来自小麦的糖级分、分离方法以及发明的应用领域

摘要

描述了从发芽的且浸渍在水中的小麦种子提取的级分，该级分具有包括在3和30千道尔顿之间的分子量。

说明书

技术领域

本发明涉及天然提取物、特别是来自谷物的提取物的领域，并且涉及 用于它们的分离的方法。

背景技术

目前，蛋白质型(诸如例如生长因子)或甘氨酸型(诸如例如透明质酸、 未处理的淀粉或水解的淀粉及其级分、其它GAG、葡胺聚糖等等)的大分 子以及从各种植物(例如，芦荟(Aloe vera)、积雪草(Centellaasiatica)等等) 得到的化学上不确定的提取物(chemically undefined extract)的临床应用 和化妆品应用已变得普遍化，这些产品广泛地应用于例如包括表皮组织的 疾病(例如伤口或溃疡)中或者用于化妆品目的。

在EP 743 323(以相同申请人的名义)中，例如，描述了从淀粉得到的 糖级分。

在一些研究中，参见例如，D’Agostino等人的“A fraction purified from  Triticumvulgare has trophic effects on CaCO-2”[GASTROENTEROLOGY, ELSEVIER,PHILADELPHIA,vol.104,n°4,Suppl,1January 1993,pp.819] 和在Fiore等人的“Differential activities of Triticumvulgare extract and its  fractions in mouse fibroblasts”[ACTA THERAPEUTICA Vol.19,n°2,1993 pages 151–162]中，描述了获得的糖级分而未具体说明用于使植物发芽和 生长的方法，且其还含有肽级分、己糖和己糖胺。

这些提取物用作上皮再生阶段的刺激剂且由此的疤痕形成的刺激剂， 诸如皮肤刺激情况下的安抚剂，例如润肤剂，并且一般用于皮肤和粘膜的 所有非感染性紊乱。

还针对上面提到的类型的新化合物的分离进行研究，不仅用以扩宽产 物用于上面提到的目的的可用性，而且用以分离具有增强的活性的化合 物，而且用以在没有过高成本的情况下得到产物，诸如例如，生长因子和 上述的多种葡萄糖材料。

然而，正如已经述说的，上述的所有天然提取物(包括小麦提取物)皆 由不确定且增大的数量的各种类型的物质和/或大分子组成，它们的大多数 还未被鉴定；然而，把活性归因于任何经鉴定的成分并不总是可能的。

这也是用于得到植物材料和可以任选地从其纯化的级分的方法未以 标准化方式进行完全描述的原因。

相反，且出人意料地，作为本发明的主题以及被鉴定且化学表征的级 分，表现出总提取物的所有活性并由此代表负责提供总提取物的作用的要 素。

附图说明

图1表示通过分别分析参考空白(水)、根据本发明的级分(在图中被标 记为CP级分)和从中分离根据本发明的方法的第(d)段中所得到的级分的、 在图中被指定为TVE的级分而得到的色谱图。

发明内容

描述了从在水中浸渍的小麦的胚芽提取的级分，该级分具有3至30 千道尔顿范围内的分子量。

具体实施方式

本发明涉及从在水中浸渍的小麦的胚芽得到的提取物的级分，其具有 生长因子典型的许多生物学特征，只是它明显地是植物来源和动物来源， 并且具有多糖而非蛋白质的化学结构；所述完全非预期的特性使得该级分 对制备可用于治疗伤口和溃疡的药物和产品而言特别有益。

更具体而言，本发明涉及在如关于现有技术所述的上文所描述的一般 用于得到已经已知的类似提取物的条件下从发芽的小麦的种子得到的级 分，其具有3至30千道尔顿范围内的分子量。

