用于预防或治疗心血管疾病的、包含对血管紧张素-I转换酶表现出抑制活性的肽作为活性成分的药物组合物

摘要

本发明涉及分离自牡蛎酶水解物流分的肽，所述肽显示出血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性；本发明还涉及包含所述肽作为活性成分的用于预防或治疗心血管疾病的药物组合物。具体而言，本发明的分离自牡蛎酶水解物流分的肽可显著抑制ACE活性，并可显示出血压调节作用以及高血压预防作用。因此，所述牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽可有效地用作用于预防或治疗心血管疾病的药物组合物的活性成分。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离自牡蛎酶水解物流分(the fraction of the oyster  enzyme hydrate)的肽，所述肽显示出抑制血管紧张素转换酶(ACE)的 能力；本发明还涉及用于预防和治疗心血管疾病的药物组合物，所述药 物组合物包含所述肽作为活性成分。

背景技术

由于经济的快速发展，疾病的模式和方面也已发生改变，因此，心 血管疾病显著增加，例如，动脉硬化、高血压、心绞痛、心肌梗塞、缺 血性心脏病、心力衰竭、腔内冠状血管成形术引起的并发症、脑梗塞、 脑出血和中风均有增加。根据韩国统计局在2010年报道的死因排行，心 血管疾病被列为韩国第二高的死因，仅次于恶性肿瘤。特别是，心血管 疾病的死亡率在超过55岁的男性和超过65岁的女性中显著增加。

最有代表性的心血管疾病，高血压，占总成年人发病的15～20％，使 其成为世界范围的健康问题。即使高血压患者中未显出具体症状，其也 是高度需要控制和治疗的疾病，这是因为在其它心血管疾病(如动脉硬 化、中风、心肌梗塞和终末期肾脏疾病)中显示出的同一并发症的发生 风险仍然较高。高血压是一种慢性疾病，需要终身治疗，表明其造成巨 大的社会损失和经济损失。

高血压的病因目前尚不清楚，但推测是由遗传因素(如家族病史、 种族、盐摄入量、胰岛素耐受性和肥胖症)和/或环境因素(如过度饮酒 和衰老)等引发的。在涉及血压升高的许多因素中，已知肾素-血管紧张 素-醛固酮循环在调节体内血压和体液水平中起到重要作用(Weiss，D. 等(2001)，Circulation 103：448-454)。

特别地，已知肾素-血管紧张素系统(RAS)在原发性高血压发病中 起重要作用，而原发性高血压占总高血压病例的80％。通常，当肾脏中 血液流速或钠水平下降时、或当交感神经系统活动增加时，肾素-血管紧 张素系统激活。肾动脉中的肾球旁细胞(juxtaglomerular cells)分泌的肾 素将血管紧张素分解为血管紧张素I，然后由血管紧张素转换酶(ACE) 使血管紧张素I转换成血管紧张素II，诱发血管收缩。其结果是，血管 紧张素II通过增加醛固酮合成并通过神经调节来对血压进行调节。ACE 还分解具有血管舒张活性的血管舒缓激肽，从而使血管舒缓激肽失活。

因此，预期血管紧张素转换酶抑制剂(ACE抑制剂)能够治疗或预 防心血管疾病(如高血压、心脏病、动脉硬化或脑出血)，考虑到ACE 对血压上升有很大影响，因此一直对其进行重点研究。具体来说，已经 进行了各种临床尝试，以确认该ACE抑制剂是否能够实现慢性肾病、动 脉硬化和心脏病发作的病例甚至死亡率的降低，并且已报道了相应结果。

根据上述报道，化学合成的血管紧张素转换酶抑制剂(例如雷米普 利、卡托普利、依那普利(enarapil)、赖诺普利(risinopril)、福辛普利 (fosinoril)和螺普利)已得以商业化，并被用作高血压治疗剂。然而， 这些化合物在药物给药形式中很容易分解，这意味着其稳定性低，并且， 这些化合物还通过影响其它细胞引起副作用，包括全身虚弱、呕吐、咳 嗽、头痛、食欲不振和味觉障碍等(Lim SD.等(2008)，韩国J.Food Sci. Ani.Resour，28(5)：587-595)。因此，需要开发一种天然的ACE抑制 剂，其具有增加的稳定性，但在体内具有较少的副作用。

牡蛎的绰号为“来自海洋的牛奶”，一直被认为是优秀的保健食品。 甚至在食用活海鲜不如亚洲国家频繁的西方国家，也食用活牡蛎。作为 营养因子，牡蛎包含糖原、牛磺酸、蛋白质、维生素和多种矿物质，使 得其成为用于保健食品的优异物质。牡蛎在加强心脏和肝脏的功能、治 疗高血压和动脉硬化以及预防心脏病方面同样有效。由于牡蛎中含有大 量的硒元素，其不仅具有重金属解毒活性，还被称为增强心脏、肝脏、 胰腺和其它器官的功能的滋补活力食品。

对于目前已知的天然ACE抑制剂，韩国专利公开No. 10-2012-0092735描述了用于抑制血管紧张素转换酶、或具有抗高血压或 抗糖尿病性质的组合物，所述组合物包含由酶处理的黄褐盒管藻 (Capsosiphon fulvescens)提取物。韩国专利No.10-1275766描述了用 于抑制血管紧张素转换酶、或具有抗高血压或抗肥胖(antiobese)性质 的组合物，所述组合物包含鲍鱼肠的蛋白提取物。

已从天然物质的酶水解物中鉴定出具有ACE抑制活性的肽。其中， 缬氨酸-酪氨酸(一种源自沙丁鱼蛋白的肽)已被证实具有使轻度高血压 患者的血压降低的活性(Shimizu，M(1994)，Melbourne，9月18日)， 因此其已被批准为韩国首个个案授权的保健食品。韩国专利No. 10-1106303描述了从牡蛎中制备的肽的ACE抑制活性。然而，对天然物 质衍生的功能肽的开发需求仍不断增加。

