可多次交换的无标记定点整合转基因系统及其应用

摘要

提供了可多次交换的无标记定点整合转基因系统及其应用，其中该转基因系统包括：第一构建体，所述第一构建体为TALEN载体，所述TALEN载体识别并剪切友好位点序列；第二构建体，所述第二构建体包含左同源臂、右同源臂、筛选标记表达框和第一整合酶识别序列loxp和lox2272；第三构建体，所述第三构建体包含目的外源基因和第二整合酶识别序列loxp’和lox2272’；以及第四构建体，所述第四构建体包含整合酶基因Cre表达框。利用该转基因系统能够简单、快捷、高效地实现目的外源基因在动物基因组上的定点插入，且制备获得的转基因动物细胞不含任何抗性标记基因，制备周期短、安全可靠，目的外源基因能够稳定遗传到下一代。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及可多次交换的无标记定点整合转基因系统及其应用，更具体地，涉及转基因系统、转基因动物细胞及其制备方法。

背景技术

非人转基因动物能够作为筛选和鉴定药物的理想模型，从而可以用于研究基因功能，为人类探讨疾病发病机理，寻求有效治疗途径，也可以用于动物遗传品质改良的研究。转基因动物研究蕴含着巨大的经济价值，具有非常广阔的应用前景，目前在国际上成为生物工程的投资热点之一，也推动了转基因技术研究的发展。

当前，动物转基因技术应用十分广泛，多个物种的转基因个体制备已较为成熟，用于基础研究、生物医学以及农业应用等方面的各种转基因品系也日益丰富，特别是品系繁多的转基因小鼠，为生物医药和基因生理功能研究提供了坚实基础。尽管如此，动物转基因技术的应用尚存在效率、安全以及稳定性的问题，特别是家畜动物转基因，效率低下、制备周期长、遗传不稳定、品系培育周期长、代价高。

因而，现阶段的动物转基因技术仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种简单、快捷、高效的无标记定点整合转基因技术。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

发明人发现，目前的动物转基因技术，效率低下、制备周期长、遗传不稳定、品系培育周期长、代价高，具体原因主要有：一方面，表达、遗传不稳定，难以获得表型明显的转基因动物；另一方面，受抗性基因或其他标记因素的影响，即使制备出表型明显的转基因动物，仍然难以推广。因而，发明人认为，如果以无标记、定点整合技术为基础制备转基因动物，不仅可以提高转基因效率和遗传的稳定性，为今后品系的培育奠定坚实的基础，同时，也有助于消除公众恐慌，加快转基因技术及其产品的产业化进程。因此，不论从社会需求还是经济需求方面考虑，无标记定点整合转基因技术的研究都有着重大的价值。

另外，整合酶介导的定点整合外源基因系统的发展过程中，科学家陆续发现了哺乳动物基因组的“友好”位点，即可使外源基因在基因组中高效表达并稳定遗传的位点。基因组的友好位点主要有四类：逆转录病毒/慢病毒整合位点，腺病毒整合位点，转座子位点，ΦC31整合酶识别的假attp位点。其中，ROSA26位点起源于逆转录病毒转小鼠ES细胞的基因捕获扫描，插入该位点的基因可广泛表达于胚胎发育的各个时期以及各种组织，是在小鼠发现的第一个高效表达外源基因的友好位点。自发现以来，该位点整合表达过多种基因，现在已成为小鼠ES细胞系中标准的转基因位点。在人的ES细胞系，Irion等根据小鼠ROSA26同源性也发现了人的ROSA26位点，并用无启动子RFP验证了该位点的有效性。家畜动物有些物种基因组分析结果也已经确定ROSA26位点，但至今仍无任何该位点整合基因的报道。

而本发明整合TALEN、RMCE等多项技术，能够实现外源基因在动物尤其是家畜动物基因组上的定点插入，且不含任何抗性标记基因，可以稳定遗传到下一代，是安全、高效、稳定遗传的转基因动物制备技术。具体地：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种转基因系统。根据本发明的实施例，该系统包括：第一构建体，所述第一构建体为TALEN载体，所述TALEN载体识别并剪切友好位点序列；第二构建体，所述第二构建体包含左同源臂、右同源臂、筛选标记表达框和第一整合酶识别序列loxp和lox2272，所述筛选标记表达框位于所述左同源臂和所述右同源臂之间，所述loxp位于所述左同源臂下游，所述lox2272位于所述右同源臂上游；第三构建体，所述第三构建体包含目的外源基因和第二整合酶识别序列loxp’和lox2272’，所述目的外源基因位于所述loxp’和所述lox2272’之间；以及第四构建体，所述第四构建体包含整合酶基因Cre表达框。

