Der f1的T细胞表位疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗及对STAT4/STAT6信号通路的影响

摘要

目的:探讨以粉尘螨Der f1的T细胞表位融合肽为疫苗对过敏性哮喘小鼠进行特异性免疫治疗的效果和对STAT4/STAT6信号通路的影响。
　　方法:将Der f1的8段T细胞表位，按照T1-T2-T3-T4-T5-T6-T7-T8连接方式合成融合肽，命名为Der f1T。将上述融合基因克隆到pET28a(+)中，构建pET28a(+)-Der f1 T重组载体，用限制性内切酶验证，将pET28a(+)-Der f1 T重组载体转入E.coli BL21(DE3)中，用不同浓度的IPTG小剂量诱导表达Der f1 T，确定出最适浓度，然后在最适IPTG浓度条件下进行Der f1T的大剂量表达并纯化。制样进行SDS-PAGE、Western bloting鉴定分析表达的蛋白。以粉尘螨粗提液为致敏原，构建小鼠过敏性哮喘模型，30只小鼠按每组10只随机分为三组，PBS组、哮喘组和免疫治疗组。以纯化的Der f1 T细胞表位融合肽为疫苗对哮喘小鼠模型进行特异性免疫治疗。处死小鼠，分别收集每组小鼠的标本。应用ELISA法检测脾细胞培养上清和BALF中细胞因子IL-13和IFN-γ含量及血清中特异性IgE(sIgE)和IgG2a水平。提取各组肺组织蛋白行Western bloting鉴定STAT4/STAT6蛋白的表达情况。
　　结果:双酶切和测序结果说明原核表达载体pET28a(+)-Der f1T构建成功;SDS-PAGE说明Der f1T诱导且纯化成功;Western bloting进一步说明Der f1T蛋白纯化成功;肺组织病理切片镜检说明，免疫治疗组小鼠炎症反应比哮喘组炎症明显好转，炎症细胞浸润减轻。小鼠BALF中嗜酸性粒细胞数结果为免疫治疗组嗜酸性粒细胞数明显低于哮喘组(p＜0.01)。免疫治疗组小鼠的BALF中细胞因子IL-13含量与哮喘组小鼠相比显著降低(p＜0.01)，IFN-γ含量的变化与之截然不同，免疫治疗组明显高于哮喘组(p＜0.01)。各组脾细胞培养上清中IL-13，免疫治疗组明显低于哮喘组(p＜0.01)，IFN-γ含量的变化与之截然不同，免疫治疗组比哮喘组显著升高(p＜0.01)。血清中特异性IgE含量结果为免疫治疗组明显低于哮喘组(p＜0.01)，IgG2a变化水平与IgE变化正好相反，免疫治疗组比哮喘组显著升高(p＜0.01)。
　　结论:成功表达Der f1的T细胞表位重组蛋白，且该蛋白有效缓解哮喘小鼠的炎症反应并纠正Th1/Th2失衡。

目录

声明

摘要

主要仪器

注释说明清单

引言

第一部分 粉尘螨1类变应原T细胞表位重组蛋白的构建及鉴定

1 研究内容

1．1 合成基因

1．2 设计引物

1．3 构建重组表达质粒

2 材料与方法

2．1 主要试剂

2．2 主要试剂配置

3 实验方法

3．1 Der f1 T细胞表位嵌合基因的制备

3．2 重组表达质粒的构建

3．3 重组质粒的提取

3．4 重组质粒双酶切鉴定

3．5 E．coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化

3．6 菌落PCR验证

3．7 DNA测序测定

3．8 Der f1，Der f1 T蛋白的小量诱导表达

3．9 Der f1，Der f1 T蛋白的SDS-PAGE分析

3．10 Der f1，Der f1 T蛋白的大剂量诱导表达

3．11 Der f1，Der f1 T蛋白的纯化及鉴定

3．12 纯化产物的免疫印记(western blot)分析

3．13 患者血清IgE结合活性检测

4 结果

4．1 PCR扩增结果

4．2 重组质粒鉴定

4．3 重组蛋白表达与纯化

4．4 免疫印迹实验鉴定Western blotting

4．5 Der f1T对患者血清IgE结合力

讨论

第二部分 Der f1的T细胞表位疫苗的治疗效果和对STAT4／STAT6信号通路的彤响STAT4／STAT6信号通路的彤响

1 研究内容

2 材料

2．1 实验动物

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器设备

2．4 主要试剂配制

3 方法

3．1 建立哮喘小鼠模型

3．2 特异性免疫治疗

3．3 制备支气管肺泡灌洗液(BALF)并进行细胞因子检测

3．4 测定血清中特异性IgE(sIgE)和IgG2a水平

3．5 培养脾细胞并测定培养上清中细胞因子水平

3．6 制作肺组织病理切片

3．7 提取肺组织蛋白

3．8 Western bloting分析

3．9 统计学分析

4 结果

4．1 肺组织病理切片检查结果

4．2 BALF中嗜酸性粒细胞计数

4．3 BALF中细胞因子IL-13和IFN-r含量测定

4．4 血清中特异性IgE(sIgE)和IgGza水平测定

4．5 脾细胞培养上清中IL-13和IFN-r含量测定

4．6 肺组织中STAT4／STAT6蛋白表达变化

讨论

结论

参考文献

作者简介及读研期间主要科研成果

致谢