因此，本发明人试图从天然物质的酶水解物中鉴定出具有ACE抑制 活性的肽。作为结果，通过从牡蛎酶水解物中提取、分离和纯化肽，本 发明人获得了一种具有ACE抑制活性的新型肽。此后，本发明人通过确 认发明人所鉴定出的新型肽具有调节血压和预防高血压的作用，使得可 有效地将该从牡蛎酶水解物分离出的肽用作用于预防或治疗心血管疾病 的药物组合物的活性成分，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制 活性的肽，所述肽包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的氨基 酸序列之一。

本发明的另一目的是提供一种用于预防和治疗心血管疾病的药物组 合物，所述药物组合物包含含有所述肽的牡蛎酶水解物流分作为活性成分。

本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗心血管疾病的药物组 合物，所述药物组合物包含所述肽中的至少一种作为活性成分。

本发明的再一目的是提供一种用于预防或改善心血管疾病的保健食 品，所述保健食品包含含有所述肽的牡蛎酶水解物流分作为活性成分。

本发明的另一目的是提供一种用于预防或改善心血管疾病的保健食 品，所述保健食品包含所述肽中的至少一种作为活性成分。

本发明的另一目的是提供一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包 含向患有心血管疾病的受试者给予牡蛎酶水解物流分的步骤，所述牡蛎 酶水解物流分包含所述肽。

本发明的另一目的是提供一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包 含向患有心血管疾病的受试者给予所述肽中的至少一种的步骤。

本发明的另一目的是提供一种预防心血管疾病的方法，所述方法包 含向受试者给予牡蛎酶水解物流分的步骤，所述牡蛎酶水解物流分包含 所述肽。

本发明的另一目的是提供一种预防心血管疾病的方法，所述方法包 含向受试者给予所述肽中的至少一种的步骤。

本发明的另一目的是提供牡蛎酶水解物流分作为用于预防或治疗心 血管疾病的药物组合物的用途，所述牡蛎酶水解物流分包含所述肽。

本发明的另一目的是提供所述肽中的至少一种作为用于预防或治疗 心血管疾病的药物组合物的用途。

本发明的另一目的是提供牡蛎酶水解物流分作为用于预防或改善心 血管疾病的保健食品的用途，所述牡蛎酶水解物流分包含所述肽。

本发明的另一目的是提供所述肽中的至少一种作为用于预防或改善 心血管疾病的保健食品的用途。

为实现上述目的，本发明提供了一种具有血管紧张素转换酶(ACE) 抑制活性的肽，所述肽包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的 氨基酸序列之一。

本发明还提供了一种用于预防和治疗心血管疾病的药物组合物，所 述药物组合物包含含有所述肽的牡蛎酶水解物流分作为活性成分。

本发明还提供了一种用于预防或治疗心血管疾病的药物组合物，所 述药物组合物包含所述肽中的至少一种作为活性成分。

本发明还提供了一种用于预防或改善心血管疾病的保健食品，所述 保健食品包含含有所述肽的牡蛎酶水解物流分作为活性成分。

本发明还提供了一种用于预防或改善心血管疾病的保健食品，所述 保健食品包含所述肽中的至少一种作为活性成分。

本发明还提供了一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包含向患有 心血管疾病的受试者给予牡蛎酶水解物流分的步骤，所述牡蛎酶水解物 流分包含所述肽。

本发明还提供了一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包含向患有 心血管疾病的受试者给予所述肽中的至少一种的步骤。

本发明还提供了一种预防心血管疾病的方法，所述方法包含向受试 者给予牡蛎酶水解物流分的步骤，所述牡蛎酶水解物流分包含所述肽。

本发明还提供了一种预防心血管疾病的方法，所述方法包含给予所 述肽中的至少一种的步骤。

本发明还提供了牡蛎酶水解物流分作为用于预防或治疗心血管疾病 的药物组合物的用途，所述牡蛎酶水解物流分包含所述肽。

本发明还提供了所述肽中的至少一种作为用于预防或治疗心血管疾 病的药物组合物的用途。

本发明还提供了牡蛎酶水解物流分作为用于预防或改善心血管疾病 的保健食品的用途，所述牡蛎酶水解物流分包含所述肽。

此外，本发明还提供了所述肽中的至少一种作为用于预防或改善心 血管疾病的保健食品的用途。

有益效果

显示出血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性、并已从牡蛎酶水解物 流分分离出的本发明的肽具有调节血压以及预防高血压的作用，从而使 得可将所述牡蛎酶水解物流分或由其分离的所述肽有效地用作预防或治 疗心血管疾病的药物组合物的活性成分。

附图说明

可参照附图来更好地理解本发明优选实施方式的应用，其中：

图1是一组示出牡蛎酶水解物的纯化的图。A表示通过阴离子交换 色谱进行的纯化；B表示通过尺寸排阻色谱对从上述阴离子交换色谱得 到的流分4进行的纯化；以及C表示通过反相色谱进行的纯化。

图2是一组示出从牡蛎酶水解物分离出的肽的质量(mass)和氨基酸序 列的图。

图3是示出单次给予牡蛎酶水解物的体内血压调节作用的图。

图4是示出单次给予功能肽的体内血压调节作用的图。

图5是示出重复给予牡蛎酶水解物和功能肽的体内血压调节作用的图。

图6是示出牡蛎酶水解物和功能肽对血管紧张素转换酶(ACE)血 液水平的抑制作用的图。

图7是示出牡蛎酶水解物和功能肽对血管紧张素II血液水平的抑制 作用的图。

图8是示出牡蛎酶水解物和功能肽在体内对高血压的预防作用的图。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

本发明提供一种具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的肽，所 述肽包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的氨基酸序列之一。