发明人惊奇地发现，利用本发明的转基因系统能够简单、快捷、高效地实现目的外源基因在动物尤其是家畜动物基因组上的定点插入，且制备获得的转基因动物细胞甚至转基因动物个体不含任何抗性标记基因，制备周期短、安全可靠，目的外源基因能够稳定遗传到下一代。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备转基因动物细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的转基因系统进行转基因。由此，利用该方法能够简单、快捷、高效地实现目的外源基因在动物尤其是家畜动物基因组上的定点插入，有效地制备获得不含任何抗性标记基因的转基因动物细胞甚至转基因动物个体，且该方法操作简单、制备周期短、可重复性好，安全高效，目的外源基因能够稳定遗传到下一代，进而用于品系培育或动物模型培养时，所需周期短、代价小。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转基因动物细胞。根据本发明的实施例，该转基因动物细胞是通过前面所述的制备转基因动物细胞的方法制备获得的。根据本发明的实施例，该转基因动物细胞不含任何抗性标记基因，安全高效，并且其所包含的外源基因能够稳定遗传，因而能够有效用于进行品系培育或动物模型培养。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明一个实施例的制备转基因动物细胞的方法的流程示意图；

图2是根据本发明一个实施例的第一构建体TALEN1载体和TALAN2载体的结构示意图，其中RVDs是TALEN的模块排列顺序；

图3是根据本发明一个实施例的第一构建体TALEN1载体和TALEN2载体的电泳检测结果图，其中，

图3a是TALEN载体箘液PCR结果，

图3b是第一构建体的质粒和酶切鉴定电泳图；

图4是根据本发明一个实施例的第一构建体的活性鉴定结果；

图5是根据本发明一个实施例的第二构建体的结构示意图；

图6是根据本发明一个实施例的pR26打靶载体的各元件PCR扩增产物电泳结果，以及终载体质粒和酶切鉴定结果，其中，

图6a是打靶载体构建所需元件的PCR扩增结果，

图6b是打靶载体质粒和NheI酶切鉴定结果；

图7是根据本发明一个实施例的pR26打靶细胞克隆鉴定结果；

图8是根据本发明一个实施例的pR26打靶细胞克隆鉴定结果；

图9是根据本发明一个实施例的第三构建体的结构示意图；

图10是根据本发明一个实施例的第三构建体构建过程中的电泳检测结果图，其中，

图10a是骨架载体loxp-mcs-lox2272-T菌液PCR结果，

图10b是骨架载体酶切及目的片段酶切结果，

图10c是第三构建体酶切鉴定结果；

图11是根据本发明一个实施例的第四构建体的结构示意图；

图12是根据本发明一个实施例的第四构建体构建过程中的电泳检测结果图；以及

图13是根据本发明一个实施例的EGFP定点整合的PCR验证结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

首先，需要说明的是，在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列（即目的外源基因）转入宿主细胞中，使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

转基因系统

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种转基因系统。根据本发明的实施例，该系统包括：第一构建体、第二构建体、第三构建体和第四构建体。发明人惊奇地发现，利用本发明的转基因系统能够简单、快捷、高效地实现目的外源基因在动物尤其是家畜动物基因组上的定点插入，并且外源基因能够安全高效表达，并稳定遗传，且制备转基因动物细胞的周期短、安全可靠，制备获得的转基因动物细胞甚至转基因动物个体不含任何抗性标记基因。

为了方面理解，下面将结合附图对四种构建体进行详细描述。

根据本发明的实施例，所述第一构建体为TALEN载体，所述TALEN载体识别并剪切友好位点序列。根据本发明的一些实施例，所述TALEN载体识别所述友好位点序列上的特异序列。其中，需要说明的是，TALEN由特异识别DNA序列的TALE（transcriptionactivator-like effector）部分和核酸酶fokI组成。TALE是由33-35个氨基酸残基组成的重复模块的第12和13位氨基酸残基对应识别DNA的四种核苷酸（称为RVD），一般TALE的重复模块有15-22个，可识别15-22个核苷酸，根据已知核苷酸序列可有序组装TALE的重复模块，构建识别特定核苷酸序列的TALEN载体。非特异性核酸酶FokI以二聚体形式进行DNA剪切。因此有效识别剪切的TALEN载体是成对作用的。在TALEs所识别的两条DNA序列之间有12-16bp的spacer序列作为FokI剪切位点。

进而，根据本发明一些具体示例，参照图2，本发明的第一构建体即TALEN载体包括TALEN1载体和TALEN2载体，所述TALEN1载体包括第一TALE蛋白和第一核酸酶fokI，所述TALEN2载体包括第二TALE蛋白和第二核酸酶fokI，所述第一TALE蛋白识别所述特异序列的第一子序列，所述第二TALE蛋白识别所述特异序列的第二子序列。并且，所述TALEN1载体与所述TALEN2载体成对作用，以便使所述第一核酸酶fokI与所述第二核酸酶fokI以二聚体形式进行DNA剪切，所述第一子序列与所述第二子序列之间的间隔序列为所述DNA剪切的剪切位点。

