生成素-2的使用，但并不限于此。

在本说明书中，关于特定因子X (多肽或多核苷酸)，“衍生自生物Y的因子X”或“生物Y因子X”意指因子X的氨基酸序列或核酸序列具有与生物Y中天然表达的因子X的氨基酸序列或核酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列或核酸序列。“基本上相同的”意指目的氨基酸序列或核酸序列与生物Y中天然表达的因子X的氨基酸序列或核酸序列具有不少于70% (优选不少于80%、更优选不少于90%、仍更优选不少于95%、最优选不少于99%)同一性，并且因子X的功能得到维持。

VEGF和血管生成素-2是已知的血管生成因子，并且其氨基酸序列和cDNA序列也是已知的。VEGF含有7个亚型，包括A、B、C、D、E、PLGF-1和PLGF-2，并且任何亚型的VEGF的特异性表位均可用于本发明中，只要它治疗或预防癌症。优选地，使用VEGF-A、B、C、D、E的特异性表位。代表性氨基酸序列包括下述等。

血管生成素-2的代表性氨基酸序列如下。

在本说明书中，“表位”指通过每种抗体或T细胞受体识别的基本元件或最小单位，其为上述抗体或T细胞受体所结合的特定结构域、区域或分子结构。

待用于本发明中的VEGF的表位和血管生成素-2的表位对所述VEGF和血管生成素-2是特异性的。“特异性的”意指除衍生出VEGF和血管生成素-2的哺乳动物中天然表达的VEGF和血管生成素-2外的基因产物(排除免疫球蛋白和T细胞受体的可变区)不含所述表位。

作为待用于本发明中的VEGF的特异性表位和血管生成素-2的特异性表位，优选选择位于下述位置的表位：当识别所述表位的抗体与所述表位结合时，VEGF和血管生成素-2的活性被抑制。此类表位可以在功能位点中，例如，受体结合位点、二价离子结合位点、由特异性酶识别的位点等。包含在VEGF和血管生成素-2的成熟过程期间去除的位点例如信号肽等中的表位优选从待用于本发明的表位中排除。本领域普通技术人员可以适当地基于VEGF和血管生成素-2的立体结构等来选择表位。

表位的氨基酸序列长度一般为5-30个氨基酸，优选6-25个氨基酸，更优选10-18个氨基酸，更加优选11-16个氨基酸。当氨基酸序列太短时，表位的抗原性可能丧失。当氨基酸序列太长时，嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽无法容易地由于自装配而形成核心颗粒，因此可能不产生特异性识别所述表位的抗体，并且可能不获得对癌症的优良治疗或改善作用。

VEGF和血管生成素-2的优选表位的具体例子包括下述。

(血管生成素-2)

。

在进一步方面，VEGF的具体优选例子包括下述。

(viii) 由SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列的部分序列组成的表位，所述SEQ ID NO：32含有SEQ ID NO：1或31中所示的氨基酸序列；

(ix) 由SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列的部分序列组成的表位，所述SEQ ID NO：33含有SEQ ID NO：2或31中所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：1、31和32是小鼠VEGF-A的部分氨基酸序列。SEQ ID NO：2、31和34是人VEGF-A的部分氨基酸序列。SEQ ID NO：3和4是人血管生成素-2的部分氨基酸序列。

上述(viii)和(ix)中的部分序列长度为8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸。

在本发明中使用的乙型肝炎病毒核心抗原多肽是：

(1) 含有由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽，或

(2) 与由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有不少于90% (优选不少于95%、更优选不少于97%、仍更优选不少于99%)同一性的氨基酸序列，并且具有由于自装配而形成核心颗粒的活性的多肽。

自装配指一种现象，其中溶解于溶液中的分子结合以形成装配体。核心颗粒指具有特异性重复组成的刚性结构。在本说明书中，核心颗粒可以是合成步骤的产物或生物步骤的产物。

作为实施方案(2)的多肽，可以提及含有由WO 2003/031466中公开的SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽。含有由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽(除了位置48、61、107和185的一个或多个半胱氨酸残基被缺失或由其他氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代)也优选作为实施方案(2)的多肽。如本领域普通技术人员认识到的，在具有不同于SEQ ID NO：7那种的氨基酸序列的多肽中，在相似位置处的半胱氨酸残基可以被缺失或由其他氨基酸残基取代，并且通过此类缺失和取代获得的多肽也包含在实施方案(2)的多肽中。

实施方案(2)的多肽还包含变体多肽，其中在对应于SEQ ID NO：7的97位的位置处的异亮氨酸残基由亮氨酸残基或苯丙氨酸残基取代(Yuan等人，J. Virol. 第73卷，第10122 - 10128页(1999))。另外，许多HBcAg变体和几种乙型肝炎病毒核心抗原前体变体的氨基酸序列公开于GenBank报告

和M95589 (公开内容各自引入本说明书作为参考)中，并且含有这些变体的氨基酸序列的多肽也包含在实施方案(2)的多肽中。上述变体具有在许多位置处不同的氨基酸序列，包括对应于在下述位置处存在的氨基酸残基的氨基酸残基：SEQ ID NO：7中的

和183。

此外，含有WO 01/98333、WO 01/77158和WO 02/14478 (所有均引入本说明书作为参考)中所述的HBcAg变体的氨基酸序列的多肽也包含在实施方案(2)的多肽中。

除非特别指出，在本说明书中，乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸序列中的氨基酸残基位置用由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列作为标准进行指定。当多肽不含由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列时，将所述多肽的氨基酸序列与由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列比对，并且采用对应的氨基酸残基的位置。

在本发明中使用的乙型肝炎病毒核心抗原多肽优选是含有由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽。

在待用于本发明中的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中，包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位的氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸残基80和81之间。即，待用于本发明中的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽从N末端侧开始以(a)、(b)、(c)的次序含有下述元件(a)-(c)：

(a) 乙型肝炎病毒核心抗原多肽的N末端部分多肽残基(由从N末端到氨基酸残基80的乙型肝炎病毒核心抗原多肽的连续部分氨基酸序列组成)，

(b) 由VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位组成的氨基酸序列，和

(c) 乙型肝炎病毒核心抗原多肽的C末端部分多肽残基(由从氨基酸残基81到C末端的乙型肝炎病毒核心抗原多肽的连续部分氨基酸序列组成)。

具有上述组成的待用于本发明中的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自装配而形成核心颗粒，并且VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位呈现于颗粒的外部上。

除组成元件(b) (由VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位组成的氨基酸序列)之外，插入在组成元件(a)和组成元件(c)之间的氨基酸序列可以进一步含有一个或多个(优选1-3个，更优选1个)特异性表位。进一步的特异性表位可以在组成元件(a)和组成元件(b)之间，或在组成元件(b)和组成元件(c)之间的任何位置处插入。进一步的特异性表位的氨基酸序列长度一般为5-30个氨基酸，优选6-25个氨基酸，更优选10-18个氨基酸，进一步更优选11-16个氨基酸。

当多个特异性表位插入在组成元件(a)和组成元件(c)之间时，所述特异性表位可以通过共价键直接连接，或经由间隔区序列连接。间隔区序列意指待插入到包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的两个邻近组成元件之间的含有一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。特异性表位优选经由间隔区序列连接，从而可以稳定呈现多个特异性表位，同时维持其结构。间隔区序列的长度不受限制，只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽通过自装配而形成核心颗粒，并且所有插入的特异性表位均呈现在颗粒外部，并且一般为1-10个氨基酸、优选1-5个氨基酸、更优选1-3个氨基酸、最优选2或3个氨基酸。

在组成元件(a)和组成元件(c)之间的最N末端侧上的特异性表位以及组成元件(a)可以通过共价键直接连接或经由间隔区序列连接。元件(a)和在最N末端侧上的特异性表位优选经由间隔区序列连接，从而使得VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位稳定呈现于通过嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的自装配形成的颗粒外部上，同时维持其结构。虽然只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自装配而形成核心颗粒，并且VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位呈现于颗粒的外部上，间隔区序列的长度不受限制，但它一般为1-10个氨基酸、优选1-5个氨基酸、更优选1-3个氨基酸、最优选2或3个氨基酸。另外，间隔区序列的种类不受限制，只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自装配而形成核心颗粒，并且VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位呈现于颗粒的外部上。优选间隔区序列的例子包括但不限于IT、GAT、CGG等。

