一种金枪鱼鱼骨胶原蛋白源锌螯合胶原肽及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种金枪鱼鱼骨胶原蛋白的锌螯合胶原肽的制备方法，具体讲是以金枪鱼鱼骨为原料，采用酸法提取胶原蛋白，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对胶原蛋白进行酶解，采用超滤、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到锌螯合胶原肽Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly（GKTGWPG），ESI/MS检测分子量为701.73Da。锌螯合胶原肽由于其独特的螯合和转运机制，吸收利用度高，又可同时补充多肽/氨基酸和锌，是一种理想的补锌物质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种金枪鱼鱼骨胶原蛋白源锌螯合胶原肽及其制备方法和用途，属于水产品精深加工技术领域。

背景技术

胶原肽以其在医药、保健品、食品和化妆品等应用上的独特功效被越来越多的消费者所青睐，使其成为食品行业和保健品行业、日化行业所竞相关注的焦点。锌是人体必须的微量元素, 其缺乏可导致儿童生长发育不良、智力发育落后、免疫力降低等病症。传统的锌补充剂（如葡萄糖酸锌、柠檬酸锌）稳定性差，吸收利用率低，肠胃刺激大，不易长期服用。而锌与金属螯合肽形成的螯合盐，即可促进微量元素的吸收，同时又能满足机体对活性肽、氨基酸等的需求，得到了国内外学者的广泛关注。

金枪鱼是远洋渔业的重要鱼类，年捕获量超过600万吨。金枪鱼加工过程中，占总重量25%−30%鱼骨多数加工成鱼骨粉或者作为废弃物丢掉，浪费的宝贵的渔业资源。经检索，以金枪鱼鱼骨胶原蛋白制备锌螯合胶原肽未见报道。基于此，本发明根据锌螯合胶原肽和金枪鱼鱼骨的研究现状，提供一种具有金属锌螯合活性的胶原肽，并提供这种锌螯合胶原肽的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种源于金枪鱼鱼骨胶原蛋白的锌螯合胶原肽。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种源于金枪鱼鱼骨胶原蛋白的锌螯合胶原肽的制备方法。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种源于金枪鱼鱼骨胶原蛋白的锌螯合胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly（GKTGWPG），ESI/MS检测分子量为701.73 Da。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种源于金枪鱼鱼骨胶原蛋白的锌螯合胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）金枪鱼鱼骨的预处理：按照料液比1>

2）金枪鱼鱼骨胶原蛋白的制备：按照料液比1>

）金枪鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：按照料液比1g:15~20>5>4 U/g），于温度35~45℃下酶解3~4>

4）金枪鱼鱼骨锌螯合胶原肽的制备：将制备的胶原蛋白酶解产物采用3>

作为优选，所述步骤4）的凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

凝胶柱层析：将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合活性胶原肽Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly（GKTGWPG）。

再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Zorbax C18；流动相：30%乙腈；洗脱速度0.8~1.0 mL/min；紫外检测波长214 nm。

本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Zn螯合物的独特功效（可同时补充多肽/氨基酸和Zn），以金枪鱼鱼骨为原材料，通过对胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件控制，制备具有高Zn螯合活性的胶原肽。本发明即为补锌保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时也为金枪鱼鱼骨的高值化利用提供了一条新思路。

附图说明

图1是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析图。

图2是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的RP-HPLC分析图。

图3 是本发明的Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly（GKTGWPG）的质谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种源于金枪鱼鱼骨胶原蛋白的锌螯合胶原肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼鱼骨"胶原蛋白提取"酶解"酶解物"超滤"大孔树脂纯化"凝胶过滤层析"RP-HPLC制备"锌螯合胶原肽。

实施例：

1）金枪鱼鱼骨的预处理：按照料液比1>

2）金枪鱼鱼骨胶原蛋白的制备：按照料液比1>

）金枪鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：按照料液比1g:15>5>4 U/g），于温度37℃下酶解4>

4）金枪鱼鱼骨锌螯合胶原肽的制备：将制备的胶原蛋白酶解产物采用3>

①凝胶柱层析：将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物（F3）（图1）；

②RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Zorbax C18；流动相：30%乙腈；洗脱速度0.8 mL/min；紫外检测波长214 nm），根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合活性胶原肽（图2）。

③结构检测：Zn螯合胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly（GKTGWPG），ESI/MS检测分子量为701.73 Da（图3）。

Zn螯合胶原肽对锌离子的螯合作用采用EDTA 滴定法测定。取螯合物100 mg 于100 mL小烧杯中，加水50 mL，滴入HCl（6 mol/L）数滴。摇匀后在水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至l00 mL，从中吸取l0 mL于三角瓶，平行3 份，加入pH 10的NH₃-NH₄Cl缓冲液l0>2EDTA>

测定结果表明：纯化得到的Zn螯合胶原肽Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly（GKTGWPG）对锌离子的螯合能力为83.56 μg/mg，与胶原蛋白酶解产物（30.12 μg/mg）相比其对Zn的螯合能力有了较大提高。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江海洋学院

<120>一种金枪鱼鱼骨胶原蛋白源锌螯合胶原肽及其制备方法和用途

<130>zjou-wb-201507

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Gly Lys Thr Gly Trp Pro Gly

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