应当牢记在心，根据本发明的级分不存在于未发芽的种子中，并且只 有或主要是该级分(即，在3-30千道尔顿范围内的级分)具有上述性能。

根据本发明，该方法提供根据已知方法从发芽的小麦得到的原始提取 物的制备和后续的活性级分的纯化。

上面提到的方法包括下列步骤：

a)使小麦种子在水中和/或在惰性的天然或人工生长支持物上在任何 光(优选在黑暗中)、湿度(优选在超过60％的湿度)、温度(优选在5-20℃) 条件下发芽，优选产出生长至高度为3-15cm的芽；

b)在85-125℃范围内的温度下加热得到的植物材料(任选地预防性地 压碎成小尺寸，并且添加水)，任选地添加水，以准备下一个步骤并且防止 微生物生长；

c)浸渍得到的材料，将其放在水中(优选在pH 2-4)并且任选地留置使 其在低温下浸渍(最高10℃)；

d)借助于过滤、压制或者借助于诸如提取器的其它等同系统清除固体 残渣，以得到可被灭菌的第一澄清溶液(理解为原始提取物)；

e)从上文提到的溶液纯化具有3,000至30,000道尔顿之间的分子量的 级分，从而得到具有提高的百分比含量的活性级分的第二溶液；

f)从上文提到的第二溶液分离特征为3,000至30,000范围内分子量的 纯化的活性级分。

若需要，则可以在步骤a)之前利用纯化水使种子润湿。

根据常规技术优选在高压灭菌器中进行步骤b)和步骤d)中提到的灭 菌。

步骤c)优选在2和4之间的pH下进行，优选持续1-72小时。

步骤c)和步骤d)中固体残渣的清除可以以卷制(curling)方法进行。 在这种情况下，将步骤d)中得到的溶液替代步骤c)中的水添加至根据步骤 b)的发芽的新幼苗，并且重复步骤c-d。这样可得到更高的产率。

具有低于3000的分子量的级分和高于30,000的分子量的级分的清除 (步骤e)可以通过本领域专家已知的常规方法进行，例如借助于凝胶过滤或 超滤。

照此类推，感兴趣的级分借助于上文提到的技术被分离。

迄今为止所提到的分子量意图指用于纯化作为本发明的主题的级分 的超滤膜：此类值涉及球状蛋白质且因此仅被视作指示自其分离的级分的 真实分子量：用以选择所讨论的级分的所有更多的理由(all the more reason  to select the fraction under discussion)，其是糖类型并且具有直链和支链结 构，因此恰恰不是球状。

在其最终形式中，作为本发明的主题的级分可以使用常规方法干燥或 冻干，或优选地以已知且预定的浓度留在水溶液中；任选地添加防腐剂和 /或被灭菌。

通过下列具体实施例将更清晰地说明上文一般描述的方法：

实施例

1.发芽

将5kg润湿的木纤维素分配至一系列合适的钢罐内；在其上，接下来 使预先用水润湿的2.4kg小麦种子分散；在空调室中允许该种子在黑暗中 发芽数天(4-10天)直至得到高度为5-15cm的幼苗。生长期间，通过添加 足量的水来每天润湿支持物。

该室的温度维持在5-20℃的范围内；且相对湿度为≥60％。

2.加热

将罐的内容物放在合适的、气密封的容器中，然后在1大气压(≈121℃) 下高压灭菌1小时。

3.浸渍和提取

然后，将材料转移至合适容量的钢容器内，并添加100l含有120ml 的10％v/v硫酸和60ml的10％v/v盐酸的纯化水。可以使浸渍进行1-72 小时。然后在300大气压的压力下提取水相，并且清除耗尽的固相。

使由此得到的液体(定义为“第一压制”)补充120ml 10％v/v硫酸和60 ml 10％v/v盐酸，并且与其它罐的另外的等同数量的内容物(the contents of  a further equivalent number of other tanks)混合。然后重复被描述为“第一压 制”的程序，由此得到“第二压制”。