所述肽优选分离自牡蛎酶水解物，但并非总是受限于此，并且所述 肽可以源自其它天然来源或可合成得到。

对于肽的分离，本领域技术人员公知的任何常规方法(如超滤法和 色谱法)均是优选的，更优选色谱法。具体来说，优选使用阴离子交换 色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱或高效液相色谱(HPLC)，但并非总是 受限于此。

对于肽的合成，优选常规的肽合成方法，如化学合成法(W.H. Freeman和Co.，Proteins；structures and molecular principles，1983)。具 体来说，更优选溶液相肽合成、固相肽合成、片段缩合、F-moc或T-BOC 化学方法，并且在这些方法中，最优选固相肽合成，但并非总是受限于此。

本文的酶优选本领域技术人员公知的常规蛋白酶，并且更优选为 protamex或neutrase，但并非总是受限于此。所述酶的添加逐步进行。确 切地说，首先使protamex进行反应，诱导失活，然后添加neutrase，但 并非总是受限于此，protamex和neutrase可同时加入。酶的优选浓度为 牡蛎酶水解物蛋白质浓度的0.1～10％。优选在20～100℃进行10～120分钟 诱发酶失活，但并非总是受限于此，失活条件可根据酶的种类改变。

在本发明的一个优选实施方式中，本发明人通过使用蛋白酶对牡蛎 蛋白质进行水解，从而制备牡蛎酶水解物。然后，进行色谱来从所述牡 蛎酶水解物中纯化出具有ACE抑制活性的功能肽。其结果是，选出了7 个显示ACE抑制活性的样品(参见图1、表1和表2)。

为了从所述样品中筛选具有ACE抑制活性的功能肽，对肽的质量和 氨基酸序列进行了确认。其结果是，选出了包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ. ID.NO:12所表示的氨基酸序列之一的肽(参见图2和表3)。化学合成 了所述肽，然后对ACE抑制活性和细胞毒性进行了研究。其结果是，本 发明的所有肽均表现出ACE抑制活性且无细胞毒性(参见表4)。

因此，可将本发明的肽有效地用作ACE活性抑制剂，因为它显示出 显著的ACE抑制活性且无细胞毒性。

本发明的肽可通过如下基因工程方法制备。首先，按照常规方法构 建编码所述肽的DNA序列。可通过PCR使用适当的引物来构建DNA序 列。也可通过本领域技术人员公知的其它标准方法(例如使用DNA自动 合成仪(例如Biosearch或Applied Biosystems的产品)的方法)合成DNA 序列。将所述DNA序列插入含有一个或多个表达调控序列(例如启动子、 增强子等)的载体，所述表达调控序列可操作地连接至所述DNA序列以 使其表达，从而构建重组表达载体。使用构建的重组表达载体转化宿主 细胞，并在建议的条件下在适当的培养基中培养所产生的转化体，从而 诱导所述DNA序列的表达。通过本领域技术人员公知的传统方法(例如 色谱法)收集由所述DNA序列编码的纯肽。“纯肽”是指不含来自宿主 的任何其它蛋白质的肽。所使用的合成本文所述肽的基因工程方法参见： Maniatis等，Molecular Cloning：A laboratory Manual，Cold Spring Harbor  laboratory，1982；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第二版(1998)和第三版(2000)；Gene  Expression Technology，Method in Enzymology，Genetics and Molecular Biology， Method in Enzymology，Guthrie&Fink(eds.)，Academic Press，San Diego， Calif，1991；以及Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255:12073-12080，1990。

本发明的肽可胃肠外给药，并能够以一般药物制剂形式使用。本文 所述的胃肠外给药包括直肠内、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、经皮、 鼻内、吸入、眼部和皮下给药。

也就是说，可通过与通常使用的稀释剂或赋形剂(如填充剂、增量 剂(extenders)、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)混合来将本发 明的肽制备为用于胃肠外给药。胃肠外给药用制剂为无菌水溶液剂、水 不溶性赋形剂(water-insoluble excipients)、混悬剂、乳剂、冻干制剂和 栓剂。水不溶性赋形剂和混悬剂除了活性化合物以外还可含有丙二醇、 聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯(ethylolate)) 等。栓剂除了活性化合物以外还可含有witepsol、聚乙二醇(macrogol)、 吐温61、可可脂、月桂脂(laurin butter)、甘油明胶等。

可将本发明的肽与许多药学上可接受的载体(如生理盐水或有机溶 剂)混合，并且还可包含碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)；抗氧 化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)；螯合剂；低分子量蛋白或其它稳定剂， 从而提高稳定性或吸收率。

本发明的肽的有效剂量为每天0.01～100mg/kg，优选每天 0.1～10mg/kg，并且给药频率优选为每天1～3次。

可使用大丸剂(bolus)的形式给予有效剂量的本发明的肽，通过时 间相对较短的输注给予单个剂量、或者通过长期给予多个剂量的分次治 疗方案(fractionated treatment protocol)来给予。肽的有效剂量的决定取 决于给药途径、治疗次数、患者的年龄和其它条件等。因此，具有本领 域知识的任何技术人员都可决定本发明的肽的有效剂量。

本发明还提供用于预防和治疗心血管疾病的药物组合物，所述药物 组合物包含含有肽的牡蛎酶水解物流分作为活性成分，所述肽包含由 SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的氨基酸序列之一。

本文的流分优选10kD以下的流分，但并非总是受限于此。

所述心血管疾病优选为选自高血压、心脏病、中风、血栓、心绞痛、 心力衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化和动脉硬化组成的组中的一种或多 种疾病，但并非总是受限于此。

在本发明的另一优选实施方式中，本发明人经由单次或多次给药向 高血压大鼠模型给予所述肽，以研究本发明的肽的血压调节活性。其结 果是，证实了牡蛎酶水解物和YA肽具有显著的抗高血压活性(参见图4 和图5)，并且血液ACE水平和血管紧张素II水平相应地显著下降(参 见图6和图7)。

