纤维素MONOLITH材料的制备及其在蛋白质药物分离纯化中的应用

摘要

近些年来，利用重组DNA技术得到的蛋白质药物克服了其来源困难的关键性问题而得到了飞速的发展，由于活性高、作用位点专一、毒副作用小和生物功能明确等特点，重组蛋白质药物在临床治疗中常用于治疗癌症、传染性疾病以及自身免疫性疾病等。但在重组蛋白质药物的制备过程中，其下游分离纯化技术由于存在着分离效率低、过程复杂和成本耗费大等问题成为目前生物技术产业开发中的一个瓶颈。因此，本论文的研究内容是构建一个新型的固定相材料-功能型纤维素 MONOLITH （ Ce MONOLITH ）应用于固定金属离子螯合亲和色谱（IMAC）中来实现重组蛋白质药物的高效快速分离和提纯。主要研究内容如下： 1、Ce MONOLITH材料的制备：首先以醋酸纤维素（CA）作为起始原料出发，选用了一种新技术—热引发相分离（TIPS）来制备 CA MONOLITH，再结合后期水解的方法得到Ce MONOLITH，通过FT-IR、SEM和N2吸附/解吸等一系列手段对得到的材料进行表征。在CA MONOLITH材料的制备过程中，考察了TIPS制备条件（如CA分子量、CA浓度以及良溶剂和贫溶剂的比例）对CA MONOLITH 内部多孔形态的影响，从而筛选出最佳制备条件：CA 的分子量为5.0×104，CA的浓度为200 mg/ml，1-己醇/DMF的混合比为1.5/1（v/v），在此条件下得到了具有大孔3.6μm和介孔7.8 nm多层次孔洞结构的CA MONOLITH材料；在Ce MONOLITH的制备中，对CA MONOLITH的水解时间进行了考察，结果表明在3 h下得到的Ce MONOLOTH水解程度最为充分并且维持了原有的多层次孔洞结构。 2、Ce MONOLITH材料的表面化学修饰和功能化：利用Ce MONOLITH表面的羟基与酸酐类化合物EDTAD和NTAA发生酯化反应，然后再以流通方式螯合吸附上金属离子 Mn+得到了功能型 Ce MONOLITH （ Mn+-EDTA/NTA-Ce MONOLITH）。通过 FT-IR、SEM 和元素分析考察了酯化反应温度、反应时间对Ce MONOLITH内部形态以及配体引入率的影响，筛选出了最佳反应温度和时间分别为50℃和24 h，在此条件下引入EDTA和NTA基团的量分别为48.94和 78.57 mmol/g；然后，以 EDTA-Ce MONOLITH 为研究对象，通过 AAS 和SDS-PAGE分别考察了其对不同Mn+（Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+和Fe3+）的螯合能力及螯合上Mn+之后的MONOLITH对E.coli裂解液中重组蛋白His-tag TPL的分离纯化性能，结果表明最佳螯合金属离子为 Ni2+，螯合有 Ni2+的 EDTA-Ce MONOLITH对His-tag TPL具有专一、高效的分离效果。 3、功能型Ce MONOLITH材料对His-tag蛋白质药物的分离纯化：首先利用Ni2+-EDTA/NTA-Ce MONOLITH中螯合吸附的Ni2+与His-tag之间的特异亲和作用来分离纯化His-tag HPL，通过SDS-PAGE、HPLC、CD、TLC和UV等一系列分析手段考察MONOLITH的最大亲和效率以及分离后His-tag TPL蛋白的纯度、构象和活性，实验结果表明：Ni2+-EDTA/NTA-Ce MONOLITH对His-tag TPL最大亲和吸附量分别为76.92和64.57 mg/g，并且分离后的His-tag TPL二级构象以及活性没有发生变化。然后进一步考察了Ni2+-EDTA/NTA-Ce MONOLITH对E.coli裂解液中表达的His-tag TPL、His-tag BAFF和His-tag IL-lra的分离纯化性能。通过SDS-PAGE、UV等手段表明了Ni2+-EDTA-Ce MONOLITH具有更加专一、高效的亲和吸附效率，对3种蛋白质的吸附量分别为74.51、64.92和24.17 mg/g。最后，考察了MONOLITH材料的重复利用性能，结果表明在5次重复使用后 Ni2+-EDTA/NTA-Ce MONOLITH 材料的亲和吸附量分别是原吸附量的94.37%和 86.35%，仍然保持较高的蛋白质分离纯化能力，具有极为优越的重复利用性能。

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