在组成元件(a)和组成元件(c)之间的最C末端侧上的特异性表位以及组成元件(c)可以通过共价键直接连接或经由间隔区序列连接。元件(b)和元件(c)优选经由间隔区序列连接，从而使得VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位稳定呈现于通过嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的自装配形成的颗粒外部上，同时维持其结构。虽然只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自装配而形成核心颗粒，并且VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位呈现于颗粒的外部上，间隔区序列的长度不受限制，但它一般为1-10个氨基酸、优选1-5个氨基酸、更优选1-3个氨基酸、最优选2或3个氨基酸。另外，间隔区序列的种类不受限制，只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自装配而形成核心颗粒，并且VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位呈现于颗粒的外部上。优选间隔区序列的例子包括但不限于IT、GAT、CGG等。

在组成元件(a)和组成元件(c)之间插入的氨基酸序列的长度并无具体限制，只要嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽由于自装配而形成核心颗粒，并且VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位呈现于颗粒的外部上，并且癌症可以得到治疗或预防，并且一般为5-80个氨基酸。当插入的氨基酸序列太短时，作为表位的抗原性可能丧失。当插入的氨基酸序列太长时，由于自装配通过嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽而形成核心颗粒变得困难，因此不产生特异性识别插入的表位的抗体，并且可能不获得对癌症的良好治疗或改善作用。

用于本发明中的表达载体是掺入编码上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸的重组载体。在将表达载体施用于靶标哺乳动物时，表达载体细胞内地掺入靶标哺乳动物内，并且细胞表达上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽。由编码嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸插入的表达载体的例子包括质粒、病毒、噬菌体、粘粒和本领域常规使用的其他载体。质粒载体的例子包括但不限于

(商品名，Invitrogen)、pZeoSV (商品名，Invitrogen)、pBK-CMV (商品名，Stratagene)等。病毒载体是DNA病毒或RNA病毒。病毒载体的例子包括但不限于脱毒逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒、日本血凝病毒(HVJ)、SV40、人免疫缺陷病毒(HIV)等。此外，还可以利用日本血凝病毒包膜(HVJ-E)等。

在上述表达载体中，编码嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸(优选DNA)可操作地连接至启动子，所述启动子能够在成为施用对象的哺乳动物(优选人)的细胞中显示出启动子活性。

待使用的启动子并无具体限制，只要它可以在成为施用对象的哺乳动物(优选人)的细胞中起作用。启动子的例子包括pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子等。具体地，使用病毒启动子例如SV40衍生的初始启动子、巨细胞病毒LTR等，哺乳动物组成型蛋白质基因启动子例如β-肌动蛋白基因启动子等，RNA启动子例如tRNA启动子等，等等。

上述表达载体优选在编码嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的多核苷酸下游处含有转录终止信号，即终止区。它可以进一步含有用于选择转化细胞的选择标记基因(赋予对药物例如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等的抗性的基因，补充营养缺陷型突变的基因等)。

在一个实施方案中，上述表达载体可以含有免疫刺激序列(ISS) (也称为CpG)，以加强免疫效应。免疫刺激序列是含有细菌的非甲基化CpG基序的DNA，并且已知作为特定受体(Toll样受体9)的配体发挥作用(关于细节参见和。免疫刺激序列的优选例子包括下述。

