一株深海来源的蜡状芽孢杆菌及其在产中性蛋白酶中的应用

摘要

本发明涉及一株深海来源的蜡状芽孢杆菌及其在产中性蛋白酶应用。本发明的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus SWJS 13）于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8424。本发明对该菌株产中性蛋白酶的发酵条件进行了优化，其培养条件简单，易控制，发酵周期短，蛋白酶活力高，遗传性质稳定。

说明书

技术领域

本发明涉及深海来源的蛋白酶生产菌株，具体涉及蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus SWJS 13）及其液体发酵产蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白酶是一种广泛应用于食品、饲料、化工、医药、皮革等行业的酶制剂，不同蛋白酶的适用条件及作用的特异性不同，选择合适的蛋白酶才能得到理想的作用效果。随着蛋白酶工业应用条件的多样化及在新领域的应用潜力的发掘，研究者们对探索新型的蛋白酶资源及高产蛋白酶的菌种始终保持着较高的关注。海洋生物资源丰富，覆盖了70%的地球表面积，包含了80%的的生物资源，且开发程度相对较低，已研究和鉴定过的微生物还不到总量的5%，已发现的活性物质不到总数的1%，远未获得有效开发，成为开发利用的热点。海洋环境与陆生环境相比的特殊性导致海洋微生物在物种、基因组成、生态功能、代谢系统和机体防御系统上的多样性，可能产生多种具有特殊结构和功能的活性物质，包括酶制剂。许多研究团队都报道了海洋微生物所产的酶具有各种象独特的性质，其中海洋蛋白酶已被报道具有适冷、嗜压、嗜热及耐有机溶剂等特性，对深海菌株所产的蛋白酶进行研究对开发新型蛋白酶具有重要意义。

微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌产生，其次是酵母和放线菌，工业上生产蛋白酶的菌株主要是芽孢杆菌和霉菌。目前已报道的海洋来源的产蛋白酶的菌株主要包括假单胞菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、氧化短杆菌属等，对这些菌株产蛋白酶进行研究可开发新的酶制剂生产菌种。

发明内容

本发明的目的是提供一株深海来源的蜡状芽孢杆菌及其在产中性蛋白酶中的应用。

本发明的一株深海来源的蜡状芽孢杆菌分离自南海深海沉积物样品，采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛筛选得到，分类命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus SWJS 13）。该菌株已于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 8424。

经形态鉴定及生物生化特性研究，保藏编号为CGMCC No. 8424的菌株具有以下特征：（1）菌落形态：菌落呈圆形，大小中等，扁平，光滑湿润，有光泽，边缘整齐，乳白色；（2）细胞形态：革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，有芽孢；（3）生理生化特征：兼性厌氧生长，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖，不能利用β-木糖、阿拉伯糖、甘露醇、西蒙氏柠檬酸盐，淀粉水解阳性、明胶液化阳性、V-P试验阳性、硝酸盐还原阳性，接触酶阳性、氧化酶阴性，不产氨，不产H₂S，在50℃不能生长。

对保藏编号为CGMCC No. 8424菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16S rRNA基因片段长度为1448bp，具体序列见序列表。该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行分析得知，该菌株与Bacillus cereus strain cpl (JX544748.1)相似性最高，同源性达100%,与模式菌株Bacillus cereus strain ATCC 14579 (NR_074540.1)同源性达99%。结合16S rRNA基因序列相似性及形态、生理生化特征，鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus SWJS 13）。

采用单因素试验对保藏编号为CGMCC No.8424菌株液体发酵产蛋白酶的条件进行了优化。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：本发明采用单因素试验优化了产蛋白酶的条件，其培养条件简单，易培养，遗传性质稳定。深海来源的蜡状芽孢杆菌SWJS 13，可能成为新型蛋白酶资源的生产菌种，具有重要的后续开发及工业应用价值。

附图说明

图1为不同发酵温度对蜡状芽孢杆菌SWJS 13产蛋白酶的影响曲线。

图2为不同培养基初始pH对蜡状芽孢杆菌SWJS 13产蛋白酶的影响曲线。

图3为不同装液量对蜡状芽孢杆菌SWJS 13产蛋白酶的影响曲线。

图4为不同碳源对蜡状芽孢杆菌SWJS 13产蛋白酶的影响曲线。

图5为不同氮源对蜡状芽孢杆菌SWJS 13产蛋白酶的影响曲线。

图6为不同发酵时间对蜡状芽孢杆菌SWJS 13产蛋白酶的影响曲线。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施和包含不限于此，需指出的是，以下若有为特别详细说明之处，均是本领域技术人员可参照现有技术实现的。

富集及种子培养基：蛋白胨5g,酵母粉1g，人工海水1L,pH 7.4-7.6。

酪蛋白培养基：酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，磷酸二氢钾2g,琼脂粉15g，人工海水1L,pH 7.4左右。

发酵培养基：甘油3g，葡萄糖5g, 酵母粉 10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，海盐10g， pH7.2。

