一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用

摘要

本发明涉及一株特异性抗PRRS病毒非结构蛋白Nsp9的纳米抗体，同时公布了该纳米抗体的VHH序列以及编码该纳米抗体的DNA序列。本发明还提供了一种表达载体，其可以在Marc145细胞中表达纳米抗体-eGFP融合蛋白。本发明的抗Nsp9的纳米抗体可以特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，并且具有抑制PRRS病毒经典毒株和高致病毒株在Marc-145细胞中增殖的功能。本发明的纳米抗体可开发成治疗PRRS的药物，其对应的基因可用于抗PRRS转基因猪的研制。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗PRRS病毒非结构蛋 白Nsp9的纳米抗体及其在抗PRRS病毒中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory  syndrome,PRRS)又名蓝耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的 一种猪的急性传染病。由于PRRS病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞 性、抗体依赖性增强作用(ADE)和持续性感染等特征(Chand R J： Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome  virus.Curr Opin Virol,2012,2(3):256-263)，现有疫苗对该病 的保护作用非常有限，而且目前还没有抗PRRS病毒的特效药物。

PRRS病毒为单股正链RNA病毒，其基因的复制和转录依赖于病 毒自身编码的非结构蛋白，其中非结构蛋白Nsp9具有RNA依赖的RNA 聚合酶活性(Fang Y:The PRRSV replicase:exploring the  multifunctionality of an intriguing set of nonstructural  proteins.Virus Research,2010,154(2):61-76)，是病毒最重要 的复制酶，并且最新的研究发现Nsp9与病毒的毒力有着密切的关系。 因此Nsp9非常合适作为抗病毒药物靶点。

1993年Hamers等人发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体， 将其称为重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs) (Hamers-Casterman C:Naturally occurring antibodies devoid of  light chains.Nature,1993,6428(363):446-448)。这类抗体的抗 原结合位点仅由重链的可变区VHH(variable domain of the heavy  chain of HCAbs,VHH)单结构域形成。尽管天然缺失轻链可变区， 却仍具有良好和广泛的抗原结合力。VHH抗体是目前所发现的具有完 整功能的最小分子抗体片段，分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10， 其分子高度4.8nm，直径2.2nm，故被称为纳米抗体(nanobody)。 VHH抗体重要的特征之一是其具有更长的抗原互补结合区(CDR)，可 结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，如位于酶蛋白裂隙中的活性 中心结构(De Genst E:Molecular basis for the preferential cleft  recognition by dromedary heavy-chain antibodies.Proc Natl  Acad Sci USA,2006,103(12):4586-4591)。另外，它还具有易表达， 水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织穿透性好等优点，使得该抗 体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广 阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种针对PRRS病毒非结构蛋 白Nsp9并可以抑制PRRS病毒增殖的纳米抗体，同时提供该纳米抗体 的编码序和一种真核表达载体。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种针对PRRS病毒Nsp9的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR 和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ  ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示 的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的 CDR氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1，SEQ ID NO:6所示的CDR2， SEQ ID NO:7所示的CDR3。

所述的VHH链具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体，所述的纳 米抗体来源于双峰驼重链抗体可变区片段，可以特异性结合PRRS病 毒非结构蛋白Nsp9，具有权利要求1和2所述的Nsp9纳米抗体的VHH 链。

一种DNA序列，所述DNA序列编码所述的Nsp9纳米抗体的VHH 链，或所述的纳米抗体。

所述的DNA序列具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

一种表达载体，它含有所述的DNA序列。

所述的表达载体可以在Marc-145细胞中表达纳米抗体-eGFP融 合蛋白,并可以抑制PRRS病毒在Marc-145细胞中的增殖。

所述的表达载体，具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

所述的纳米抗体在制备用于治疗和防治PRRS药物中的应用。

所述的DNA序列在开发抗PRRS转基因猪中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明通过噬菌体展示技术筛选到了抗PRRS病毒非结构蛋白 Nsp9特异性纳米抗体。此纳米抗体可以特异性结合Nsp9，利用该纳 米抗体的DNA序列构建真核表达载体，将其导入Marc-145细胞，纳 米抗体-eGFP以融合蛋白的形式在细胞中表达，并且具有抑制PRRS 病毒增殖的功能。该纳米抗体可以开发为治疗PRRS的药物，其基因 序列可用于抗PRRS转基因猪的研制。

附图说明

图1是VHH基因电泳图；其中泳道1和2是PCR扩增重链抗体可变 区基因片段，泳道M是DNA分子标准。

图2是ELISA实验鉴定Nsp9纳米抗体结果。

图3是检测Marc-145细胞中表达的Nanobody-eGFP融合蛋白的 Western Blot图。泳道1是Marc-145细胞，泳道2是转染了 Nanobody-eGFP融合蛋白真核表达载体的Marc-145细胞。图4不同 PRRSV毒株接种细胞48小时后培养上清中子代病毒滴度(TCID₅₀)。

具体实施方式

本发明首先将Nsp9重组蛋白免疫一只阿拉善双峰驼，经过5次免 疫之后分离该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了Nsp9特异的单域重链 抗体文库。将可溶性Nsp9重组蛋白包被在酶标板上，利用噬菌体展示 技术筛选特异性结合Nsp9的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展 示基因库)，获得了Nsp9特异性纳米抗体。构建纳米抗体真核表达载 体，将其导入Marc-145细胞，胞质内表达的Nsp9纳米抗体可以高效地 抑制PRRS病毒在Marc-145细胞中的增殖。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对于PRRS病毒非结构蛋白Nsp9的纳米抗体文库的构 建：