可选地，可将来自这些ISS中的2、3或4种可以连接且使用。连接的ISS序列的优选例子包括下述。

根据例如“Sambrook等人编辑，”，“Ausubel等人编辑， & Sons”中所述的众所周知的基因工程技术，本领域普通技术人员可以构建上述表达载体。

本发明的治疗或改善试剂可以作为药物组合物提供，除治疗有效量的上述表达载体之外，所述药物组合物还含有任何载体例如药学可接受的载体。

药学可接受的载体的例子包括但不限于赋形剂例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等；粘合剂例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、明胶、阿拉伯树胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉和等，崩解剂例如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、钠-乙二醇-淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等，润滑剂例如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石、月桂基硫酸钠等，芳香剂例如柠檬酸、薄荷醇、甘草甜素·铵盐、甘氨酸、橙粉等，防腐剂例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等，稳定剂例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等，悬浮剂剂例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等，分散剂例如表面活性剂等，稀释剂例如水、盐水等，基质蜡例如可可脂、聚乙二醇、白煤油等，等等。

本发明的治疗或改善试剂可以进一步含有佐剂，以加强其效应。佐剂的例子包括氢氧化铝、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、百日咳杆佐剂、聚(I:C)、CpG-DNA等。

为了促进表达载体的细胞内引入，本发明的治疗或预防试剂可以进一步含有用于核酸引入的试剂。作为用于核酸引入的试剂，可以使用阳离子脂质例如lipofectin (商品名，Invitrogen)、lipofectamine (商品名，Invitrogen)、transfectam (商品名，Promega)、DOTAP (商品名，Roche Applied Science)、双十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS)、L-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、N,N-二-n-十六烷基-N,N-二羟基乙基溴化铵(DHDEAB)、N-n-十六烷基-N,N-二羟基乙基溴化铵(HDEAB)、聚凝胺、聚(乙烯亚胺) (PEI)等。另外，表达载体可以包括在由脂质双层构成的任何已知的脂质体中，例如静电脂质体。此类脂质体可以与病毒例如灭活的日本血凝病毒(HVJ)融合。与一般脂质体相比较，HVJ-脂质体与细胞膜具有极高融合活性。当逆转录病毒用作表达载体时，RetroNectin、纤连蛋白、聚凝胺等可以用作转染试剂。

虽然药物组合物中的上述表达载体的含量并无具体限制，并且适当地选自广泛范围，但它一般为整个药物组合物的约0.00001 - 100重量%。

通过将上述表达载体引入应用靶标哺乳动物的组织(或细胞)内，本发明的治疗或预防试剂诱导上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的体内表达，诱导针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的VEGF的表位和/或血管生成素-2的表位的抗体产生，并且通过经由诱导的抗体中和VEGF和/或血管生成素-2的活性，压制在癌症组织周围的血管生成且抑制癌症组织的生长。用于将核酸例如表达载体等引入体内的多种方法是已知的(T. Friedman，Science 244：1275-1281(1989))，并且任何引入方法均可采用，只要它可以诱导上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的体内表达，诱导针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的VEGF的表位和/或血管生成素-2的表位的抗体产生，并且治疗或预防癌症。

用于将表达载体等引入哺乳动物组织(或细胞)体内的方法的例子包括但不限于内脂质体法、静电脂质体法、HVJ-脂质体法、HVJ-AVE脂质体法、受体介导的转基因、粒子枪法、裸露DNA法、通过正电荷聚合物的引入法、电穿孔法等。

可选地，细胞例如血细胞、骨髓细胞等可以从应用靶标哺乳动物中分离，可将上述表达载体引入离体细胞内，此后，将所获得的含有上述表达载体的细胞可以送回到应用靶标哺乳动物。

用于将表达载体引入离体哺乳动物细胞内的方法的例子包括但不限于脂转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-右旋糖酐法、使用玻璃微毛细管的直接DNA引入法、电穿孔法等。

本发明的治疗或预防试剂可以通过任何方法进行施用，只要在施用对象哺乳动物中，所述试剂诱导上述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的体内表达，诱导针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位的抗体产生。优选地，本发明的治疗或预防试剂以足以诱导抗体产生的量肠胃外施用，所述抗体针对包含在嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，并且治疗或预防癌症。例如，经由静脉内、腹膜内、皮下、皮内、脂肪组织内、乳房腺体组织内或肌内途径注射；气体诱导的粒子轰击法(通过电子枪等)；经由粘膜途径以洗鼻剂形式的方法等叙述为施用方法的例子。在一个实施方案中，本发明的治疗或预防试剂皮下或肌内注射。

