一种提高大肠杆菌聚唾液酸产量的专家控制系统

摘要

本发明公开了一种提高大肠杆菌聚唾液酸产量的专家控制系统，属于生物技术领域。本发明以一株产聚唾液酸的大肠杆菌CCTCC M208088为生产菌株，建立了一种基于溶解氧变化模式的甘油/山梨醇混合流加专家系统。系统根据在线检测得到的过程参数，实时调整发酵底物山梨醇和甘油的流加速率，将溶解氧控制在适当的水平，间接提高产物聚唾液酸的产量。发酵结束聚唾液酸产量达到6.1g/L。而采用山梨醇恒速流加或者甘油山梨醇恒定比例流加时，发酵稳定性较差(溶解氧浓度剧烈波动)，聚唾液酸产量只有4.8g/L和5.1g/L。因此，本发明可以显著提高聚唾液酸发酵过程的稳定性和产量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高大肠杆菌聚唾液酸产量的专家控制系统，属于生物技术领域。

背景技术

聚唾液酸(polysialic acid)是唾液酸以α-2,8酮苷键连接的线性同聚物，其分子结构如图 1所示，是一些哺乳动物细胞中糖蛋白的组成部分和少数几种细菌的胞外多糖组分。聚唾液 酸进行酸水解或酶水解后，分离纯化可得唾液酸和寡聚唾液酸，为制取唾液酸类药物提供工 业化基础。聚唾液酸具有优良的生物相容性和生物可降解性，可以作为一些药物的缓释剂， 也用于固定酶以用于医疗诊断，或对一些药物产品进行化学修饰。聚唾液酸可以用作治疗一 些疾病的疫苗而避免其它细胞组分如脂多糖或蛋白质引起的副作用。

现阶段报道的聚唾液酸生产菌株以大肠杆菌居多，固体培养时，聚唾液酸以荚膜的形式 附于细胞表面，液体培养时，聚唾液酸以粘液的形式释放到发酵液中。大肠杆菌是一种好氧 细菌，溶氧浓度对细胞生长和产物合成都有很大影响，发酵过程中供氧不足，会造成菌体裂 殖速度减小，比生长速率下降，并可导致厌氧代谢途径的启动，引起代谢流迁移，使有机酸 等副产物的合成通量增加，造成目标产物产量、产率的大幅下降。发酵中供氧过量对微生物 的生长也是有害的，过剩的氧会衍生出一系列超氧化物和羟基自由基，对菌体的细胞膜等产 生毒害作用。因此，将发酵液的溶氧浓度控制在一个较为适中的水平，对聚唾液酸的生产至 关重要。本发明采用专家系统控制溶氧的方式，基于菌体消耗山梨醇和甘油需氧水平不同的 事实，根据溶氧的高低，实时调整山梨醇和甘油的流加速率，改变发酵体系中山梨醇和甘油 的比率及总量，从而将溶氧水平稳定的控制在适宜的水平。

发明内容

本发明以溶氧浓度(DO)为反馈指标，控制山梨醇以及甘油流加，提供了一种提高大肠 杆菌聚唾液酸产量的专家控制系统，该方法能够将发酵液中溶解氧浓度稳定地控制在适宜的 水平，提高了发酵生产的稳定性，实现了唾液酸的高效表达。

本发明提供一种提高大肠杆菌聚唾液酸产量的专家控制方法，包括以下步骤：

(1)通过多批正常发酵批次，确定发酵过程最优化的溶解氧(DO)设定值，甘油和山梨醇 混合流加总速率F的最大值和最小值；即确定DOopt，F的最大值F_max和最小值F_min；

(2)按一定时间间隔获取发酵过程参数，包括DO(k)、甘油和山梨醇混合时的总碳源流加速 率F(k)及甘油流加速率F_Gly(k)；其中k代表当前时刻；

(3)根据以下规则调整甘油流加方向参数T₁，用于指示甘油流加可编程蠕动泵的转速调整方 向；

如果-DO_Limit<ΔDO<DO_Limit，那么T₁＝0；   规则(1)

如果ΔDO<-DO_Limit，那么T₁＝-1；   规则(2)

如果ΔDO>DO_Limit，那么T₁＝+1；v规则(3)

其中ΔDO＝DO(k)-DO_opt，DOopt表示DO的最优设定值，DO_Limit表示DO控制过 程中所允许出现的最大偏差；T₁取值0，-1，+1分别代表速度不变、减少、增加；

(4)按照下述的方程调整甘油流加速率：

F_Gly(k)＝F_Gly(k-1)(1+σT₁) 0≤F_Gly(k)≤F(k)   方程(1)

σ表示甘油流加速率调节的步长，甘油流加速率的初始值为F_Gly(0)；

(5)按照下述的方程调整山梨醇流加速率：

F_Sor(k)＝F(k)-F_gly(k)   方程(2)

(6)根据以下规则调整总碳源流加速率：

如果DO(k)>DOopt+DO_Limit且F_Gly(k)＝F(k)，那么F(k)＝F(k-1)+ΔF；   规则(4)

如果DO(k)<DOopt-DO_Limit且F_Gly(k)＝0，那么F(k)＝F(k-1)-ΔF；   规则(5)

除了以上两种情况外，F(k)＝F(k-1)；   规则(6)

其中，F_min≤F(k)≤F_max，ΔF代表总碳源流加速率F(k)在前一时刻流加速率F(k-1) 基础上的变化量，总碳源流加速率的初始值为F(0)且F(0)不等于0。

所述σ取值范围0.05-0.2。

所述ΔF取值范围0.2-1g/L/h。

所述步骤(1)，在本发明的一种实施方式中，发酵10～20hDOopt值为40％、20h到发 酵结束DOopt值为60％。

所述步骤(1)，在本发明的一种实施方式中，F_max与F_min分别为10g/L/h和0.5g/L/h。

所述步骤(2)，在本发明的一种实施方式中，是每1-30min获取一次发酵过程参数。

所述步骤(3)，在本发明的一种实施方式中，DO_Limit＝3。

所述步骤(4)，在本发明的一种实施方式中，σ＝0.05。

所述步骤(4)，在本发明的一种实施方式中，F_Gly(0)＝2g/L/h。

所述步骤(6)，在本发明的一种实施方式中，ΔF＝0.4。

所述步骤(6)，在本发明的一种实施方式中，F(0)＝5g/L/h。

所述规则(4)，是指当前测定得到的DO(k)>DOopt+DO_Limit且当前的F_Gly(k)＝F(k)，那么 对总碳源流加速率F进行调整，使F在上一次测定的数值F(k-1)上增加ΔF。

所述控制方法，在本发明的一种实施方式中，所述发酵是采用大肠杆菌CCTCC M208088 为生产菌株。

本发明的有益效果：

本发明以一株产聚唾液酸的大肠杆菌CCTCC M208088为生产菌株，建立了一种基于溶 解氧变化模式的甘油/山梨醇混合流加专家系统。该系统能够将发酵液中溶解氧浓度稳定地控 制在适宜的水平(前期40％，后期60％)，最终聚唾液酸产量达到6.1g/L。而采用山梨醇恒 速流加(流加速率12g/L/h)或者甘油山梨醇恒定比例流加(两种碳源的流加速率都为6g/L/h) 时，溶解氧浓度剧烈波动，最终聚唾液酸浓度分别为4.8g/L和5.1g/L。以上分析表明，通过 采用专家系统，发酵过程的稳定性有了明显改善，聚唾液酸的表达量相比其他控制方法有显 著提高。

附图说明

图1：聚唾液酸的分子结构；

具体实施方式

实施例1

一株产聚唾液酸的大肠杆菌CCTCC M208088为生产菌株，培养基组成如下：

斜面培养基(g/L)：NaCl 5，胰蛋白胨10，牛肉膏3.0，琼脂粉20，pH 7.2；

种子培养基(g/L)：NaCl 5，胰蛋白胨10，牛肉膏3.0，pH 7.2-7.4；

发酵培养基(g/L)：山梨醇7，氯化铵4.0，磷酸氢二钾2.5，MgSO₄0.9，胰蛋白胨1.5， pH 7.8。

发酵流加培养基(g/L)：甘油：600，山梨醇600。

7L发酵罐中添加发酵培养基体积为4L，接种量为4％(v/v)，整个发酵过程维持温度为 37℃，通气量1.5vvm，搅拌转速为700r/min，pH为7.2。

采用一种提高大肠杆菌聚唾液酸产量的专家控制系统，步骤如下：

(1)通过多批正常发酵批次，确定发酵10～20h DOopt值为40％、20h到发酵结束DOopt 值为60％。F_max与F_min分别为10g/L/h和0.5g/L/h；

(2)每1分钟获取发酵过程参数，包括DO(k)、甘油和山梨醇混合时的总碳源流加速率F(k) 及甘油流加速率F_Gly(k)；其中k代表当前时刻；

(3)根据规则1-3调整甘油流加方向参数T₁，用于指示甘油流加可编程蠕动泵的转速调整方 向(速度增加或减少)，其中DO_Limit＝3。

(4)按照方程1调整甘油流加速率，其中σ＝0.05，F_Gly(0)＝2g/L/h。

(5)按照下方程2调整山梨醇流加速率。

(6)根据规则4-6调整总碳源流加速率，其中ΔF＝0.4，F(0)＝5g/L/h。

发酵过程中，溶解氧浓度稳定控制在最优设定值(前期40％，后期60％)。36h发酵结 束，聚唾液酸产量达到6.1g/L。而采用山梨醇恒速流加(流加速率12g/L/h)或者甘油山梨 醇恒定比例流加(两种碳源的流加速率都为6g/L/h)时，发酵过程很不稳定(溶解氧浓度剧 烈波动)，发酵结束聚唾液酸浓度分别为4.8g/L和5.1g/L。以上分析表明：采用专家系统， 发酵过程的稳定性和聚唾液酸表达量都有显著提高。

实施例2

采用与实施例1相同的生产菌株、培养基、发酵参数，用本发明的专家控制系统对发酵 过程进行控制，其中：发酵10～20h DOopt值为40％、20h到发酵结束DOopt值为60％，F_max与F_min分别为10g/L/h和0.5g/L/h，DO_Limit＝3，σ＝0.12，F_Gly(0)＝1g/L/h，ΔF＝0.2g/L/h，F(0)＝2 g/L/h。

按每15min获取一次发酵过程参数，发酵结束后结果发现聚唾液酸产量达到5.92g/L， 且发酵过程稳定，相比采用山梨醇恒速流加(流加速率12g/L/h)或者甘油山梨醇恒定比例 流加(两种碳源的流加速率都为6g/L/h)的产量分别增加了23.3％、16.1％。

实施例3

采用与实施例1相同的生产菌株、培养基、发酵参数，用本发明的专家控制系统对发酵 过程进行控制，其中：发酵10～20h DOopt值为40％、20h到发酵结束DOopt值为60％，F_max与F_min分别为10g/L/h和0.5g/L/h，DO_Limit＝3，σ＝0.2，F_Gly(0)＝2.5g/L/h，ΔF＝1g/L/h，F(0)＝6 g/L/h。

按每30min获取一次发酵过程参数，发酵结束后结果发现聚唾液酸产量达到5.88g/L， 且发酵过程稳定，相比采用山梨醇恒速流加(流加速率12g/L/h)或者甘油山梨醇恒定比例 流加(两种碳源的流加速率都为6g/L/h)的产量分别增加了22.5％、15.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。