再次重复相同的操作，由此得到“第三压制”和“第四压制”。

当将液相放置成与植物材料接触以进行提取时，使液相有力地混合并 且接下来在冷处(5-9℃)保持约24-72小时。

也可以使最终的液体在冷处(5-9℃)保持大约24至72小时。

4.过滤和灭菌

来自第四压制的液体通过常规方法来过滤；然后，在合适的容器中， 在1大气压下通过施加相当于1小时的周期来高压灭菌该液体。

5.超滤

使用具有3千道尔顿的截断值的滤筒的合适的超滤仪器，将上文得到 的液体超滤至该仪器所允许的最大值；将水添加至剩余的液体，并重复超 滤2-3次以弃掉洗脱相中所含有的较低分子量。

然后，使用相同的方法但是用具有30千道尔顿的截断值的其它滤筒 取代该滤筒，进一步超滤含有大于3,000道尔顿的分子量的残渣：然而， 在这种情况下剩余的残渣代表大于30,000千道尔顿的分子量并且被弃掉， 同时洗脱相含有具有3,000至30,000道尔顿范围内的分子量的活性级分。

然后，照原样或在合适的支持物上冻干(或干燥)含有活性级分的溶液； 或者使其灭菌(照原样，添加防腐剂，例如2％w/w苯氧乙醇)。

A.关于活性级分的化学数据

1.该级分的色谱分析

选择连接有PAD检测器(脉冲安培检测器)的、尤其是标明用于碳水化 合物分析的HPAE(高压阴离子交换)色谱系统。

色谱系统具有下列特征：

-具备具有二元梯度的线性洗脱的泵的系统

洗脱液1：0.5M NaOH

洗脱液2：0.5M NaOH中1M醋酸钠

梯度通过下列线性程序来施加(恒流等于1.0ml/min)，其中％2表示关 于泵2的洗脱液相对于总混合物的百分比：

-色谱柱

维持在35℃的温度下，带有Carbopac PA1Guard前置柱(10-32)或等同 物的Carbopac PA1(4x250mm)

-配备有金电极的PAD检测器，在下列操作条件下：

*标准溶液的制备

基于纯活性级分的浓缩液来制备一系列具有在100ml去离子水中4至 12mg范围内的浓度的活性级分溶液，被理解为参考标准；或者可选择地 使用针对参考标准校准的工作标准。

*程序

注射100μl作为空白样，验证相关色谱图是平坦的，除了由洗脱液体 系的梯度的跳跃而产生的一些峰之外。

然后，注射每种测试溶液100μl。

纯化的活性级分的样品的色谱图在Rt≈44分钟时具有单峰，精确地 对应于活性级分(参见图1，标记为“CP级分”的样品)。

纯化的或部分纯化的提取物的样品的色谱图示出具有一系列峰的特 征历程(characteristic course)，其中Rt≈44分钟时的峰是有关活性级分的 峰。

2.水解后级分的色谱分析

进行该对照检查以验证构成测试级分的低聚糖结构的个体单糖的性 质。

对水解样品使用HPA(高性能和离子交换)色谱法。

仪器的类型相当于用于检查完整的即未水解的级分的上述仪器的类 型。

程序

对5-75mg/100ml范围内的活性级分浓度的样品，通过将0.35％(v/v) HCl添加至该级分并且在100°下水解20小时来进行水解。

以下是HPA分析条件：

Carbopack PA1,4x 250mm柱

等度洗脱液0.017N NaOH

恒流1ml/min

PED检测

注射体积：用水稀释1至100倍的、75μl的水解样品的溶液。

使用更常见的单糖作为标准进行等效分析。

证实被研究的样品具有大量且主要存在的葡萄糖，其中其它峰(有关其 它单糖或类似物：甘露糖、半乳糖、葡糖胺、戊糖等等)不存在或仅以痕量 存在。

在水解之前所进行的相同分析类似地得出不存在任何单糖，证明了该 级分由低聚糖结构组成。

B.级分的生物活性

根据本发明的级分已被证实具备相似于动物来源的生长因子的对任 何类型的伤口和/或溃疡的体内明确的上皮再生和治疗活性，因此，它可以 在用于治疗伤口和溃疡的药物产品生产中使用。