在一个实施方案中，本发明的治疗或预防试剂通过无针注射器皮下施用。无针注射器优选为压力注射器。无针注射器的例子包括但不限于ShimaJET (商品名，SHIMADZU CORPORATION)、Twinject EZII (商品名，Japan chemical research)、Syrijet (商品名，Keystone)、ZENEO (商品名，Crossject)等。在这种情况下，本发明的治疗或预防试剂可以作为含有上述表达载体和无针注射器的注射制剂提供，其中所述表达载体封入在所述无针注射器中。

在一个实施方案中，本发明的治疗或预防试剂用基因枪皮下、皮内或肌内施用。在这种情况下，上述表达载体可以应用到待引入体内的载体颗粒例如胶体金颗粒等上，且用于施用。关于用多核苷酸包被载体颗粒的技术是已知的(参见例如WO 93/17706)。最后，表达载体可以在适合于施用于机体的水溶液例如生理盐水等中制备。

为了诱导良好的免疫应答，本发明的治疗或预防试剂优选以给定间隔施用多次。虽然频率可以通过监控免疫应答水平适当地测定，但它一般为2-10次，优选2-6次，更优选2、3或4次，最优选3次。

施用频率一般为每1周 - 1年一次，优选每1-6个月一次。

在一个实施方案中，本发明的治疗或预防试剂以6个月间隔向靶哺乳动物施用3次。

虽然本发明的治疗或预防试剂的剂量依赖由活性成分表达载体编码的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中包含的VEGF的表位和/或血管生成素-2的表位在施用对象哺乳动物中的免疫原性，但本领域普通技术人员可以通过下述测定良好免疫应答所需的剂量：给施用对象哺乳动物施用给定量的表达载体，通过检测方法例如ELISA等测量对表位特异性的抗体滴度，并且观察免疫应答。本领域普通技术人员应当理解本发明的治疗或预防试剂的免疫原性也依赖用于作为活性成分的表达载体的调节序列例如启动子的强度。此外，依赖待使用的表达载体的种类，本领域普通技术人员还可以容易地控制本发明的治疗或预防试剂的剂量。

当施用编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体时，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，诱导针对所表达的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽中的VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位的免疫应答(优选体液免疫应答例如抗体产生等)，并且由抗体中和VEGF和/或血管生成素-2的活性，由此在癌症组织周围的血管生成可以被压制并且癌症组织的生长可以被抑制。相应地，本发明的治疗或预防试剂的施用对象包括癌症患者，具有癌症临床史的那些，具有发展癌症的危险的非癌症患者等。通过给癌症患者施用编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体来治疗癌症，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，由此压制在癌症患者的癌症组织周围的血管生成，并且抑制癌症组织的生长。另外，转移可以通过压制在癌症患者中的微转移损害周围的血管生成得到压制。癌症的复发可以通过给具有癌症临床史的那些施用编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体得到压制，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位，由此压制在具有癌症临床史的那些体内可能潜伏存在的微转移损害周围的血管生成，并且抑制癌症组织的生长。此外，具有发展癌症的危险的非癌症患者中的癌症发作可以通过给非癌症患者施用编码由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表达载体得到预防，所述氨基酸序列包含VEGF的特异性表位和/或血管生成素-2的特异性表位。

本文引用的所有参考文献包括专利和专利申请在此全文引入作为参考，至它们已在本文中公开的程度。

本发明在下文中通过参考实施例更详细地加以说明，所述实施例决不以任何方式限制本发明。

实施例

[实施例1]

表达HBc-mVEGF (13aa)和HBc-hAng2 (16aa)的构建体的制备

质粒pPLc3(登录号LMBP 2470)购自BCCM/LMBP Plasmid Collection。通过PCR和连接获得编码经修饰的HBc的DNA片段，其中小鼠VEGF的部分氨基酸序列(SEQ ID NO：1)或人血管生成素-2的部分氨基酸序列(SEQ ID NO：3)插入在HBc的氨基酸残基80和81之间。将该DNA片段TA克隆到pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA Expression Kit (Invitrogen)内，以获得HBc-AngII ISS(-)载体。类似地，使用模板(质粒pPLc3)和引物组(HBcF和HBcR)执行PCR，以制备编码HBc的全长多肽的DNA片段，并且将该DNA片段TA克隆到pcDNA 3.1/V5-His TOPO载体内，以获得HBc-mVEGF表达载体和HBc-hAng2表达载体。所制备的HBc-mVEGF和HBc-hAng2的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：28和30中，并且所述编码氨基酸序列的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：27和29中。下述区域对应于插入的序列。

SEQ ID NO：27的核苷酸编号244-297 (在这些中，核苷酸编号250-288编码SEQ ID NO：1)

SEQ ID NO：28的氨基酸编号81-98 (在这些中，氨基酸编号83-95对应于SEQ ID NO：1)

SEQ ID NO：29的核苷酸编号244-306 (在这些中，核苷酸编号250-297编码SEQ ID NO：3)

SEQ ID NO：30的氨基酸编号81-101 (在这些中，氨基酸编号83-98对应于SEQ ID NO：3)。

[实施例2]

通过电穿孔仪(electroporator)，将实施例1中制备的每种表达载体(HBc、HBc-mVEGF、HBc-hAng2)引入BALB/c小鼠(雌性，6周龄)内。在以2周间隔免疫接种3次(0、2、4 w)和4周的间隔后，给予另外的免疫接种(8 w)。通过胰蛋白酶回收在RPMI (10% FBS，pc/sm)中培养下的生长阶段中的Colon26 (CT-26)细胞，并且悬浮于PBS中，以获得在PBS中具有1×10⁷细胞/mL浓度的细胞悬浮液。最后一次的另外免疫接种后一周(9 w)，给免疫接种小鼠的背部剃毛，并且皮下注射(第0天)细胞悬浮液(100 mL，1×10⁶细胞/小鼠)。用游标卡尺测量肿瘤直径(肿瘤体积=长直径×短直径×短直径÷2)。

与阴性对照载体相比较，在用HBc-mVEGF和HBc-hAng2免疫接种的小鼠中，肿瘤生长被压制(图1)，并且在肿瘤移植后的存活率增加(图2)。

[实施例3]

(结果)

用于VEGF的DNA疫苗的产生

为了证实该DNA疫苗系统是否足以诱导抗VEGF抗体产生，通过使用电穿孔仪的肌内施用，每两周三次，分别用pcDNA3.1-HBc-mVEGF(7 a.a.) [HBc-mVEGF(7 a.a.)]、pcDNA3.1-HBc [HBc]或盐水给BALB/c雌性小鼠免疫接种，并在第三次免疫接种后进行另外加强(图3和4)。结果，与对照(HBc和盐水)组相比较，在HBc-mVEGF (7 a.a.)组中未观察到高滴度的抗VEGF抗体(图5)。因为该7 a.a.序列对于B细胞表位诱导抗VEGF抗体可能是不足够的，所以还设计了长序列作为候选抗原，其覆盖与贝伐珠单抗、VEGFR-1或VEGFR-2的结合表面。将6或10个氨基酸加入核心序列，由此分别制备靶标13-氨基酸序列和17-氨基酸序列(图3)。随后，类似地构建和，并且给小鼠接种疫苗。如图5中所示，两种抗原均成功地诱导抗VEGF抗体的产生。与17 a.a.和7 a.a组相比较，在HBc-mVEGF (13 a.a.)组中观察到相对高滴度的抗VEGF (图5)。因此，决定将13 a.a. (IMRIKPHQSQHIG)作为使用HBc系统的VEGF DNA疫苗的抗原(图6a和b)。在经转染的COS-7细胞中证实了HBc-mVEGF (13 a.a.)的表达载体的功能性。每种构建体都表达了具有预期长度的mRNA和具有预期分子量的蛋白质。