产蛋白酶的CGMCC No. 8424的分离筛选

富集培养：称取2g深海海泥样品样于50mL灭菌离心管中，加15mL无菌蒸馏水，充分混合，在摇床中振摇30min，静置后取上清液1mL于富集培养中（50 mL /250mL），37℃，120rpm，培养48h。

初筛：取富集后的培养液1mL加入9mL无菌生理水中，用倍比法稀释到不同梯度（10^-1-10^-7）。选取10^-4，10^-5，10^-6，10^-7稀释度，各吸取0.1mL，加入已凝固的酪蛋白培养基中，涂布均匀。倒置放在37℃培养箱中培养24-48h。

分离纯化：挑选上述酪蛋白平板中有明显水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上连续划线分离三次以上，直到为纯培养物为止。挑选水解圈较大的单菌落保存于试管斜面上，保藏于4℃冰箱。

摇瓶发酵复筛：将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37℃，150rpm,活化12h,以2%接种量接种于发酵培养基中，37℃，150rpm,培养48h。发酵液在4℃，10000rpm离心10min,取上清液即为粗酶液。采用福林（Folin）试剂显色法测定中性蛋白酶活力，复筛出液体发酵蛋白酶产量高的菌株。

产蛋白酶的CGMCC No.8424的鉴定

     将活化的CGMCC No. 8424接种于LB培养基中，37℃，150rpm培养10h，取1.5mL新鲜菌液4℃，10000rpm离心5min，收集菌体于2mL离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。

扩增总反应体系为（20μL）:模板基因DNA 0.5μL；上下游引物(20μmol/l)各1.0μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；10×buffer 2.0μL；4种脱氧核苷酸混合物dNTP(各2.5 mmol/L)1.6μL，25 mmol/L MgCl₂ 1.6μL，双蒸水(ddH2O)12.1μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1.5 min；72℃ 10 min；10℃，共30个循环。PCR产物纯化后完成测定的16S rRNA基因基因片段长度为1448bp，与Bacillus cereus strain cpl (JX544748.1)相似性最高，同源性达100%,与模式菌株Bacillus cereus strain ATCC 14579 (NR_074540.1)同源性达99%，具体序列见序列表。根据菌株形态、生理生化特征，结合16S rRNA基因序列相似性鉴定CGMCC No.8424为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus SWJS 13）。

蜡状芽孢杆菌CGMCC No.8424液体发酵产蛋白酶的条件优化

发酵温度的优化：分别在20℃、25℃、30℃、37℃、40℃下发酵，装液量20%，150rpm,培养48h。测定不同发酵温度下粗酶液的中性蛋白酶活力，结果见图1，在25℃下发酵蛋白酶活力最高。

培养基初始pH的优化：分别调节发酵培养基初始pH为5、6、7、8、9、10，装液量20%，在25℃，150rpm条件下培养48h。测定培养基初始pH对产中性蛋白酶的影响，结果见图2，培养基初始pH7-9时发酵蛋白酶活力都较高。

装液量的优化：摇瓶发酵在250mL锥形瓶中进行，装液量分别为10%、20%、30%、40%、60%，pH7，在25℃，150rpm条件下发酵48h。测定不同发酵温度下粗酶液的中性蛋白酶活力，结果见图3，装液量在10%或20%时蛋白酶活力都较高，装液量继续增加时，蛋白酶产量迅速降低。

碳源的优化：分别研究以0.5%及1.0%的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖作为碳源时，菌株发酵产蛋白酶的能力。结果见图4，以0.5%葡萄糖及蔗糖作为碳源时，蛋白酶产量较高，1%葡萄糖作为碳源时几乎不产蛋白酶，以乳糖及可溶性淀粉作为碳源时蛋白酶产量较低。

氮源的优化：分别研究以酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白、大豆粉、大豆分离蛋白、尿素及硫酸铵作为氮源时，菌株发酵产蛋白酶的能力。结果见图5，菌株能够利用酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨产蛋白酶，其中1%酵母粉为氮源时酶活最高。

发酵时间的优化：在pH7，25℃，装液量10%，150rpm条件下发酵，从0-52h每隔4h连续取样，测定中性蛋白酶产量随发酵时间延长的变化趋势。结果见图6，中性蛋白酶在40h时积累量达到最大，随着时间继续延长，有一定的下降。

蜡状芽孢杆菌CGMCC No. 8424遗传稳定性

表1

传代次数12345678蛋白酶活U/mL491±28450±29471±49467± 41428± 39452± 24439± 18448± 32

将保藏的蜡状芽孢杆菌CGMCC No. 8424连续传代培养并测定其中性蛋白酶活力，以酶活力作为指标综合评价菌株的遗传稳定性。结果见表1，传代8次，蛋白酶活力保持在450U/mL左右，遗传稳定性良好。

序列表

GTCTGTCACTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTGCATGTATAGCATGCGCCAG