使用纤维素和纤维素结合域从植物中分离并纯化蛋白质的方法

摘要

本发明涉及一种使用不同结构的纤维素和/或其变体从植物分离蛋白质的方法，所述蛋白质含有纤维素结合域。根据本发明的蛋白质的分离方法，由于使用了高亲和性的纤维素结合域，可以快速有效地从植物体中低成本分离大量高纯度的重组蛋白，由此本发明可以应用在各种工业领域中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用不同结构的纤维素和/或其变体分离含有纤维 素结合域的蛋白质的方法。

背景技术

纤维素是构成细胞膜和木质部的基本成分，并且是在植物中含量约 大于等于30％的一类有机化合物。纤维素是一种多糖，其化学结构由多 个通过β-1,4糖苷键连接的D-葡萄糖单元组成，并且在自然状态下，分 子量为数万到数十万。纤维素是白色无味固体，不溶于水、乙醇和乙醚， 对于碱具有很强的抗性。然而，纤维素在酸中或铜铵液中水解，从而产 生大量的作为中间产物的纤维二糖，并最终转化为葡萄糖。由于纤维素 是自然界中最丰富的天然资源之一，所以进行了许多利用纤维素的研究。

同时，分解纤维素的纤维素酶具有纤维素结合域(CBD)，并由此 特异性地与纤维素结合以有效分解纤维素。研究人员已经做出了各种各 样的尝试，通过使这样的纤维素结合域与靶蛋白结合来制备特异性结合 纤维素的重组蛋白(韩国专利号10-0618563)。然而，这些尝试仅限于 使用微生物制备重组蛋白的方法，但是使用植物的例子尚未被报道。

然而，最近，由于注意力集中在制备植物来源的重组蛋白或疫苗， 迫切需要开发使用植物制备大量重组蛋白的方法，及低成本快速分离大 量高纯度的重组蛋白的方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于解决传统的技术问题，因此其涉及提供一种使用 不同结构的纤维素和/或其变体分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法， 以快速简单地分离在植物中大量表达的蛋白质。

然而，本发明完成的技术目的并不限于上述目的，本领域普通技术 人员从以下的说明中应当清楚地理解本发明的其它目的。

技术方案

本发明的一方面在于提供一种分离含有纤维素结合域的蛋白质的方 法，其包括：

(a)蛋白质结合步骤，其中，混合含有蛋白质的植物提取物和纤维素；

(b)洗涤步骤，其中，除去未结合的蛋白质；和

(c)洗脱步骤，其中，洗脱与纤维素结合的蛋白质。

在本发明的一个实施方案中，纤维素可以是微晶纤维素或无定形纤 维素。

在本发明的另一个实施方案中，微晶纤维素的使用量可以是植物提 取物的0.5～2倍。

在本发明的还一实施方案中，无定形纤维素的使用量可以是植物提 取物的0.1～0.5倍。

在本发明的还一实施方案中，无定形纤维素可以通过以下方法制备， 该方法包括：(a)通过将微晶纤维素添加到40～75％的磷酸中并搅拌混合 物制备无定形纤维素；并且

(b)向无定形纤维素中添加500mM～1.5M的碳酸钠。

在本发明的还一实施方案中，含有纤维素结合域的蛋白质可能含有 由SEQ.ID.NO:2表示的纤维素结合域的氨基酸序列。

在本发明的还一实施方案中，在蛋白质的结合步骤中，可以使用含 有10～60mM醋酸钠、10～200mM氯化钠和0.1～3mM氯化钙的缓冲液。

在本发明的还一实施方案中，在洗涤步骤中，可以使用含有10～60 mM醋酸钠、10～200mM氯化钠、0.1～3mM氯化钙和0.05～0.2％的Triton  X-100的缓冲液。

在本发明的还一实施方案中，在洗脱步骤中，可以使用含有pH值 为7.5～10的10～60mM Tris-HCl缓冲液、10～200mM氯化钠、0.1～3mM 氯化钙和1～20％纤维二糖的缓冲液。

有益效果

根据本发明的分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法，由于纤维素 作为亲和基质使用，与常规亲和基质相比，制备方法能够以低成本实现， 并且在分离中使用的试剂的含量根据纤维素的种类可以降低。因此，可 显著降低分离蛋白质的成本，并能够分离大量蛋白质。此外，由于使用 了对于纤维素具有高亲和性的纤维素结合域，通过阻止蛋白质的非特异 性结合，可以从总的植物体的提取物中快速分离高纯度蛋白，且低浓度 的蛋白质也可以被分离，其中总的植物体的提取物中混合有各种蛋白质。