证实了在八周时(第三次免疫接种后四周)的抗VEGF抗体滴度(图1d)，并且在HBc-mVEGF (13 a.a.)组中观察到高滴度(图7a和8)。在IgG亚型的分析中，该免疫接种可以导致偏向Th1的免疫应答，伴随占优势的IgG2a和IgG2b产生(图7b)。本发明人进一步证实通过用HBc-mVEGF (13 a.a.)免疫接种产生的血清是否将在蛋白质印迹分析中识别重组小鼠VEGF-A蛋白质。使用针对VEGF的商业抗体VG-1证实免疫接种的血清与重组VEGF蛋白质的特异性结合(图8)。

通过VEGF DNA疫苗接种产生的抗VEGF抗体的中和活性

为了检查来自接种疫苗小鼠的血清的中和活性，如方法部分中所述，本发明人使用蛋白G柱纯化血清的小鼠IgG。免疫接种血清而不是对照血清的处理显著减弱了HUVEC中VEGF-A诱导的ERK1/2磷酸化(图9)。在基质胶中的HUVEC的管形成中，在具有0.4% FBS和0.4%补充物的EBM-2的存在下，与对照血清的添加相比较，免疫接种血清的添加还显著减弱HUVEC的管形成(图10)。

(方法)

血清中的抗mVEGF抗体的测量

在第一次免疫接种后十八或十六周，从所有组的免疫接种小鼠中收集血清。通过ELISA测量这些小鼠中的抗VEGF抗体的血清水平。简言之，用在碳酸盐缓冲液中的5 μg/mL VEGF 13 a.a.肽缀合的BSA，将ELISA板在4℃下包被过夜。将来自免疫接种小鼠的系列稀释(1:100 - 1:312500)的血清样品加入孔中，并且加入HRP缀合的小鼠IgG (完整IgG；GE Health care，UK，每个亚型；Abcam，UK)。在用PBST洗涤四次后，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，Sigma-Aldrich，USA)。通过添加0.5 mol/L硫酸停止蓝色反应产物的产生，并且在450 nm处读取所得到的最终产物(黄色)。

IgG纯化

根据制造商的说明书(MAbTrap Kit；GE Healthcare，UK)，使用蛋白G柱纯化小鼠血清。简言之，将血清样品调整至结合缓冲液的组成(20 mM磷酸钠，pH 7.0)。用蒸馏水从蛋白G柱中洗出乙醇防腐剂，并且用结合缓冲液平衡。应用稀释的血清并且用结合缓冲液洗涤柱，直至在洗脱物中不出现材料。这之后，通过洗脱缓冲液(0.1 M 甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱IgG级分，并且通过离心式滤器(Amicon Ultra；Millipore，USA)浓缩。

管形成测定

根据制造商的说明书执行使用基质胶(Becton-Dickinson，USA)的管形成测定。简言之，基质胶用于涂布24孔板的孔(0.25 mL/孔)，并且在37℃下静置聚合1小时。在聚合后，将悬浮于具有对照血清或免疫接种血清的0.3 ml EBM-2 (含有20% EGM-2 kit、0.4% FBS和20%补充物)中的HUVEC (100,000个细胞)加入每个孔中。在6小时后，孔以50倍放大率在五个随机化视野中拍照(Olympus)，并且通过使用ImageJ计数其管状网络的数目。

蛋白质印迹分析

简言之，对于三次独立实验的每一次，在所示处理后，使用具有蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Mannhein，德国)、10 mmol/L NaF和1 mmol/L Na₃VO₄，购自Millipore (Bedford，MA)的RIPA裂解缓冲液分离总蛋白质(10 μg)；并且通过SDS-PAGE进行大小分级，且转移至购自Millipore的Immobilon-P。用针对pERK和ERK的抗体(细胞信号传导技术)检测印迹的蛋白质；随后为适当的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗，并且通过ECL (Amersham，Arlington Heights，IL)检测。用FujiFilm LAS-1000照相机检测化学发光信号，并且用Multi Gauge 3.2V软件进行分析。用ImageJ软件定量条带。

工业实用性

本发明提供了用于癌症治疗或预防的更好的疫苗，其靶向肿瘤血管生成相关因子且对正常血管功能具有降低的不利影响的危险。

本申请基于在日本提交的专利申请号2012-191717 (提交日期：2012年8月31日)，所述专利申请的内容全文引入本文。