根据本发明的另一些实施例，所述友好位点为ROSA26（有时也称为“pR26位点”），所述特异序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：TGCCGTAATGCTAATAGCTTCCAAACTAGTGTCTCTGTCTCCAGTATCTGA(SEQ ID NO:1)，所述第一子序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：TGCCGTAATGCTAATAGC(SEQ ID NO:4)，所述第二子序列与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列（CTGTCTCCAGTATCTGA(SEQ ID NO:5)）反向互补，所述第一TALE蛋白的模块排列顺序：NN-HD-HD-NN-NG-NI-NI-NN-HD-NG-NI-NI-NG-NI-NN-HD，所述第二TALE蛋白的模块排列顺序：HD-NI-NN-NI-NG-NI-HD-NG-NN-NN-NI-NN-NI-HD-NI-NN。即第一构建体是表达识别并剪切pR26位点的TALEN蛋白载体。

根据本发明的实施例，参照图5，所述第二构建体包含左同源臂、右同源臂、筛选标记表达框和第一整合酶识别序列loxp和lox2272，所述筛选标记表达框位于所述左同源臂和所述右同源臂之间，所述loxp位于所述左同源臂下游，所述lox2272位于所述右同源臂上游。其中，所述整合酶即为Cre酶表达框。

根据本发明的实施例，所述左同源臂为所述友好位点向左延伸约800bp的序列，所述右同源臂为所述友好位点向右延伸约800bp的序列。根据本发明的一些实施例，所述友好位点为ROSA26，所述左同源臂具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列（长829bp）：

GTCAGTTTGCTCCTTCTCGATTATGGGCGGGATTCTTTTGCCCTGGCTTAACCTGATTCTTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGATTGAGCAGGTGTACGAGGACGAGCCCAATTTCTCTATATTCCCACAGTCTTGAGTTTGTGTCACAAAATAATTATAGTGGGGTGGAGATGGGAAATGAGTCCAGGCAACACCTAAGCCTGATTTTATGCATTGAGACTGCGTGTTATTACTAAAGATCTTTGTGTCGCAATTTCCTGATGAAGGGAGATAGGTTAAAAAGCACGGATCTACTGAGTTTTACAGTCATCCCATTTGTAGACTTTTGCTACACCACCAAAGTATAGCATCTGAGATTAAATATTAATCTCCAAACCTTAGGCCCCCTCACTTGCATCCTTACGGTCAGATAACTCTCACTCATACTTTAAGCCCATTTTGTTTGTTGTACTTGCTCATCCAGTCCCAGACATAGCATTGGCTTTCTCCTCACCTGTTTTAGGTAGCCAGCAAGTCATGAAATCAGATAAGTTCCACCACCAATTAACACTACCCATCTTGAGCATAGGCCCAACAGTGCATTTATTCCTCATTTACTGATGTTCGTGAATATTTACCTTGATTTTCATTTTTTTCTTTTTCTTAAGCTGGGATTTTACTCCTGACCCTATTCACAGTCAGATGATCTTGACTACCACTGCGATTGGACCTGAGGTTCAGCAATACTCCCCTTTATGTCTTTTGAATACTTTTCAATAAATCTGTTTGTATTTTCATTAGTTAGTAACTGAGCTCGGTTGCCGTAATGCTAATAGCTTCCAAACTAGTGTC(SEQ IDNO:2)，

所述右同源臂具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列（长790bp）：

TCTGTCTCCAGTATCTGATAAATCTTAGGTGTTGCTGGGACAGTTGTCCTAAAATTAAGATAAAGCATGAAAATAACTGACACAACTCCATTACTGGCTCCTAACTACTTAAACAATGCATTCTATCATCACAAATGTGAAAAAGGAGTTCCCTCAGTGGACTAACCTTATCTTTTCTCAACACCTTTTTCTTTGCACAATTTTCCACACATGCCTACAAAAAGTACTTTTCTGCTCAAGTCACACTGAGTTGATTGCTATTTACCGAAATCAAAGTAACATTATCAGATCTCTGTAGGGTGGTTCCCTCTGGAATGCTACCCTCCATAGTCCTTACCCTTCAAGTAAAGAGCATGAAGACTGAAATATCTCCTCTGTGATCTGTCATCCTTTAAGCCAGAATCCCCCATAAAAAAGTTAGTATTGCTTTCTCCTGACCCCATAGCAGGTTGAATCATAGCACTTATCAGGTTGTTGTCATTGCTTGCTTAAATTCTCCTAACTATTTGGAGCTTCTTGAGGGCACAGGTTCTTGTTGAGTCTTGTACCTAAGCACCTAGTATAGTCCTTGATGTCTAGCCAACCCTAAATAAAATGCAGTGAGTGACATGTAGATGTCTTTATAAGGTTTGATAGGTTGGTCTCTCAAATAGTTCTTTTGTATGTTTGGTAGTGCTCTAGATTAGCACTGGCCAGTATAACTCTGATGATGGAAATGTTCTATAGCTATGCTGTCTAATATGGTAGTCACTACTAACATATGTTACTGTTGAGCCTTGGAAGTGCTAGC(SEQ ID NO:3)。