附图说明

图1示出了用于从植物提取物中分离和纯化蛋白质的无定形纤维素 的有效制备的图示。

图2示出了使用微晶纤维素分离的蛋白质的免疫印迹的结果。

图3示出了使用无定形纤维素分离的蛋白质的免疫印迹的结果。

图4示出了使用无定形纤维素分离的蛋白质，其在SDS-PAGE中通 过考马斯亮蓝染色进行鉴定。

具体实施方式

本发明提供了一种分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法，该方法 包括以下步骤：

(a)蛋白质结合步骤，其中，混合含有蛋白质的植物提取物和纤维素；

(b)洗涤步骤，其中，除去未结合的蛋白质；和

(c)洗脱步骤，其中，洗脱与纤维素结合的蛋白质。

经研究，本发明人找到了一种以低成本从植物体中快速分离大量高 纯度重组蛋白的方法，完成了本发明。也就是，在本发明的一个示例性 的实施方案中，值得指出的是通过使纤维素结合域(CBD)与编码靶蛋白 的基因的3’端结合来制备重组载体，该纤维素结合域由SEQ.ID.NO:1 的碱基序列或者SEQ.ID.NO:2的氨基酸序列组成，使用该重组载体制 备了产生靶蛋白的转基因植物体，并且使用微晶纤维素(MCC)和/或无 定形纤维素(AMC)分离靶蛋白(参见实施例1至3)。

如上所述，本发明人认识到使用纤维素，靶蛋白能够容易地从植物 体中洗脱，该植物体表达含有纤维素结合域的靶蛋白。

因此，本发明可以提供一种分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法。

更特别地，在本发明中，纤维素可以是微晶纤维素或无定形纤维素。 此处，微晶纤维素的使用量可以是植物提取物的0.5～2倍，优选地，与 植物提取物的使用量相同。无定形纤维素的使用量可以是植物提取物的 0.1～0.5倍，但是本发明不限于此，上述使用量可以根据条件，例如，靶 蛋白的表达程度进行调整。

此外，可以通过将微晶纤维素添加到40～75％的磷酸中并搅拌混合物 制备无定形纤维素，并向无定形纤维素中添加500mM～1.5M的碳酸钠， 但本发明不限于此。

在本发明中，含有纤维素结合域的靶蛋白可以是由SEQ.ID.NO:2 表示的纤维素结合域的氨基酸序列或与上述氨基酸序列具有基本上相同 活性的序列组成的重组蛋白。

此处，“基本上相同活性”意味着纤维素结合域的活性，并且可包 括氨基酸序列变体，其功能上与原始的序列相同，但是含有取代、缺失 或添加的部分。

在根据本发明的分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法中，可以使 用含有10～60mM醋酸钠(NaOAC)、10～200mM氯化钠(NaCl)和0.1～3 mM氯化钙(CaCl2)的缓冲液进行蛋白质结合步骤，优选地，缓冲液含有 50mM醋酸钠、50mM氯化钠和1mM氯化钙。

此外，可以使用含有10～60mM醋酸钠(NaOAC)、10～200mM氯化 钠(NaCl)、0.1～3mM氯化钙(CaCl2)和0.05～0.2％的Triton X-100的缓冲 液进行洗涤步骤，优选地，缓冲液含有50mM醋酸钠、50mM氯化钠、 1mM氯化钙和0.1％Triton X-100。

此外，此处可以使用含有pH值为7.5～10的10～60mM Tris-HCl缓 冲液、10～200mM的氯化钠(NaCl)、0.1～3mM的氯化钙(CaCl2)和1～20％ 纤维二糖的缓冲液进行洗脱步骤，优选地，缓冲液含有pH值为8.8的 50mM的Tris-HCl缓冲液、50mM氯化钠、1mM氯化钙和1％纤维 二糖。

本文使用的术语“靶蛋白(或蛋白质)”是指一种根据本发明的由 基因工程的方法制备的蛋白质，但本发明不特定地限于一种蛋白质。靶 蛋白可以包括能够用在商业应用中并需要大量制备的蛋白质。

下文中，为了帮助理解本发明，将对示例性的实施例进行描述。然 而，简单地提供了示例性的实施方案使得本发明更容易被理解，但是本 发明的范围不限于以下示例性的实施例。

具体实施例

实施例1.转基因植物体的制备

为了制备表达靶蛋白的转基因植物体，通过使纤维素结合域(CBD) 结合到编码靶蛋白(猪霍乱病毒糖蛋白gp55)的基因的3'端，将基因插 入到植物表达载体pCAMBIA 1300中制备重组载体，该纤维素结合域由 SEQ.ID.NO:1的碱基序列或者SEQ.ID.NO:2的氨基酸序列组成，将载 体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA-4404菌株中。此 外，通过使用农杆菌(Agrobacterium)菌株转化拟南芥(Arabidopsis  thaliana)生态型Col-1制备产生靶蛋白的转基因植物体，并且筛选产生 靶基因的转基因植物体，所述靶基因与纤维素结合域稳定结合。