为了研究本发明的肽的体内抗高血压作用，本发明人向诱导了高血 压的大鼠给予本发明的肽，随后对抗高血压作用进行检查。其结果是， 大鼠血压显著降低(参见图8)。

因此，含有所述肽(所述肽包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12 所表示的氨基酸序列之一)的牡蛎酶水解物流分具有血压调节活性，从 而具有抗高血压作用，因此，可将所述流分有效地用作预防或治疗心血 管疾病的药物组合物的活性成分。

可通过与通常使用的稀释剂或赋形剂(如填充剂、增量剂、粘合剂、 润湿剂、崩解剂和表面活性剂)混合来将本发明的组合物制备为用于胃 肠外给药。

除了上述成分之外，本发明的药物组合物还可包含各种营养素、维 生素、矿物质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机 酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂(antiseptics)、甘 油、醇、用于添加至苏打水的碳酸化剂等。所述载体、赋形剂或稀释剂 可以选自于以下物质所组成的组：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘 露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐/酯、 明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡 咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿 物油、糊精、碳酸钙、丙二醇、液体石蜡和盐水，但并非总是受限于此。 所有提及的成分可单独添加或共同添加。

可通过遵循Remington’s Pharmaceutical Science(最新版)，Mack  Publishing Company，Easton PA中记载的方法，根据成分将本发明的药 物组合物进一步制备为适当的形式。

以药学上有效的剂量给予本发明的组合物。本文中的术语“药学上 有效的剂量”表示适于医学治疗的具有合理的收益/风险比的足以治疗疾 病的量。剂量可以通过考虑许多因素来确定，例如疾病类型、疾病严重 程度、药物活性、对药物的敏感度、给药频率和途径、排泄(excretion)、 治疗期限、共同治疗的药物以及医药领域中认为有关的其它因素。可将 本发明的组合物作为单独的药物给药或与其它药剂联合给药，并且，可 将本发明的组合物与其它药剂连续(serially)给药或同时给药。单次或 多次给药也是可以接受的。重要的是确定在无副作用的情况下以最少的 量带来最大效果的剂量，该剂量可由本领域技术人员容易地确定。

本发明药物组合物的有效剂量可根据体重、年龄、性别、健康状况、 饮食、给药频率、给药方法、排泄和疾病严重程度来确定。组合物优选 的有效剂量为每天0.01～1000mg/kg，优选每天30～500mg/kg、更优选每 天50～300mg/kg，给药次数为每天1～6次。然而，可通过考虑各种因素 而对剂量加以调整，如给药途径、疾病严重程度、患者的年龄、性别和 体重等。因此，优选的剂量并不能在任何方面限制本发明的范围。

本发明的组合物可以单独给药，或者可以与外科手术、放射疗法、 激素疗法、化疗疗法和生物调节剂共同进行治疗。

本发明还提供一种用于预防或治疗心血管疾病的药物组合物，所述 药物组合物含有一种或多种包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表 示的氨基酸序列的肽作为活性成分。

本发明的肽显示出有效的血压调节活性和抗高血压作用，从而可将 任何本发明的肽有效地用作预防或治疗心血管疾病的药物组合物的活性 成分。

本发明还提供一种用于预防或改善心血管疾病的保健食品，所述保 健食品包含含有肽的牡蛎酶水解物流分作为活性成分，所述肽包含由 SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的氨基酸序列之一。

本发明还提供一种用于预防或改善心血管疾病的保健食品，所述保 健食品包含所述肽中的至少一种作为活性成分。

本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽表现出优异的ACE抑制 活性，表明其可具有有效的血压调节活性和抗高血压作用。因此，可将 所述牡蛎酶水解物流分和由其分离的肽有效地用作预防或改善心血管疾 病的保健食品的活性成分。

并不对本文的食品进行限制。例如，可将本发明的肽添加至饮料、 肉、香肠、面包、饼干、年糕(rice cakes)、巧克力、糖果、点心(snacks)、 曲奇饼、比萨饼、拉面(ramyuns)、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、特 殊营养食品(如配方奶粉或幼儿饮食)、加工肉制品、鱼制品、豆腐、淀 粉凝胶产品、健康辅助食品、调味食品(如酱油、豆瓣酱、辣椒酱或什 锦酱(mixed sauce))、酱汁(sauces)、其它加工食品、咸菜(如泡菜(Kimchi) 或酱菜(Jangajji))、汤、饮料、酒精饮料和维生素复合物，并在广泛的 意义上说，几乎可包括适于生产保健食品的每一种食品。

本发明中的“保健食品”是指通过物理、生化、或生物技术手段被 设计为针对特定目的发挥功能、或诱导其组分完全表达的具有附加价值 的食品组；或是指被设计为诱导食品每一组分完全表达，从而对生物防 御系统或参与疾病预防和恢复的其它调节系统进行调节的加工食品。更 优选地，本发明的保健食品是指可诱导参与预防或改善心血管疾病的身 体调节功能全面起作用的食品。所述保健食品可以包含食品工业中可接 受的添加剂以及在保健食品制备中通常使用的载体、赋形剂和稀释剂。

可将本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽用作食品添加剂。 在该情况下，可按照常规方法将本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离 的肽原样添加、或与其它食品成分混合添加。活性成分的混合比可根据 使用目的(预防或健康增强)进行调节。通常而言，为了生产保健食品 或饮料，优选添加0.1～90重量份的本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分 离的肽。然而，如果为了健康和卫生或调节健康状况而需要长期给药， 其含量可低于上述值，但较高含量也可接受，这是由于本发明的牡蛎酶 水解物流分或由其分离的肽已被证明是很安全的。

与其它饮料类似，用于本发明的保健饮料的组合物除了生药复合物 的提取物以外，还可包含各种调味剂或天然碳水化合物等。上述天然碳 水化合物可以是如下物质之一：单糖(如葡萄糖和果糖)、二糖(如麦芽 糖和蔗糖)、多糖(如糊精和环糊精)、以及糖醇(如木糖醇、山梨糖醇 和赤藓糖醇)。此外，作为甜味剂也可包含天然甜味剂(索马甜、甜叶菊 提取物，例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)和合成甜味剂(糖精、阿斯巴 甜等)。天然碳水化合物的含量优选为100ml组合物1～20g，更优选5～12g。

除了上述成分之外，本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽还 可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(包括天然调味 剂和合成调味剂)、着色剂和增量剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、 海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐 剂、甘油、醇、用于添加至苏打水的碳酸化剂等。本发明的牡蛎酶水解 物流分或由其分离的肽还可包含天然果汁、果汁饮料和/或可添加至蔬菜 饮料的果肉。全部所述成分均可单独添加或共同添加。这些成分的混合 比事实上并不重要，但在通常情况下，每一成分可依照每100重量份本 发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽添加0.1～20重量份来添加。

本发明还提供一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包含向患有心 血管疾病的受试者给予牡蛎酶水解物流分的步骤，所述牡蛎酶水解物流 分含有肽，所述肽包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的氨基 酸序列之一。

本发明还提供一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包含向患有心 血管疾病的受试者给予所述肽中的至少一种的步骤。

本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽显示出优异的ACE抑制 活性，表明其可具有有效的血压调节活性和抗高血压作用。因此，可将 本发明的牡蛎酶水解物流分和由其分离的肽有效地用于治疗心血管疾病 的方法中。

本发明还提供一种预防心血管疾病的方法，所述方法包含向受试者 给予牡蛎酶水解物流分的步骤，所述牡蛎酶水解物流分含有肽，所述肽 包含由SEQ.ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的氨基酸序列之一。

本发明还提供一种预防心血管疾病的方法，所述方法包含给予所述 肽中的至少一种的步骤。

本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽显示出优异的ACE抑制 活性，表明其可具有有效的血压调节活性和抗高血压作用。因此，可将 本发明的牡蛎酶水解物流分和由其分离的肽有效地用于预防心血管疾病 的方法中。

本发明还提供牡蛎酶水解物流分作为用于预防或治疗心血管疾病的 药物组合物的用途，所述牡蛎酶水解物流分含有肽，所述肽包含由SEQ. ID.NO:1～SEQ.ID.NO:12所表示的氨基酸序列之一。

本发明还提供所述肽中的至少一种作为用于预防或治疗心血管疾病 的药物组合物的用途。

本发明还提供牡蛎酶水解物流分作为用于预防或改善心血管疾病的 保健食品的用途，所述牡蛎酶水解物流分含有所述肽。

此外，本发明还提供所述肽中的至少一种作为用于预防或改善心血 管疾病的保健食品的用途。

本发明的牡蛎酶水解物流分或由其分离的肽表现出优异的ACE抑制 活性，表明其可具有有效的血压调节活性和抗高血压作用。因此，可将 所述牡蛎酶水解物流分和由其分离的肽有效地用作用于预防或治疗心血 管疾病的药物组合物的活性成分、或用作用于预防或改善心血管疾病的 保健食品的活性成分。

实施例

本发明的实际且目前优选的实施方式说明性地示于以下实施例中。

然而，可以理解的是，本领域技术人员在考虑了本公开内容后，可 以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例1：牡蛎酶水解物的制备

为了制备本发明的牡蛎酶水解物，使用酶对牡蛎蛋白进行水解。

具体来说，将3kg养殖牡蛎(购自Oyster Hanging Fisheries Cooperatives， Tongyeong-si，Gyeongsangnam-do，韩国)煮至半熟(parboil)3分钟，然 后利用过滤器倾去水。以牡蛎的两倍体积向牡蛎中加入水，随后用研磨 机(M-12S，Hankook Fujee Machinery Co.,Ltd.，韩国)以3000rpm研磨 2分钟。将研磨的牡蛎和转谷氨酰胺酶(TGase；Ajinomoto Co.，Inc.，日 本)装入5L发酵罐(Korea Fermenter，韩国)中，随后在150rpm搅拌 下在30℃反应1小时。通过在100℃加热1小时使反应混合物失活。向 其中添加Protamex(Nobozymes-Korea)，一种源自芽孢杆菌(Bacillus) 的蛋白酶，随后在40℃反应1小时。其结果是，制得了初级牡蛎酶水解 物。将初级牡蛎酶水解物在100℃处理1小时，以使Protamex失活。然 后向其中添加Neutrase(Nobozymes-Korea)，随后在50℃反应1小时。 其结果是，获得了次级牡蛎酶水解物。将次级牡蛎酶水解物在100℃处理 1小时，以使Neutrase失活。然后对次级牡蛎酶水解物进行离心，获得 上清液。在4℃以60％(v/v)的体积将乙醇加至该上清液，随后反应1 小时，以诱导乙醇不溶性物质和残余蛋白质沉淀。以8000×g离心25分 钟，得到上清液。用0.45μm膜滤器过滤所得到的上清液，并用旋转真空 蒸发仪(N-1型，EYELA；日本)在40℃蒸发乙醇。将所得牡蛎酶水解 物冷冻干燥或喷雾干燥并贮存。

实施例2：具有血管紧张素I转换酶(ACE)抑制活性的功能肽的纯化

<2-1>通过阴离子交换色谱进行纯化

为了从牡蛎酶水解物中纯化具有ACE抑制活性的功能肽，进行了阴 离子交换色谱。

具体来说，将0.5g实施例1中制备的牡蛎酶水解物溶解在12ml 20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，将其加载至Q-Sepharose柱 (16×100mm；GE Healthcare-Korea)中，随后在表1所示的条件下进行 阴离子交换色谱。随后获得牡蛎酶水解物流分，各流分2ml，并且对所 检测到的肽进行了确认。