根据本发明实施例，参照图5，所述筛选标记表达框包括第一启动子、负筛选标记基因、药物筛选标记基因和polyA序列，其中所述第一启动子与所述负筛选标记基因、所述药物筛选标记基因和所述polyA序列可操作地连接。其中，基于药物筛选标记基因，可以利用相应的药物筛选获得定点插入了筛选标记表达框的细胞克隆，进而制备祖细胞系，而loxp和lox2272在整合酶的作用下可以与第三构建体中loxp’和lox2272’交换两个整合酶识别位点之间的基因，即将筛选标记表达框交换为目的外源基因，而负筛选标记基因则在交换目的外源基因时，能够对未实现交换（即仍然携带负筛选标记基因）的细胞进行杀伤，从而筛选到交换了目的外源基因的细胞克隆。根据本发明的一些具体示例，所述第一启动子为PGK启动子，所述负筛选标记基因为胸苷激酶蛋白，所述药物筛选标记基因为新霉素筛选标记基因。

根据本发明的一些实施例，参照图5，所述第二构建体可以进一步包含同源重组自杀基因DTA，所述同源重组自杀基因DTA位于所述右同源臂下游。由此，基于该同源重组自杀基因DTA，能够在无药物的情况下杀死随机整合的第二构建体的细胞，保证获得的祖细胞系仅有同源重组发生。

需要说明的是，同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。本发明将需药型正负筛选标记构建到同源区内，而无需药物型负筛选标记构建在同源区以外。所有筛选标记在随机整合和同源重组中均可正常表达。根据本发明的一个实施例，在本发明的第二构建体中，需药型正筛选标记新霉素基因（Neo）对G418有抗性，可以进行重组细胞的筛选；而无需药物型负筛选标记基因DTA在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端（如图5所示），在同源重组时，DTA基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留，引起细胞自杀，因而可以排除随机整合的细胞株；需药型负筛选标记基因胸腺嘧啶激酶基因（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，当祖细胞系中loxp和lox2272和第三构建体发生整合时，需药型正负筛选将被替换掉，从而对GANC具有抗性，不会引起细胞死亡，最终作为外源基因表达框定点整合的筛选标记。

由此，将第一构建体和第二构建体共转染能有效地在SEQ ID NO:1处插入筛选标记表达框。

根据本发明实施例，参照图9，所述第三构建体包含目的外源基因和第二整合酶识别序列loxp’和lox2272’，所述目的外源基因位于所述loxp’和所述lox2272’之间。由此，在整合酶的作用下，第二构建体中的loxp和lox2272可以与第三构建体中loxp’和lox2272’交换两个整合酶识别位点之间的基因，即将筛选标记表达框交换为目的外源基因。其中，所述整合酶为Cre酶。根据本发明的实施例，所述目的外源基因的种类不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，所述目的外源基因为EGFP表达框。

根据本发明的实施例，所述第三构建体进一步包含第二启动子，所述第二启动子位于所述loxp’和所述lox2272’之间且与所述目的外源基因可操作地连接，优选地，所述第二启动子为CMV启动子。

根据本发明实施例，所述第四构建体包含整合酶基因Cre表达框。根据本发明的实施例，所述第四构建体进一步包含第三启动子，所述第三启动子与所述整合酶基因Cre表达框可操作地连接，优选地，参照图11，所述第三启动子为CMV启动子。由此，第四构建体进入细胞后可强表达Cre，以介导目的外源基因和筛选标记表达框的交换，但不会引入其他标记基因。

由此，利用将第一构建体和第二构建体共转染动物细胞，在动物友好位点定点插入正负筛选标记（标记两侧包含整合酶识别序列），并构建祖细胞系，然后，利用将第三构建体和第四构建体共转染祖细胞系，即将目的外源基因和整合酶共转染祖细胞系，使外源基因与筛选标记进行交换，从而有效实现定点无标记整合。其中，在第四构建体表达的Cre酶介导下，第三构建体的loxp’和所述lox2272’与祖细胞系中的loxp和lox2272交换，从而实现目的外源基因和祖细胞系中的药物筛选标记基因的交换。

转基因动物细胞及其制备方法

进而，根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备转基因动物细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的转基因系统进行转基因。由此，利用该方法能够简单、快捷、高效地实现目的外源基因在动物尤其是家畜动物基因组上的定点插入，有效地制备获得不含任何抗性标记基因的转基因动物细胞甚至转基因动物个体，且该方法操作简单、制备周期短、可重复性好，安全高效，目的外源基因能够稳定遗传到下一代，进而用于品系培育或动物模型培养时，所需周期短、代价小。

根据本发明的实施例，本发明的制备转基因动物细胞的方法进一步包括：

首先，利用所述第一构建体和所述第二构建体对所述动物细胞进行第一共转染，以便获得经过第一共转染的动物细胞。根据本发明的另一些实施例，所述第一构建体和所述第二构建体的转染比例为3-8：1，优选5：1。