实施例2.使用微晶纤维素分离蛋白质

为了使用微晶纤维素(MCC)分离蛋白质，通过向蒸馏水中加入2.5g 的微晶纤维素进行水合作用，将微晶纤维素水合物过柱以除去水分。此 外，将通过实施例1的方法制备的转基因植物体种植在土壤中，并使其 生长大约3周，从而获得除了根以外的植物体，然后将与微晶纤维素的 量相同的2.5g的植物体放入研钵中，并使用液氮粉碎。当粉碎的植物体 转移到新的管中后，加入提取缓冲液并混合，浓度为每克植物体5ml提 取缓冲液，加入0.5X蛋白酶抑制剂，然后通过涡旋混合。此外，植物体 通过超声处理10分钟使其均匀化，通过神奇滤布(miracloth)除去碎屑 得到植物匀浆。将获得的植物匀浆加入到含有微晶纤维素的柱中，使微 晶纤维素与植物匀浆混合，从而纤维素结合域结合到微晶纤维素上，植 物匀浆以100μl/min的速率添加至柱体。之后，使用15ml的含有0.1％ Triton X-100的洗涤缓冲液[50mM NaOAC(pH 5.2)、50mM NaCl、1mM  CaCl2]进行第一次洗涤，使用不含Triton X-100的洗涤缓冲液进行第二次 洗涤。通过以200μl/min的速率加入洗脱缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 8.8)、 50mM NaCl、1mM CaCl2、1％纤维二糖]进行蛋白质的分离。当分离蛋 白质时，注意不要使微晶纤维素变干。通过考马斯亮蓝染色鉴定分离的 蛋白质，使用与纤维素结合域结合的抗体进行免疫印迹。结果如图2所 示。

如图2所示，确定分离了具有靶蛋白大小(660kDa)的蛋白质，其 上结合有纤维素结合域。此外，证实了在洗涤步骤(W1至W3)中，与 纤维素结合的蛋白质很少被洗脱，但是在洗脱步骤中(E1至E3)，在第 三次洗脱中，蛋白质仍然被分离了。

实施例3.使用无定形纤维素分离蛋白质

<3-1>无定形纤维素的制备

为了使用无定形纤维素(AMC)分离蛋白质，使用磷酸在4℃处理微 晶纤维素改变纤维素的结晶型。首先，通过使微晶纤维素与5％、10％、 40％和80％的磷酸反应制备无定形纤维素，每个反应进行30分钟，并 且使用显微镜观察制备的无定形纤维素。结果如图1所示。

如图1所示，可以确定在使用80％的磷酸处理制备的无定形纤维素 中，当用磷酸处理后，晶体结构消失，同样可以确定的是，当无定形纤 维素填充柱时，加入蒸馏水，蒸馏水没有渗透无定形纤维素。同样可以 确定的是，在用40％的磷酸处理无定形纤维素30分钟时，晶体结构消 失。根据上述结果，可以确定的是，当40％或更多，或80％或更多磷酸 作为处理剂使用时，制备了合适的无定形纤维素，并且用于分离蛋白质。 基于此，在以下的实施例中，通过调整磷酸的终浓度使其达到60％来制 备无定形纤维素。

将2g的微晶纤维素加入到6ml的蒸馏水中，并搅拌2～3分钟，缓 慢加入磷酸，至终浓度达到60％，搅拌至完全混合，并额外搅拌30分钟。 将搅拌的溶液分别置于两个不同的管中，向每个管中加入20ml的蒸馏 水，与溶液混合，获得的溶液离心(14,000rpm，4℃，10分钟)去上清。 向结晶的纤维素中加入2ml的1M Na2CO3，通过涡旋混合，并离心 (14,000rpm，4℃，10分钟)，获得的混合液再次去上清，进行以上过程 两次以完全去掉上清液，将1ml的1M碳酸钠和20ml蒸馏水加入到纤维 素中并通过涡旋混合。此外，再次加入蒸馏水以调整蒸馏水的量，使终 体积达到200ml，并在4℃下储存。确定的是该方法制备的无定形纤维 素具有稳定的pH 6～9。

