猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白9与宿主细胞pRb相互作用有利于病毒复制

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种严重危害世界养猪业的病毒性传染病,其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV).PRRSV的非结构蛋白(Nsp)在病毒复制、免疫抑制等致病中的生物学功能及其与宿主细胞蛋白的相互作用成为近年来的研究热点.本研究分析了PRRSVNsp9和宿主细胞视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的相互作用及其分子机制,揭示了其相互作用在PRRSV复制调控中的作用.对17株基因2型PRRSV代表性毒株的Nsp9氨基酸序列进行了比对分析.结果表明,这些毒株的Nsp9均存在有pRb结合基序LXCXE( LACAE).用RT-PCR扩增出大小为1914 bp并含有LXCXE结合基序的截短的pRb基因片段,构建出其真核表达质粒(pCMV-Myc-pRb-tru);同时,构建出表达Nsp9的真核表达质粒pCMV-HA-Nsp9和LACAE基序突变的Nsp9真核表达质粒[pCMV-HA-Nsp9 L415A/C417A)、pCMV-HA-Nsp9 (E419K)].将pCMV-Myc-pRb-tru分别与pCMV-HA-Nsp9、pCMV-HA-Nsp9 (L415A/C417A)、pCMV-HA-Nsp9(E419K)共转染HEK 293T细胞,利用免疫沉淀技术证实Nsp9可通过LACAE基序与pRb相互作用.用pCMV-Myc-pRb-tru和pCMV-HA-Nsp9共转染MARC-145细胞,以及用PRRSV感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAMs),进行激光共聚焦显微镜分析.结果显示,过表达的Nsp9和pRb-tru能够在转染的MARC-145细胞胞质中共定位;在PRRSV感染的细胞MARC-145细胞和PAMs中,Nsp9能够和内源性的pRb共定位于细胞质.利用表达pRb的慢病毒或pRb siRNA,转导或转染MARC-145细胞,分析了pRb过表达和干扰对PRRSV增殖的影响.结果表明,pRb过表达能够抑制PRRSV复制,与对照组相比,病毒滴度显著降低(p<0.001);pRb干扰有利于PRRSV复制,病毒滴度显著高于对照组(p<0.001或p<0.01).由此说明,宿主细胞蛋白pRb对PRRSV的增殖具有抑制效应.经westem blotting分析表明,PRRSV感染能够下调宿主细胞pRb水平;降解试验和泛素化分析表明,PRRSV Nsp9能够促进宿主细胞蛋白pRb的泛素化降解.由此说明,基因2型PRRSV Nsp9可通过泛素蛋白酶体途径下调宿主细胞蛋白pRb水平,拮抗pRb对PRRSV复制的抑制作用,从而利于病毒增殖.