(1)将5ml Nsp9重组蛋白(1mg/ml)与弗氏佐剂等体积混合并乳化 均匀，免疫一只阿拉善双峰驼，每两周1次，共免疫5次，除第一次使 用弗氏完全佐剂，剩余几次全部使用弗式不全佐剂。(2)4次免疫结 束后，提取骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA，参照QIAGEN RNA提取 试剂盒说明书操作。(3)按照InvitrogenIII第一链 合成系统试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA并利用套式PCR 扩增VHH链，第一轮PCR：

上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

扩增重链抗体信号肽和抗体CH2之间的片段,55℃退火,28个循环；回 收700bp附近目的条带。

第二轮PCR：

以第一轮PCR回收产物作模板，

上游引物：CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGR

下游引物：CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT

扩增重链抗体可变区(VHH)基因,55℃退火,18个循环,回收目的 片段，结果如图1显示，目的条带～500bp。(4)使用限制性的内切 酶(购自NEB)PstI及NotI酶切20μg pCANTAB 5E噬菌体展示载体， 及7μg VHH，并用T4DNA连接酶(NEB)连接两个片段。(5)将连接 产物电转化至电转感受态细胞TG1中，活化后涂布于LB-AMP琼脂平板， 37℃过夜培养，收集菌苔-80℃保存。与此同时，通过菌落PCR检测 所建文库的阳性率，并测定库容大小及多样性，检测结果阳性率为98％， 显示菌落PCR结果，库容大小为4x10⁸具有较好的多样性。(6)取50 μl-80℃保存的甘油菌，接种于100ml LB-AMP培养基，待细菌生长 至对数期，用20MOI M13KO7辅助噬菌体感染TG1细胞，过夜培养后纯 化噬菌体，得到骆驼纳米抗体噬菌展示基因库。

实施例2：针对Nsp9的纳米抗体筛选过程：

(1)将溶解在0.01摩尔pH7.4PBS中的Nsp9重组蛋白(10μg/孔) 包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照。(2)第二 天加入200微升2.5％脱脂奶粉，室温封闭2小时。(3)2小时后，每 孔加入100μl噬菌体(1x10¹¹pfu骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在 室温下作用1小时。(4)用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗15遍， 洗去不结合的噬菌体。(5)用三乙基胺(100mM)洗脱与Nsp9特异性 结合的噬菌体，将噬菌体感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生 并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。经过3轮筛选，富集阳性克隆。

实施例3：用酶联免疫方法(ELISA)鉴定单个阳性克隆：

(1)经过3轮筛选后，将感染噬菌体的TG1细胞按一定稀释比例涂布 于LB-AMP琼脂平板，随机挑取96个单克隆接种于TB-AMP培养基中生长 至对数期后，加入终浓度1mM的IPTG，37℃培养过夜。(2)收集菌体， -20℃冻融一次，上清中应含有纳米抗体片段。(3)取100μl上清加 入包被Nsp9的ELISA板孔中，同时分别取100μl上清加入对照蛋白 Nsp4包被的和未包被的ELISA板孔中，室温放置1小时。(4)用PBST 洗5次，加入Rabbit anti-E tag antibody(兔源多克隆抗体，购自 南京金斯瑞公司)，室温放置1小时。(5)用PBST洗5次，加入HRP G anti  Rabbit antibody(山羊抗兔辣根过氧化物标记抗体，购自Jackson 公司)，在室温下放置1小时。(6)用PBST洗5次，加入TMB显色底物， 在405nm波长，读取吸收值。(7)当样品孔OD值大于对照孔OD值3 倍以上时，判为阳性克隆孔。(8)对阳性克隆经行测序分析，最终得 到抗Nsp9特异性纳米抗体，ELISA结果如图2所示，氨基酸序列为SEQ  ID NO:9所示。

实施例4：Nsp9特异性纳米抗体在Marc-145细胞中的表达

(1)通过overlap PCR将纳米抗体基因与增强型绿色荧光蛋白(eGFP) 基因通过GS-linker融合，并在上下游分别引入NheI和NotI酶切位 点。(2)使用限制性内切酶NheI和NotI双酶切PCR产物和pEGFP– N1质粒,并用T4DNA连接酶连接两个片段，得到pEGFP–GS-Nb真核 表达载体。(3)将pEGFP–GS-Nb转染Marc-145细胞，参照罗氏 X-tremeGENE-HP-DNA转染试剂说明书操作，转染48h后换用G418新 霉素选择性培养基加压筛选转染的细胞，在荧光显微镜下观察细胞中 绿色荧光的表达情况。(4)Wessern-blot进一步验证纳米抗体-eGFP 融合蛋白的表达，结果如图3显示，在40kDa附近出现特异性的目的 条带，说明融合蛋白表达。

实施例5：病毒感染实验

将Marc-145细胞和上述表达纳米抗体-eGFP融合蛋白的 Marc-145细胞铺在24孔细胞培养板，至细胞达到80％饱和，接种 0.1MOI的不同的PRRSV毒株(SD-16、JX-A1、Li-10、VR2332)。感 染48h后收集细胞上清，检测病毒滴度(TCID50)，结果如图4显示， 表达纳米抗体-eGFP融合蛋白的Marc-145细胞子代病毒滴度显著低 于Marc-145细胞。