<3-2>使用无定形纤维素分离蛋白质

为了使用由实施例3-1描述的方法制备的无定形纤维素(AMC)分离 蛋白质，将柱体填充0.5g(50ml)的无定形纤维素。此外，将通过与实施 例2中描述的相同的方法制备的植物匀浆以100μl/min的速率加入到填 充有无定形纤维素的柱中，并充分混合。之后，以1ml/min的速率加入 含有0.1％Triton X-100的4ml的洗涤缓冲液[50mM NaOAC(pH 5.2)、 50mM NaCl、1mM CaCl2]，以进行第一次洗涤，通过加入不含Triton  X-100的洗涤缓冲液进行第二次洗涤。此外，通过以200μl/min的速率加 入洗脱缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 8.8)、50mM NaCl、1mM CaCl21％ 纤维二糖]分离蛋白质。在蛋白质的分离过程中，注意不要干燥无定形纤 维素。通过使用与纤维素结合域结合的抗体进行免疫印迹鉴定分离的蛋 白质。结果如图3所示。此外，通过考马斯亮蓝染色在SDS-page上鉴定 分离的蛋白质。结果如图4所示。

如图3和4所示，确定分离了具有靶蛋白大小(660kDa)的蛋白质， 其上结合有纤维素结合域，与当使用微晶纤维素分离的蛋白质的结果一 样。此外，在洗涤步骤(W1至W3)中，与纤维素结合的蛋白质很少被 洗脱，在洗脱步骤(E1至E2)中，在第一次洗脱中，大量蛋白质被分离， 并且洗脱的蛋白质的量在第二次洗脱中降低。根据结果，可以确定的是 当使用无定形纤维素时可以缩短洗脱时间。

因此，根据本发明的使用纤维素分离蛋白质的方法，当使用无定形 纤维素时，蛋白质的量几乎与使用微晶纤维素时相同，使用无定形纤维 素时，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的体积量降低1/5，大约比常规使用量少 1/5，最后，分离蛋白质的时间缩短1/5。这意味着，当分离大量蛋白质 时，由于降低了此处使用的样本的数量并缩短了分离时间，可以最大化 的提高工作效率。

上述说明用于解释本发明，本领域技术人员应当理解的是不改变本 发明的技术精神或实质性的特点，本发明可以容易地被修改为不同的类 型。因此，应当理解的是上述实施例在所有方面都是示例性的而非限制 性实施例。

根据本发明的蛋白质的分离方法，可以以低成本快速有效地从植物 体中分离大量高纯度的重组蛋白，由此本发明可以应用在各种工业领域 中。

<110>    巴伊沃爱普有限公司

 

<120>    使用纤维素和纤维素结合域从植物中分离并纯化蛋白质的方法

 

<130>    DFP15KR2383

 

<150>    KR 10-2012-0110897

<151>    2012-10-05

 

<160>    2

 

<170>    KopatentIn 2.0

 

<210>    1

<211>    426

<212>    DNA

<213>    梭状芽孢杆菌（Clostridium stercorarium）-纤维素结合域（CBD）氨基酸序列

 

<400>    1

cgaagttcac cagtgcctgc acctggtgat aacacaagag acgcatattc tatcattcag         60

 

gccgaggatt atgacagcag ttatggtccc aaccttcaaa tctttagctt accaggtggt        120

 

ggcagcgcca ttggctatat tgaaaatggt tattccacta cctataaaaa tattgatttt        180

 

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acttct                                                                   426

  

<210>    2

<211>    142

<212>    PRT

<213>   梭状芽孢杆菌（Clostridium stercorarium）-纤维素结合域（CBD）氨基酸序列

 

<400>    2

Arg Ser Ser Pro Val Pro Ala Pro Gly Asp Asn Thr Arg Asp Ala Tyr

  1               5                  10                  15

 

Ser Ile Ile Gln Ala Glu Asp Tyr Asp Ser Ser Tyr Gly Pro Asn Leu

             20                  25                  30

 

Gln Ile Phe Ser Leu Pro Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gly Tyr Ile Glu

         35                  40                  45

 

Asn Gly Tyr Ser Thr Thr Tyr Lys Asn Ile Asp Phe Gly Asp Gly Ala

     50                  55                  60

 

Thr Ser Val Thr Ala Arg Val Ala Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Gln

 65                  70                  75                  80

 

Val Arg Leu Gly Ser Pro Ser Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ile Tyr Val

                 85                  90                  95

 

Gly Ser Thr Gly Ser Phe Asp Thr Tyr Arg Asp Val Ser Ala Thr Ile

            100                 105                 110

 

Ser Asn Thr Ala Gly Val Lys Asp Ile Val Leu Val Phe Ser Gly Pro

        115                 120                 125

 

Val Asn Val Asp Trp Phe Val Phe Ser Lys Ser Gly Thr Ser

    130                 135                 140