其次，将经过第一共转染的动物细胞进行第一筛选，以便获得预备动物细胞。根据本发明的实施例，利用第二构建体中携带的药物筛选标记基因相应的药物进行第一筛选。根据本发明的一些具体示例，当所述药物筛选标记基因为新霉素筛选标记基因时，利用选自G418进行所述第一筛选。由此，能够有效筛选获得具有G418抗性的阳性克隆，所述阳性克隆即为基因组有效整合了筛选标记基因的预备动物细胞。

接着，通过手工克隆的方法，利用所述预备动物细胞建立祖细胞系。根据本发明的实施例，利用所述预备动物细胞建立所述祖细胞系可以进一步包括：从所述预备动物细胞中提取细胞核；将所述细胞核引入所述动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞；将所述融合卵母细胞进行培养，以便获得囊胚；将所述囊胚移植至受体动物进行发育；以及取发育33-35天的动物胎儿建立祖细胞系。由此，能够有效获得祖细胞系，进而利用第三构建体和第四构建体共转染该祖细胞系后，能够使目的外源基因与筛选标记表达框进行交换，从而有效实现定点无标记整合。其中，在第四构建体表达的Cre酶介导下，第三构建体的loxp’和所述lox2272’与祖细胞系中的loxp和lox2272交换，从而实现目的外源基因和祖细胞系中的筛选标记表达框交换。根据本发明的实施例，所述动物细胞为非人胎儿成纤维细胞。由此，能够有效提高目的外源基因整合表达和稳定遗传的效率。根据本发明的另一些，可以在建立获得祖细胞系后，利用丙氧鸟苷对基因组整合了负筛选标记基因胸腺嘧啶激酶基因（TK）的祖细胞系进行丙氧鸟苷浓度梯度筛选，以便确定最适的丙氧鸟苷致死浓度，进而作为所述第二筛选使用的丙氧鸟苷浓度。

接下来，利用所述第三构建体和所述第四构建体对所述祖细胞系进行第二共转染，以便获得经过第二共转染的细胞系。由此，基于第四构建体表达的Cre酶的介导，第三构建体的loxp’和所述lox2272’与祖细胞系中的loxp和lox2272交换，从而实现外源基因和祖细胞系中的筛选标记交换。根据本发明的实施例，利用核转染法进行所述第一共转染和所述第二共转染。根据本发明的实施例，所述第三构建体和所述第四构建体的转染比例为1：3-8，优选1:5。由此，能够有效提供外源基因与筛选标记基因的交换效率，进而有效提高外源基因整合入宿主基因组的效率。

然后，将经过第二共转染的细胞系进行第二筛选，以便获得所述转基因动物细胞。根据本发明的实施例，可以利用第二构建体中携带的负筛选标记基因相应的药物进行第二筛选。根据本发明的一些具体示例，当所述负筛选标记基因为TK时，可以利用丙氧鸟苷进行所述第二筛选。由此，能够有效杀死未发生Cre酶介导的表达框交换的细胞，进而筛选得到发生外源表达框整合的细胞系。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转基因动物细胞。根据本发明的实施例，该转基因动物细胞是通过前面所述的制备转基因动物细胞的方法制备获得的。根据本发明的实施例，该转基因动物细胞不含任何抗性标记基因，安全高效，并且其所包含的外源基因能够稳定遗传，因而能够有效用于进行品系培育或动物模型培养。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

一般方法：

图1显示了实施例中制备转基因动物细胞的一般方法，即：

（1）构建识别pR26位点的TALEN载体（即第一构建体）和pR26打靶载体（即第二构建体）；

（2）第一构建体和第二构建体共转染胎儿成纤维细胞，新霉素筛选得到重组细胞系；

（3）手工克隆，移植后取孕期35天胎儿建立master成纤维细胞系；

（4）构建外源基因表达载体和Cre表达载体，即第三构建体和第四构建体；

（5）第三构建体和第四构建体共转染master成纤维细胞系，筛选获得无标记定点插入外源基因细胞系。

实施例1识别pR26位点TALEN载体（第一构建体）构建及活性检测

分析pR26位点序列，选择SEQ ID NO:1作为TALEN载体识别剪切序列。其中TALEN1识别TGCCGTAATGCTAATAGC(SEQ ID NO:4)，即组装的TALEN1模块顺序为NN-HD-HD-NN-NG-NI-NI-NN-HD-NG-NI-NI-NG-NI-NN-HD。

TALEN2识别CTGTCTCCAGTATCTGA(SEQ ID NO:5)的反向互补序列，组装TALEN2的模块顺序为HD-NI-NN-NI-NG-NI-HD-NG-NN-NN-NI-NN-NIHD-NI-NN。

本实施例的TALEN表达骨架载体按照以下步骤进行改造：将商业载体pcDNA3.1（-）上的CMV-MCS-BGPA序列扩增下来连接到T载体上，构建CMV-T。合成TALE-fokI序列，其中TALE蛋白合成N段456个核苷酸（翻译152个氨基酸残基），C端189个核苷酸（翻译63个氨基酸残基），fokI根据文献突变3个氨基酸残基成ELD和KKR，故TALEN1和TALEN2的核酸酶是异源二聚体活性。将合成的TALE-fokI序列用XhoI和AflII酶切连接到CMV-T上，构建TAL-ELD和TAL-KKR骨架载体。

将组装的模块连接到TAL-ELD和TAL-KKR上，完成TALEN1和TALEN2的构建，其中，第一构建体TALEN1和TALAN2的结构示意图见图2，其中RVDs是TALEN的模块排列顺序。然后进行PCR、电泳检测，TALEN1和TALEN2的检测目的条带大小为3k，终载体质粒大小为7k，XhoI和AflII双酶切条带大小为3k和4k。图3为TALEN1载体和TALEN2载体的电泳检测结果图。其中，图3a是TALEN载体箘液PCR结果：TALEN1和TALEN2各6个克隆，PCR条带大小为3k；图3b是第一构建体的质粒和酶切鉴定电泳图，其中图3b中“A+X”表示Aflll+Xhol酶切，“P”表示质粒条带，质粒大小为7k，酶切目的条带为3k和4k。

TALEN1和TALEN2识别序列之间的spacer为TTCCAAACTAGTGTCT，是核酸酶FokI的剪切位点，其中ACTAGT是SpeI限制性内切酶的识别位点。活性检测的原理是，TALENs有活性会改变spacer序列，有可能使SpeI的识别序列发生改变，跟阴性对照相比，经过SpeI酶切的该区域PCR产物将有未切开的片段。载体构建完成后，将TALEN1和TALEN2载体共转染PK15细胞系，72小时后提取细胞DNA。PCR之后，SpeI酶切检测。图4是第一构建体的活性鉴定结果。图4显示了转染TALENs的细胞DNA有未酶切片段（约300bp），而阴性对照则完全切割（约150bp，两个片段大小相近，电泳条带区分不明显），表明构建的TALENs有剪切活性。

其中，TALEN载体构建PCR鉴定引物序列如下：

pTAL-F:ttggcgtcggcaaacagtgg(SEQ ID NO：6)

pTAL-R:cggcgattgactcttctgat(SEQ ID NO：7)

活性鉴定引物序列如下：

pR26-SF:CACAGTCAGATGATCTTGAC(SEQ ID NO：8)

pR26-SR:GTTAGGAGCCAGTAATGGAG(SEQ ID NO：9)

实施例2pR26打靶载体（第二构建体）构建

设计左右同源臂扩增引物，扩增同源臂。并在左同源臂的上游引物引入SalI酶切位点，在左同源臂的下游引物引入loxp序列和NheI及HindIII酶切位点；在右同源臂上游引物引入lox2272序列和NotI酶切位点，在右同源臂下游引物引入NheI酶切位点，引物序列如下：

pR26LA-F：GTCGACGTCAGTTTGCTCCTTCTCG(SEQ ID NO：10)

           SalI

pR26LA-R：GCTAGCAAGAAGCTT ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT

           NheI    HindIII       loxp

GACACTAGTTTGGAAGCTA(SEQ ID NO：11)

pR26RA-F:

GCGGCCGC ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATTCTGTCTCCAGTATC

  NotI                 lox2272

TGAT(SEQ ID NO：12)

pR26RA-R:GCTAGCACTTCCAAGGCTCAACAG(SEQ ID NO：13)

          NheI

打靶插入片段为PGK-TK-2A-Neo-BGPA序列，其中PGK为启动子，TK为负筛选标记，2A为切割短肽，Neo为新霉素筛选标记，BGPA为polyA序列。以上5个元件已有商业化片段，从商业载体上扩增并采用融合PCR的方法，将5个元件融合后连接到T载体上，简称PTNB-T。其中，各元件扩增引物如下：

PGK-F：AAGCTTGAATTCTACCGGGTAGGGGAG(SEQ ID NO：14)

        HindIII

PGK-tkR：GTTGATGGCAGGGGTACGAAGCCATATTGGCTGCAGGTCGAAAGGCCCGG(SEQ ID NO：15)

TK-pgkF：CGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAAC(SEQ ID NO：16)

TK-neoR：GTCTCCCGCCAACTTGAGAAGGTCAAAATTCAAAGTCTGTTTCACGCCAGAACCGTTAGCCTCCCCCATC(SEQ ID NO：17)

NEO-tkF:TTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCAGGGCCCATGATTGAACAAGATGGATTG(SEQ ID NO：18)

NEO-paR：GATAGGCAGCCTGCACCTGAGGAGTTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGA(SEQ ID NO：19)

BGPA-neoF：TCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATC(SEQ ID NO：20)

BGPA-R：

GCTAGCAAGAATGCGGCCGCTGCAGGTCGAGGGATCTCC(SEQ ID NO：21)

 NheI         NotI

同源重组自杀基因DTA，无需药物筛选，插入基因组表达即对细胞有致死性，作为同源重组筛选的一个重要元件，也构建到打靶载体，连接到右同源臂下游。DTA完整表达框从商业打靶载体中扩增，其扩增引物如下：

DTA-F：AGCCTTGGAAGTGCTAGCttatcgaattctaccgggtagg(SEQ ID NO：22)

DTA-R：AAGTGGACGATTGCTAGCtcactatagggcgaattggg(SEQ ID NO：23)

                    NheI

将扩增的元件全部克隆到T载体上，包括pR26LA、pR26RA、PTNB三个片段。按顺序连接到骨架载体pMD18-T simple：1）将pR26LA的PCR产物连接到T载体上，然后HindIII和NheI双酶切pR26LA-T和pR26RA-T，回收的pR26RA连接到pR26LA-T上，构建pR26LA-RA-T；2）NheI和NotI双酶切pR26-T和PTNB-T，回收的PTNB片段连接到pR26LA-RA-T，构建pR26LA-PTNB-RA-T；3)NheI单酶切pR26LA-PTNB-RA-T，回收片段和DTA的PCR回收产物混合infusion连接，构建pR26打靶终载体，第三构建体。其中，第二构建体的结构示意图见图5。图6显示了pR26打靶载体的各元件PCR扩增产物电泳结果，以及终载体质粒和酶切鉴定结果。其中，图6a是打靶载体构建所需元件的PCR扩增结果：PGK片段大小为540bp，Neo片段大小为839bp，BGPA片段大小为557bp，TK片段大小为1160bp，PTNB大小为3.1k，pR26LA片段大小为829bp，pR26RA片段大小为790bp。图6b是打靶载体质粒和NheI酶切鉴定结果，其中该图中“P”表示质粒，“N”表示Nhel酶切，质粒大小为9k，NheI酶切目的条带为1.6k和7.4k。

实施例3pR26打靶细胞的转染筛选和鉴定

提取无内毒素TALENs质粒和pR26打靶载体质粒。并SalI酶切pR26打靶载体使其线性化。采用核转方法将TALENs质粒和pR26线性化片段共转染巴马猪胎儿成纤维细胞，转染比例为2μg TALENs：0.4μg pR26打靶载体。

将转染后的细胞分盘到10cm，利用500μg/ml的G418进行细胞筛选，筛选1周后，出现阳性克隆，将阳性克隆挑取到48孔板继续扩大培养，并换200μg/ml浓度G418维持。需要说明的是，不同的细胞系G418的致死浓度不一样，所以要先对细胞系做G418致死浓度的测定，本实施例中的巴马成纤维细胞系的G418致死浓度为500μg/ml。

将细胞扩繁到24孔板，提取DNA进行鉴定。鉴定上游引物设在在插入片段PTNB上，本实施例的上游引物采用BGPA扩增的上游引物。鉴定下游引物设在基因组右同源臂下游，扩增引物序列如下：

BGPA-neoF：TCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATC(SEQ ID NO：24)，

pR26-idenR1：TAACCTAAATGGACCACAGAGT(SEQ ID NO：25)。

PCR扩增采用TAKARA的LATaq酶，反应体系（单位μl）如下：

DNAdNTPFPRP10x LA缓冲液LATaqH₂O总体积21.60.40.420.113.520

其中，FP：正向引物，RP：反向引物。

PCR反应程序如下：

鉴定结果如图7和图8。图7为一次鉴定结果，其中BM为巴马猪（BM）细胞阴性对照，PCR扩增目的条带为1.7k，1、2、7、9、10、11、17、18、23、25、27、32、34、38、39、41、43、50、53、54、61、64、65、69、72、75、76、78为阳性细胞系。由图7可知，阳性克隆有61个，阳性率29%。图8为第二次鉴定结果，其中BM为阴性对照，PCR扩增目的条带为1.7k，1、2、7、9、10、11、17、18、23、25、27、32、38、39、41、50、53、61、64、65、72、76、92为两次鉴定均为阳性的阳性细胞系，14、24、33、42、48、49、55、56、58、59、63、80、83、85、86、87、88、89、90、91、93、94为第二次鉴定为阳性第一次鉴定为阴性的细胞系。由图8可知，阳性克隆91个，阳性率达到51%，其中第一次第二次鉴定均为阳性的克隆有36个，阳性率达到20%。

实施例4建立master成纤维细胞系

将实施例3鉴定为阳性的克隆，进行手工克隆并移植，具体如下：

获得卵巢，收集卵子，并将其在改良的TL-Hepes-PVA缓冲液中清洗后，放入培养板中，在培养箱内进行未成熟卵细胞体外成熟（in vitro maturation，IVM）培养，得到成熟卵子。其中，改良的TL-Hepes-PVA缓冲液的配方为（其中mol指mol/L）：114mol NaCl、3.2mol KCl、0.34mol NaH₂PO₄、10mol乳酸钠、0.50mol MgCl₂·6H₂O、10mol Hepes、0.2mol丙酮酸钠、12mol山梨醇、2mol Na₂HCO₃、2mol CaCl₂·2H₂O、0.01%PVA。