它还示出对成纤维细胞的细胞生长和ODC活性的体外大量活化。

还已证明了生长因子典型的、肌醇磷脂水解机理的活化。

治疗活性遵循各种药理研究而示出。

1.测试成纤维细胞的细胞生长的刺激

成纤维细胞是在组织修复的机理中起基本作用的细胞。因此，进行该 测试以证实产物的治疗效果是否作为这些有机体的细胞生长刺激的机理 的结果而被观察到。

程序

将3T3小鼠成纤维细胞的培养物保持在补充有10％v/v小牛血清(CS)、 青霉素(10U/ml)的DMV培养基中。使这些培养物在含有5％CO₂的潮湿 气氛中于37℃下在25-ml Falcon瓶中培养并且每隔4-6天继代培养。因此， 用3ml PBS洗涤铺满培养物(confluent culture)并且在37℃下用0.25％ 胰蛋白酶使铺满培养物胰蛋白酶化。为了灭活胰蛋白酶，添加2ml DME 并且用新鲜的培养基稀释离心后所得到的细胞团块直至达到适于散播的 密度。

对在含有低浓度的CS的培养基中被留在静止状态的成纤维细胞测试 上颚(palate)的刺激效果。使细胞在补充有5％CS的DME中以大约 2000-4000细胞/板的密度进行播种。18小时之后更新培养基并且用含有 0.6％CS的新鲜培养基替换，并且使细胞在每次连续活性测试之前被留置 生长另外的48小时。对所讨论的测试而言，贯穿生长阶段以2％和20％v/v 之间的递增浓度每日添加产物(以20mg/100ml的浓度在水中稀释)。

在第五天结束时，细胞的数量通过使培养物胰蛋白酶化来刺激并在库 尔特计数器中计数细胞。

结果

添加所指示的稀释度的产物产生了细胞生长的显著的、剂量依赖的刺 激。该效果在5％的产物(如上所指示的稀释)的百分比时开始明显，并且在 10％和20％之间最大、以略低于由同等浓度的CS表现出的量，但是在最 大点时是对照的量的至少四倍大。

2.测试ODC(鸟氨酸脱羧酶)活化

鸟氨酸脱羧酶在亚精胺-多胺的合成、鸟氨酸氨基酸转化至腐胺的催化 中是关键酶。这些多胺共同参与控制细胞增殖的过程。该测试通过证实刺 激产生的成纤维细胞生长的作用是否与ODC活性的增长有关来进行。

程序

ODC的活性在含有0.6％CS(小牛血清)的培养基中生长的3T3细胞中 来测试并且如上文在成纤维细胞生长的刺激测试中所描述的来准备。

ODC活性在以1％至10％v/v的递增量添加产物(以20mg/100ml的浓 度在水中稀释)之后6小时、使用Russell[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60 1420 (1968)]所描述的方法测量。

结果

以测试的浓度和在测试的条件下，产物在添加之后6h且剂量依赖地 示出对ODC的比对照的刺激大大约4倍的显著的刺激、且与同等浓度的 CS的刺激相似。

3.测试肌醇磷脂水解的刺激

据广泛记载，物质能够活化负责活化且负责细胞增殖的过程的主要的 生化机理之一在于膜肌醇磷脂的水解的特异性刺激，其转而产生第二信使 肌醇三磷酸酯(InsP3)和二酰基甘油的增加。该机理与尤其是信号传导的另 一个系统、负责例如EGF(表皮生长因子)、胰岛素和胰岛素样因子的作用 的酪氨酸激酶的活化密切相关。

因此，经考虑有利的是，评估产物对3T3细胞中磷酸肌醇酯的累积(作 为磷酸肌醇水解的特定指数)的效果，不仅在基线条件下而且在用CS血清 刺激之后，已知CS血清是成纤维细胞中磷脂代谢的活化物。

程序

肌醇磷脂的水解在含有0.6％CS(小牛血清)的培养基中生长的3T3细 胞中来测试并且如上文在成纤维细胞生长的刺激测试中所描述的来准备。

达到静止状态后，用Ham F-10培养基(具有低浓度的肌醇)洗涤细胞， 并且在添加0.6％CS和0.6μmol的2-[3H]肌醇的情况下于37℃下培养细胞 持续24小时，以标记膜肌醇磷脂。在该培养结束时，用含有10mmol LiCl 和0.1％BSA的克-亨氏(Krebs-Henseleit)缓冲液洗涤细胞。然后，在具有和 不具有10％CS的情况下以从0％(v/v)至20％(v/v)的递增量的产物(在以 4mg/100ml浓度的水溶液中)培养细胞持续24小时。

然后，使用下列技术测量出磷酸肌醇酯：抽吸掉培养基，并且用氯仿 /甲醇/水1/1/1(v/v)萃取细胞，离心后，取出水相并将其装载至1ml的甲酸 盐形式的Dowex-1柱上，用24ml水洗涤该柱以清除未被结合的标记的肌 醇；然后磷酸肌醇酯通过用0.2M甲酸铵和0.1M甲酸洗涤来洗脱。然后 通过闪烁光谱法来确定放射性。

结果

以测试的浓度和在测试的条件下，产物示出肌醇磷脂的水解的显著的 且剂量依赖的刺激、比对照的刺激大近似4倍、且与等同CS浓度(CS  concentration equivalent)的刺激相似。应注意，产物和CS的同时存在相 比单独存在CS(和单独存在产物)导致更大的活化，暗指在两种成分之间存 在有利的协同效应。

4.对实验伤口测试体内愈合

通过局部施用对动物所进行的体内愈合的测试证明了产物在治疗伤 口中的功效。

程序

对称重在220至250g范围内的Wistar系雄性大鼠进行测试。在测试 之前的一周，使动物保持在温度、湿度和光的可控情况下，自由获取食物 和水。将动物细分成各自包含10个动物的同类实验组；一组用作对照且 用安慰剂治疗，另一组用产物治疗。

在测试的第一天的早晨，对所有动物进行外科手术程序以产生按下列 方式得到的标准伤口：轻度麻醉(剂量为10ml/kg的10％氨基甲酸乙酯)后， 准确地剃除每个动物靠近腰部的入口(the door so lumbar region)的毛，在 经消毒之后，围绕2.5cm直径的、局部治疗的情况下为8.5cm直径的金属 圆盘的边缘切割皮肤，然后，使用弯钳清除该皮肤和皮下组织。在所有动 物中得到大体上相同的伤口。

在处理的每一天之后，适当地覆盖伤口，并且保持动物在独立的笼子 里。

每天用测面器(在透明纸片上追踪伤口)测量伤口的程度持续9天(局部 治疗的情况下5天)。

使用局部施用的日常治疗

对照组的动物的伤口用浸渍有由生理溶液(0.9％NaCl)组成的安慰剂 的无菌纱布来治疗。

其它组中的动物的伤口用浸渍有以20mg/100ml的浓度溶解于水中的 产物的无菌纱布来治疗。

结果

在用产物治疗的动物中，观察到了修复过程的加速，与对照组相比在 治疗结束时表现出伤口区域中平均约20-30％的显著减小。

药品和/或化妆品的制备

作为本发明的主题的活性级分可以用于制备具有药物活性或化妆品 活性的产品。

剂量可以根据待治疗的组织的病理学和类型、延伸的程度、患者参数 (年龄、性别、体重)、药物或化妆品组合物的类型而变化。活性级分剂量 也可以作为所使用的级分的纯化程度的函数而变化。

作为本发明的主题的级分可以以含有有效量的所述级分与对本领域 技术人员而言已知的赋形剂和常规载体混合的组合物形式被施用。

本发明的组合物可以使用已知方法和常规技术来制备。

其它活性成分可以存在于最终制备物中。

药物和化妆品组合物的示例有小瓶、洗液、乳膏、软膏、凝胶、溶液、 药物、栓剂、胚珠剂(ovules)、皂、泡沫、片剂、粉末、乳状物。