其结果是，如图1所示，得到了含有分离自牡蛎酶水解物的肽的流 分(图1)。

【表1】

功能肽纯化的色谱条件

a：尺寸排阻色谱

b：反相色谱

c TFA：三氟乙酸

d ACN：乙腈

_*溶剂密度梯度：100ml/100min，0～100％溶剂B的密度梯度。

^**溶剂密度梯度：90ml/90min，线性梯度。

<2-2>ACE抑制活性的确认

为了调查实施例<2-1>中获得的流分的ACE抑制活性，通过使用Wu 等人的方法(Wu等，2002；J Chromatography A 950：125-130)并稍作 修改来测定ACE活性。

具体来说，制备含有0.3M NaCl、5mM N-苯甲酰基-Gly-His-Leu (HHL；Sigma；产品#H1635)和0.25mUnit ACE(Sigma，USA)的 0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3)作为反应溶液。然后，将40μl实施例<2-1> 中制备的流分与150μl上述反应溶液混合，然后在37℃水浴中搅拌反应 30分钟。反应完成后，添加150μl 1M HCl以终止ACE反应，然后用离 心机(产品名：5415C；Eppendorf，Hamburg，德国)以10,000rpm离心 10分钟，获得上清液。将20μl所得到的上清液加载至配备反相柱 (Watchers 120ODS-AP，4.6×250mm，5μm；Daiso，日本)的高效液相 色谱(HPLC)，从而对由ACE引起的从HHL解离的马尿酸(HA)含量 进行测定。对于HPLC，使用了0.1％TFA水溶液作为溶剂A和含有0.1％ TFA的乙腈作为溶剂B，在5～60％溶剂B/20分钟的条件下进行线性梯度 洗脱。在以1ml/min洗脱期间测定OD₂₂₈。然后通过以下数学式1计算 ACE抑制活性。通过线性回归分析(JMP统计软件包第7版，SAS Institute， Cary，NC，USA)来分析剂量依赖性ACE抑制活性，随后计算得到IC₅₀(能够抑制50％ACE活性的样品浓度)，从而对ACE抑制活性进行研究。 对于阴性对照，使用了20μl 0.1％TFA水溶液代替样品。然后，通过与上 述相同的方式测定了ACE抑制活性。

【数学式1】

HAo：阴性对照的HA浓度

HA：样本的HA浓度

其结果是，如表2所示，在流分2、3和4的样品中观察到了ACE 抑制活性。

<2-3>通过尺寸排阻色谱进行纯化

为了从牡蛎酶水解物中纯化具有ACE抑制活性的功能肽，进行了尺 寸排阻色谱。

具体来说，在Speed Vacuum Concentrator(扫描速度40，Labgene Aps， 丹麦)中对实施例<2-2>中选出的流分2、3和4进行浓缩。将200μl浓 缩样品加载至superdex肽柱(10×300mm；GE Healthcare-Korea)，随后 在表1所示的条件下对分子量进行尺寸排阻色谱。通过与实施例<2-2>中 所述的相同方式对各样品流分进行研究，以确认ACE抑制活性。

其结果是，如图1和表2所示，通过尺寸排阻色谱选出了含有所述 肽的流分2-1、2-2、2-3、3-1、3-2、4-1和4-2(图1)。这些流分被证实 具有ACE抑制活性(表2)。

<2-4>通过反相色谱进行纯化

为了从牡蛎酶水解物中纯化具有ACE抑制活性的功能肽，进行了反 相HPLC。

具体来说，将实施例<2-3>中选出的流分2-1、2-2、2-3、3-1、3-2、 4-1和4-2加载至source 5RPC ST柱(4.6×150mm；GE Healthcare-Korea) 中，随后在表1所示的条件下对分子量进行反相色谱。通过与实施例<2-2> 中所述的相同方式对各样品流分进行研究，以确认ACE抑制活性。

其结果是，如图1和表2所示，通过反相色谱选出了含有所述肽的 流分(图1)。这些流分被证实具有ACE抑制活性(表2)。

【表2】

根据纯化阶段的流分名称、流分编号、ACE抑制活性和肽序列

实施例3：具有ACE抑制活性的功能肽的质量和序列的研究

为了筛选具有ACE抑制活性的分离自牡蛎酶水解物的功能肽，通过 Edman降解和MALDI/TOF(基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱)对 所述肽的质量和氨基酸序列进行了研究。

具体来说，将实施例<2-4>中选出的显示出ACE抑制活性的7个样 品在真空离心浓缩器中完全干燥，向其添加20μl 0.1％TFA水溶液，直至 样品完全溶解。然后添加50％乙腈以诱导活化，并将溶解的样品加载至 已用0.1％TFA水溶液平衡的ZipTip C18柱(Fierce，产品#：87782)中。 然后以0.1％TFA水溶液洗涤该柱2～3次。使用含0.1％TFA的70％乙腈 对所述肽进行洗脱，以除去剩余的盐。将10μl洗脱的肽溶液加载至 biobrene(AB Systems，USA)预先处理过的微过滤器，并以氩气对所述 过滤器进行干燥。当过滤器已干燥时，将其加载至料筒(cartridge)中， 并使用ABI482自动蛋白质测序仪(Applied Biosystems，USA)，通过脉 冲液法(pulsed-liquid method)对构成所述功能肽的氨基酸序列进行分析。

使实施例<2-4>中选出的显示出ACE抑制活性的7个样品进行基于 电喷雾电离(ESI)的质谱仪Q-TOF2(Micromass，英国)分析，以通过 Nano-ESI-interface进行数据依赖性MS/MS，从而确认功能肽的质量。

其结果是，如图2和表3所示，总共确认了由SEQ.ID.NO:1～SEQ. ID.NO:12所表示的氨基酸序列组成的12个肽(表3和图2)。

【表3】

显示ACE抑制活性的功能肽的氨基酸序列

肽 样品 氨基酸序列 TAY(SEQ.ID.NO:1) 1-2-2 苏氨酸-丙氨酸-酪氨酸 VK(SEQ.ID.NO:2) 2-2-2 缬氨酸-赖氨酸 KY(SEQ.ID.NO:3) 1-3-2 赖氨酸-酪氨酸 YA(SEQ.ID.NO:4) 3-2-1 酪氨酸-丙氨酸 FYN(SEQ.ID.NO:5) 1-1-3 苯丙氨酸-酪氨酸-天冬酰胺 AFY(SEQ.ID.NO:6) 2-1-4 丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸 MC(SEQ.ID.NO:7) 3-2-1 甲硫氨酸-半胱氨酸 GPN(SEQ.ID.NO:8) 3-1-1 甘氨酸-脯氨酸-天冬酰胺 AFN(SEQ.ID.NO:9) 1-1-3 丙氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺 PGN(SEQ.ID.NO:10) 3-1-1 脯氨酸-甘氨酸-天冬酰胺 PH(SEQ.ID.NO:11) 3-2-1 脯氨酸-组氨酸 SF(SEQ.ID.NO:12) 3-2-1 丝氨酸-苯丙氨酸

实施例4：显示ACE抑制活性的功能肽的合成以及活性的确认

<4-1>功能肽的合成

为了研究从牡蛎酶水解物分离的功能肽是否可具有ACE抑制活性， 进行了Fmoc-SPPS(芴甲氧羰酰氯-固相肽合成)以制备合成肽。

具体来说，制备了如下氨基酸作为合成构成实施例3中所确认的肽 序列的氨基酸的材料：C-末端结合至树脂，N-末端被Fmoc保护，并且 残基也被如三苯甲基(Trt)、叔丁氧羰基(Boc)或叔丁基(t-Bu)的保 护基团保护。将制备的氨基酸加至含有2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3- 四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、羟基苯并三唑(HOBt)和N-甲基吗啉 (NMM)的偶联试剂中，随后使用自动合成仪(ASP48S；Peptron，韩 国)在室温反应2小时。向其添加含有20％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)， 接着在室温反应5分钟，在此期间Fmoc被除去，使得肽得以合成。通 过重复该过程合成了本发明的肽。接下来，将TFA、1,2-乙二硫醇(EDT)、 茴香硫醚、三异丙基硅烷(TIS)和水以90％、2.5％、2.5％、2.5％和2.5％ (v/v)的比例混合，向其添加合成的肽。除去缀合至C末端的树脂和残 基中的保护基团。使用Vydac Everest C18柱(22×250mm，10μm；Grace， USA)在线性梯度条件下以含有0.1％TFA的40％乙腈溶液进行了反相 HPLC，从而分离并纯化了所述肽。使用Agilent HP1100系列(Agilent， USA)通过LC/MS确认了纯化的肽。

其结果是，制备了12种合成肽，这些合成肽由与构成分离自牡蛎酶 水解物的功能肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列构成。

<4-2>合成肽的ACE抑制活性和细胞毒性的确认

为了研究分离自牡蛎酶水解物的功能肽是否可具有ACE抑制活性， 对所述合成肽进行了测试，并进行了MTT分析以确认细胞毒性。

具体来说，使用与实施例<2-2>中描述的相同方式对实施例<4-1>中 合成的肽的ACE抑制活性进行了研究。为了测量细胞毒性，将肝癌细胞 系HepG2细胞接种在补充有抗生素和10％胎牛血清(FBS)的MEM中， 随后在37℃，5％CO₂下培养。当细胞生长至80％汇合时，用磷酸盐缓 冲盐水-乙二胺四乙酸(PBS-EDTA)洗涤细胞，然后用胰蛋白酶处理， 随后进行传代培养。在细胞培养期间，每48小时更换培养基。将细胞以 1×10⁵个细胞/ml、100μl/孔的密度分散在96孔板中，然后培养24小时， 以使细胞贴附在板上。随后弃去培养基。以10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml 或200μg/ml的浓度将实施例<4-1>中合成的肽溶解于含有0.2％PBS的 MEM中。以所述肽对上述细胞进行处理，随后进一步培养24小时。培 养完成后，将细胞用PBS洗涤两次，然后用MTT试剂处理。将细胞进 一步培养2小时，并使用ELISA读板仪测定OD₄₉₀。

其结果是，如表4所示，确认了所有这12个功能肽均未显示出细胞 毒性，但是都具有ACE抑制活性(表4)。

【表4】

功能肽的ACE抑制活性和细胞毒性

实施例5：牡蛎酶水解物和由其分离的功能肽的体内血压调节

<5-1>根据分子量对牡蛎酶水解物进行分离

为了对牡蛎酶水解物根据分子量的体内血压调节作用进行研究，将 牡蛎酶水解物分为两组：一组具有至少10kD的分子量，另一组具有低 于10kD的分子量。

具体来说，使用Biomax 10超滤膜(Millipore，USA)和Pellicon XL 超滤膜(Millipore，USA)，通过超滤(Labscale TFF system，Millipore， USA)对实施例1中制备的牡蛎酶水解物进行了过滤。

其结果是，从总牡蛎酶水解物中获得了具有10kD以上的分子量的 牡蛎酶水解物或具有10kD以下的分子量的牡蛎酶水解物。

<5-2>对单次给药的体内血压调节作用的研究

为了研究单次给予分离自牡蛎酶水解物的功能肽的体内血压调节作 用，向高血压动物模型一次给予所述肽(单次给药)，随后进行血压研究。

具体来说，购入了11周龄的雄性自发性高血压大鼠(SHR；Central  Lab.Animal Inc.)和Wistar大鼠(Central Lab.Animal Inc.)，将其饲养在 实验动物房中，温度控制为22±3℃，湿度控制为50±5％，光/暗循环设定 为12小时/12小时。饲料和饮用水均自由提供。适应一周后，将动物分 为实验组和对照组，并根据Institutional Animal Care and Use Committee, Kyunghee University College of Pharmacy批准的Association for  Assessment and Accreditation of Laboratory Care International的准则用于 实验。根据表5所示的条件划分实验组和对照组。向动物口服给予或腹 膜内给予实施例1中制备的牡蛎酶水解物、实施例<5-1>中制备的具有至 少10kD的分子量的牡蛎酶水解物或10kD以下的分子量的牡蛎酶水解 物、实施例<4-1>中制备的肽、或卡托普利(Boryung Co.，Ltd.，韩国)。 然后在0、3、6、9、12和24h的时间点，在温度维持为42℃的大鼠温度 控制单元中将动物固定20分钟，以使尾部血管充分扩张。然后测定收缩 压，以对抗高血压活性进行研究。

【表5】

用于确认单次给药的体内血压调节作用的实验组和对照组的条件

^a对于阳性对照和实验组，将以mg/kg表示的样品剂量与2ml盐水混 合以用于给药。

其结果是，如图3和图4所示，在以卡托普利(一种常规抗高血压 药)治疗的阳性对照组中，与阴性对照高血压大鼠模型相比，血压降低 作用仅为18～19％。同时，当给予牡蛎酶水解物时，与阴性对照相比，血 压降低作用增加至33～38％。特别是，当给予具有10kDa以下的分子量 的牡蛎酶水解物时，实验组的血压显著降低，几乎恢复到了正常对照的 血压，该效果直至给予牡蛎酶水解物后12小时(图3)。

在以本发明的功能肽治疗的实验组中，与阴性对照高血压模型相比， 观察到显著的血压降低作用。特别是，当给予肽YA时，给予后6小时 时的血压降低作用为33.9％，这是所有功能肽的最高效果(图4)。

<5-3>对重复给药的体内血压调节作用的研究

为了研究重复给予分离自牡蛎酶水解物的功能肽的体内血压调节作 用，向高血压动物模型重复给予所述肽，随后进行血压研究。

具体而言，购入如实施例<5-2>中所述的相同大鼠并在相同条件下饲 养。根据如表6中所示的条件将大鼠分为实验组和对照组，向动物口服 给予实施例<5-1>中制备的具有10kD以下的分子量的牡蛎酶水解物、实 施例<4-1>中制备的肽YA、或Val-Tyr(一种分离自沙丁鱼水解物的抗高 血压物质)，所述给予在每日早10am时进行，持续4周。在第0周、第 1周、第2周、第3周和第4周，以与实施例<5-2>中描述的相同方式测 量收缩压。开始给药4周后，处死大鼠并从下腔静脉取血。以3,000rpm 离心血液样品10分钟，从而获得血清并将其贮存在-80℃。使用商业 ELISA试剂盒(USCN Life Science，中国)，根据制造商的方案对贮存的 血清中的ACE和血管紧张素II的血液水平进行测定。

【表6】

用于确认重复给药的体内血压调节作用的实验组和对照组的条件

^a对于阳性对照和实验组，将以mg/kg表示的样品剂量与2ml盐水混 合以用于给药。

其结果是，如图5～图7中所示，与阴性对照高血压大鼠模型相比， 在所有实验组中均观察到显著的血压降低作用。特别是，在以肽YA和 总牡蛎酶水解物治疗的组中，血压在给药后2周内均未见增加。在以10 kD以下的牡蛎酶水解物治疗的组中，血压在给药后2周轻微增加，但从 第三周起开始显示出血压降低作用，该作用随后进一步显著提升(图5)。

与阴性对照高血压组相比，血液ACE水平在所有实验组中均有下降 (图6)。与阴性对照组相比，血液血管紧张素Ⅱ的水平也在所有实验组 中显著降低，这一效果比给予Val-Tyr(一种分离自沙丁鱼水解物的抗高 血压功能肽)的阳性对照组更为显著。具体来说，在以10kD以下的牡 蛎酶水解物治疗的组中，血液血管紧张素Ⅱ的水平与正常对照组几乎相 同(图7)。

实施例6：牡蛎酶水解物和由其分离的功能肽的高血压预防作用

为了研究分离自牡蛎酶水解物的功能肽的高血压预防作用，向高血 压动物模型给予所述肽，随后对抗高血压作用进行了观测。

具体来说，购入了12～16周龄的雄性Wistar大鼠，将其饲养在实验 动物房中，温度控制为22±3℃，湿度控制为50±5％，光/暗循环设定为 12h/12h。饲料和饮用水均自由提供。适应一周后，根据表7中所列的条 件将大鼠分为实验组和对照组(8只大鼠/组)。为诱导高血压，每天以 40mg/kg的浓度经由静脉注射向实验组和对照组的大鼠给予硝基-L-精氨 酸甲酯(L-NAMA；Fluka)。然后，向大鼠口服给予实施例1中制备的牡 蛎酶水解物、实施例<5-1>中制备的具有10kD以下的分子量的牡蛎酶水 解物、实施例<4-2>中制备的肽YA、卡托普利、或Val-Tyr。在第0周、 第1周、第2周、第3周和第4周以与实施例<5-2>中所描述的相同方式 测量收缩压。随后计算各对照组和实验组的平均收缩压。

【表7】

用于确认牡蛎酶水解物和由其分离的功能肽的体内高血压预防作用 的实验组和对照组的条件

^a对于阳性对照和实验组，将以mg/kg表示的样品剂量与2ml盐水混 合以用于给药。

其结果是，如图8所示，通过L-NAMA处理在正常大鼠中诱导了高 血压。与阳性对照组相比，在给予牡蛎酶水解物和功能肽的大鼠组中， 血压升高得到显著抑制(图8)。

本领域技术人员将理解的是，在上文描述中公开的概念和具体实施 方式可容易地用作修改或设计用于实现本发明相同目的的其它实施方式 的基础。本领域技术人员还将理解的是，此类等同实施方式并未脱离如 所附权利要求阐明的本发明的精神和范围。