然后，将所得到的成熟卵子在显微镜下用小刀片去核，以便获得成熟去核卵母细胞。

挑取单个前面获得的阳性转基因细胞（包含利用大白猪胎儿成纤维细胞和巴马耳源成纤维细胞制备的转基因细胞系），利用融合仪电激将其融入到成熟去核卵母细胞中，制成重构胚。重构胚放入培养箱内，培养5～6天，形成成熟囊胚。对囊胚进行体外移植，共移植8头代孕母猪。代孕母猪均为二元杂受体。妊娠33天之后，取胎儿建立成纤维细胞系。

提取P1代胎儿成纤维细胞，进行PCR检测。检测方法同实施例3阳性克隆检测。检测阳性的成纤维细胞系即为master胎儿成纤维细胞系。将master胎儿成纤维细胞系进行Ganciclovir（丙氧鸟苷）浓度梯度筛选，选择合适的致死浓度，作为下一步实验筛选浓度。结果，确定master胎儿成纤维细胞系的最适丙氧鸟苷Ganciclovir致死浓度为800ng/ml。

实施例5外源基因表达载体（第三构建体）构建

本实施的外源基因选为EGFP。从本实验室已有EGFP-pcDNA3.1（+）上扩增CMV-EGFP-PA片段，连接到pEASY-blunt载体上，构建EGFP-blunt。合成loxp-lox2272片段并连接到pMD18-T，构建loxp-lox2272-T载体。BamHI和NotI酶切loxp-lox2272-T载体和EGFP-blunt，回收EGFP片段插入loxp-lox2272-T，即完成loxp-EGFP-lox2272载体构建，即第三构建体。其中，第三构建体的结构示意图见图9。图10显示了第三构建体loxp-EGFP-lox2272载体构建过程中的电泳检测结果图。图10a是骨架载体loxp-mcs-lox2272-T菌液PCR结果，其中，1、3、4、8、9、11为阳性条带。图10b是骨架载体酶切及目的片段酶切结果，其中，1为HindIII酶切，2为NotI酶切，3为HindIII+NotI酶切，EGFP为HindIII+NotI酶切EGFP-B，骨架载体loxp-mcs-lox2272-T由于HindIII和NotI酶切位点非常近，单酶切和双酶切条带一致，都是2.8k；HindIII和NotI双酶切EGFP-B的目的条带为1.6k。图10c是第三构建体酶切鉴定结果，HindIII和NotI双酶切loxp-EGFP-lox2272的3个克隆，目的条带是2.8k+1.6k。

其中，合成引物和片段序列如下：

Loxp1:ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggatccagatctctcgaggcggccgcATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATA(SEQ ID NO：26)，

Loxp2:ATAACTTCGTATAGGATACCTTATACGAAGTTATgcggccgcctcgagagatctggatccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATA(SEQ ID NO：27)，

EGFP-F1：AAAggatccCGATGTACGGGCCAGATA(SEQ ID NO：28)，

EGFP-R1：AAAggcggccgcCTCAGAAGCCATAGA(SEQ ID NO：29)。

实施例6整合酶Cre表达载体（第四构建体）构建

将Cre表达框从商业载体上扩增后，连接到CMV-T载体上(该载体的具体构建方法见实施例1)构建CMV-Cre-T，即第四构建体。其中，第四构建体的结构示意图见图11。图12显示了Cre扩增电泳图及CMV-Cre-T鉴定电泳图。如图12所示，Cre的PCR扩增片段大小为1.1k，CMV-Cre-T箘液PCR引物同Cre扩增引物。XhoI和EcoRI酶切目的条带为1.1k和3.5k。

其中，Cre扩增引物如下：

Cre-F:5-CCGCTCGAGATGGCACCCAAGAAGAAG-3(SEQ ID NO：30)，

           Xho Ⅰ

Cre-R:5-CCGGAATTCCTAATCGCCATCTTCCAG-3(SEQ ID NO：31)。

           EcoR Ⅰ

实施例7整合酶介导的外源基因定点插入细胞获得

利用核转方法，将实施例5和实施例6分别构建的第三构建体和第四构建体共转染实施例4获得的master胎儿成纤维细胞。转染后分盘到10cm皿，并用500ng/ml的Ganciclovir进行筛选。筛选一周后，并提取mix细胞的DNA进行鉴定。鉴定上游引物为EGFP-idenF2，鉴定下游引物为pR26-idenR1，鉴定结果如图13所示。如图13所示，PCR扩增目的条带是2.5k，EGFP+Cre表示EGFP表达载体和Cre表达载体共转染祖细胞系后提取DNA的扩增条带，BM是指阴性对照。结果表明，转染第三构建体和第四构建体并筛选后，EGFP表达框定点插入到ROSA26位点。由此，说明了本发明的无标记定点整合转基因系统是获得无标记定点整合转外源基因家畜动物细胞的有效方法。

其中，鉴定引物如下：

EGFP-idenF2：actagagaacccactgcttactgg(SEQ ID NO：32)

pR26-idenR1：TAACCTAAATGGACCACAGAGT(SEQ ID NO：33)

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。