猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp8多克隆抗体的制备和nsp8与nsp9蛋白的互作分析

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是危害全球养猪产业的病毒性疾病。其病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是正链RNA病毒，基因组含有9个开放阅读框（ORFs）。其中ORF1a和ORF1b 可编码多蛋白pp1a和pp1ab，pp1a和pp1ab通过蛋白酶的加工可产生至少14个非结构蛋白（nsps）。通过查阅对非结构蛋白研究相关文献中发现，人们对nsp8蛋白的结构和功能的研究非常少，本文对nsp8蛋白进行了初步研究。 首先我们利用网络数据库对nsp8蛋白序列进行分析，搜索和nsp8蛋白结构和功能相关的数据。然后我们构建了nsp8原核表达系统，获得了nsp8蛋白，利用纯化的蛋白免疫家兔，制备nsp8多克隆抗体，并检测了抗体的抗原结合特异性和效价。最后通过酵母双杂筛选，我们发现nsp8蛋白与nsp9蛋白可能存在互作，为了验证nsp8与nsp9蛋白间的互作关系，我们利用双分子荧光互补和Pull-down技术对nsp8蛋白与nsp9蛋白互作进行了进一步分析。 通过本论文的研究，我们制备了nsp8蛋白的多克隆抗体，发现制备的抗血清具有明显的nsp8结合能力，但Western blot等结果显示血清中也存在一些非特异性的抗体。在nsp8与nsp9蛋白的互作分析中，酵母双杂和BiFC试验结果表明nsp8蛋白和nsp9蛋白存在相互作用。同时，本研究中我们发现细菌细胞表达的nsp8蛋白不稳定，极容易被降解。利用真核表达系统能否表达稳定的nsp8，以及nsp8和nsp9蛋白互作对病毒复制的影响等问题，还有待进一步研究。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 PRRSV简介

1.2 PRRSV的结构

1.3 PRRSV致病机制

1.4 PRRSV基因组

1.5 PRRSV非结构蛋白和功能

1.6 PRRSV结构蛋白及其功能

1.7本研究的目的及意义

第二章 nsp8蛋白序列分析

2.2 nsp8蛋白疏水性分析

2.3 nsp8蛋白跨膜区预测

2.4 nsp8蛋白亚细胞定位预测

2.5 nsp8蛋白卷曲螺旋域预测

2.6 nsp8蛋白保守结构域以及功能预测

2.7 动脉炎病毒nsp8序列比对和亲缘关系分析

2.8 信息学分析结果小结

第三章 PRSSV nsp8基因的克隆表达与多克隆抗体的制备

3.1 材料与试剂

3.2 试验方法与步骤

3.3结果分析

3.4讨论

第四章 利用酵母双杂交检测nsp8蛋白与nsp9蛋白互作关系

4.1材料与试剂

4.2 实验方法和步骤

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章 Pull-down验证nsp8与nsp9的蛋白互作

5.1材料与试剂

5.2 实验方法与步骤

5.3 分析结果

5.4 讨论

第六章 双分子荧光互补技术验证nsp8蛋白与nsp9蛋白的互作

6.1材料与试剂

6.2 实验方法与步骤

6.3结果及分析

第七章 讨论与展望

参考文献

附录

附录Ⅰ本论文构建质粒的图谱及所用引物

附录Ⅱ主要溶液配方

附录Ⅲ试验所用主要仪器与试剂

附录Ⅳnsp8蛋白氨基酸的亲疏水性打分

致谢

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